本發(fā)明涉及一種實現(xiàn)單個分子顯微成像的系統(tǒng)，通過提取出光熱差分信號來實現(xiàn)對單顆粒的成像。

背景技術：

從單細胞和單分子水平上原位地了解物質之間的相互作用以及生命的過程已經成為當今生命科學領域的研究熱點。目前國際上通用的單分子光學成像技術有全場相襯顯微術、近場光學掃描顯微術、共焦熒光顯微術和全內反射熒光顯微術。這些技術在分子生物學、分子化學及納米材料等領域受到廣泛關注。其中全內反射熒光顯微術是利用全內反射產生的倏逝波來激發(fā)樣品，由于倏逝波的強度成指數(shù)衰減，使樣品表面數(shù)百納米厚薄層內的熒光團受到激發(fā)，從而使熒光成像的信噪比和對比度得到大大提高。它是當今世界上研究單分子科學領域中最靈敏的成像和檢測技術之一，可以用來直接探測單個熒光分子。因此，已被生物物理學家們廣泛應用于單分子的熒光成像中。

但利用全內反射熒光顯微術實現(xiàn)單分子熒光成像也有其自身的缺點。我們都知道，熒光成像的質量很大程度上依賴于熒光信號強度，提高激發(fā)光強度固然可以提高信號強度，但激發(fā)光的強度不是可以無限提高的，當激發(fā)光的強度超過一定限度時，光吸收就趨于飽和，并不可逆地破壞激發(fā)態(tài)分子，就會出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象。在顯微術中，光漂白使得觀測變得很復雜，因為它會造成破壞，使熒光團無法繼續(xù)放光，以至于對實驗觀測造成影響。

光熱差分顯微成像技術是利用單粒子吸收過程中熱效應導致其周圍介質折射率的變化，使探測光被頻移的激光與未頻移的激光進行外差(類似于拍)，再利用微弱信號探測系統(tǒng)提取到粒子的吸收信息，從而實現(xiàn)對單個粒子的成像。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服了傳統(tǒng)熒光成像技術中光漂白的缺點，設計一套系統(tǒng)來實現(xiàn)對單個顆粒成像，其中所采用的技術是光熱差分顯微成像。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種光熱差分顯微成像裝置，參見圖1，包括用于光學成像的照明系統(tǒng)，用于提取金屬顆粒周圍熱吸收信息的泵浦-探測雙光束微弱信號探測系統(tǒng)，以及對樣品作二維掃描的平面掃描系統(tǒng)，其中：

所述照明系統(tǒng)包括第二激光器10、雙色鏡8、油浸物鏡16、空氣物鏡18、凸透鏡22和cmos傳感器23，第二激光器10發(fā)出的激光經衰減、擴束后進入雙色鏡8，再進入油浸物鏡16，油浸物鏡16將激光聚焦到樣品上，透射光通過空氣物鏡18收集起來，經凸透鏡22聚焦后在cmos傳感器23上成像；

所述泵浦-探測雙光束微弱信號探測系統(tǒng)包括第一激光器1、第二激光器10、聲光調制器3、信號發(fā)生器30、雙色鏡8、油浸物鏡16、空氣物鏡18、半透半反鏡20、高速光電探測器27和鎖相放大器29，第一激光器1發(fā)出加熱激光光束，經衰減后進入聲光調制器3，聲光調制器3在信號發(fā)生器30所給的調制頻率下對激光光強進行調制，調制后的激光經擴束后進入雙色鏡8，再進入油浸物鏡16，油浸物鏡16將激光聚焦到樣品上，樣品受到該激光加熱后向周圍介質熱輻射；而第二激光器10發(fā)出探測激光光束，其進入油浸物鏡16的光路與所述照明系統(tǒng)光路一致，區(qū)別在于探測激光光束被油浸物鏡16聚焦到樣品上后將出現(xiàn)頻移，頻移后的激光通過空氣物鏡18收集，在半透半反鏡20的分束作用下，一束激光用于cmos成像，另外一束激光聚焦到高速光電探測器27上，高速光電探測器27收集光強信號傳遞給鎖相放大器29，提取出振蕩頻率與聲光調制器3調諧頻率匹配的強度信號；

所述平面掃描系統(tǒng)包括位于油浸物鏡16和空氣物鏡17之間的超精細三維平移臺17，以及對超精細三維平移臺17進行控制的計算機控制器，樣品放置在超精細三維平移臺17上。

進一步的，上述照明系統(tǒng)還包括可調圓形衰減片11、激光擴束器14、半透半反鏡20、帶通濾波片21和若干反射鏡，第二激光器10發(fā)出的激光通過可調圓形衰減片11衰減后，經反射鏡12和13進入激光擴束器14，擴束后的激光依次經反射鏡15、雙色鏡8和凸透鏡9后進入油浸物鏡16，油浸物鏡16將激光聚焦到樣品上，透射光通過空氣物鏡18收集起來，然后經反射鏡19、半透半反鏡20和帶通濾波片21，最后由凸透鏡22聚焦后在cmos傳感器23上成像。

照明系統(tǒng)中的油浸物鏡16和空氣物鏡18的焦點必須重合，且樣品處在兩物鏡的焦平面上，cmos傳感器23處在的凸透鏡22一倍焦距處。由于樣品尺寸極小，超過了光學分辨率的極限，所以光學成像照明系統(tǒng)是方便尋找樣品標記物的位置。在本裝置中還可以添加一條科勒照明光路專門實現(xiàn)對樣品周圍標記物的光學成像。

上述泵浦-探測雙光束微弱信號探測系統(tǒng)的第一激光器1發(fā)出的激光經過可調圓形衰減片2衰減后進入聲光調制器3，聲光調制器3與信號發(fā)生器30相連，在信號發(fā)生器30所給的調制頻率下實現(xiàn)對激光光強的調制，調制后的激光經過光闌4和反射鏡5、6后進入激光擴束器7，擴束后的激光經過雙色鏡8和凸透鏡9進入油浸物鏡16，油浸物鏡16將激光聚焦到樣品上，樣品受到該激光加熱后向周圍介質熱輻射。

為了提取樣品粒子周圍的熱輻射信息，泵浦-探測雙光束微弱信號探測系統(tǒng)引入一束探測激光束，即由第二激光器10發(fā)出探測激光光束，其光路與照明系統(tǒng)的光路在半透半反鏡20分束之前是一致的，探測激光光束被油浸物鏡16聚焦到樣品后，由于樣品周圍介質折射率受熱發(fā)生變化，探測激光將會出現(xiàn)頻移，頻移后的激光通過空氣物鏡18收集，然后經反射鏡19后被半透半反鏡20分為兩束：一束激光經帶通濾波片21(濾掉加熱激光光束)后由凸透鏡22聚焦于cmos傳感器23上，另一束激光經反射鏡24和帶通濾波片25(濾掉加熱激光光束)后，由凸透鏡26聚焦到高速光電探測器27上。強度信號被高速光電探測器27收集后通過鎖相放大器29提取出振蕩頻率與聲光調制器3調諧頻率匹配的強度信號，最終實現(xiàn)微弱信號探測功能。

在泵浦-探測雙光束微弱信號探測系統(tǒng)中，雙色鏡8可以實現(xiàn)兩束激光在平面內合成一束激光，兩束激光光軸高度必須保持一致。帶通濾波片25的作用是濾掉加熱激光光束使高速光電探測器27只收樣品集頻移后的探測激光，兩臺激光器的波長是依據(jù)所測樣品來選擇的。

上述平面掃描系統(tǒng)由油浸物鏡16、普通物鏡18、超精細三維平移臺17和計算機28的控制器構成。利用油浸物鏡16將激光聚焦到樣品上，利用編寫好的電腦程序控制超精細三維平移臺17的掃描范圍、掃描速率和步進大小，實現(xiàn)平面掃描功能。

本發(fā)明的光熱差分顯微成像裝置中，光學成像照明系統(tǒng)主要用來尋找樣品標記物所在的位置，泵浦-探測雙光束微弱信號探測系統(tǒng)主要利用探測光束將樣品周圍的熱輻射微弱信號提取出來，平面掃描系統(tǒng)主要是實現(xiàn)對樣品的二維掃描，通過計算機處理將得到的鎖相放大器讀取的微弱熱信號作二維強度分布圖，最終即可實現(xiàn)對樣品的二維熱成像。

本發(fā)明實現(xiàn)單個粒子(特別是納米顆粒)成像的原理和實施方式是：被聲光調制器(aom)調諧的第一束激光對粒子進行加熱，熱傳遞導致粒子周圍溫度升高，周圍介質折射率隨溫度發(fā)生變化，且其折射率隨時間的變化率與加熱激光束光強隨時間的變化率，信號發(fā)生器所給信號頻率相一致。為了提取粒子周圍的熱輻射信息，我們引入另一束探測激光束。第二束激光被匯聚于同一位置，被介質散射。隨時間波動的折射率會導致散射光的頻移，使得第二束激光出現(xiàn)差頻信號。透過樣品臺的探測激光感受到的熱波動越大，被頻移的光強就越強，可以從頻移的光強中推出熱波動的相對幅值。被頻移的激光與未頻移的激光進行外差(類似于拍)，強度信號被高速光電探測器收集。經過鎖相放大器提取出振蕩頻率與聲光調制器調諧頻率匹配的強度信號，也就取出了被頻移的第二束激光光強。保持兩束激光的良好聚焦，將樣品臺移動，進行如30nm步進的二維掃描，即可獲得二維的熱量分布圖，實現(xiàn)對單個粒子的光熱差分顯微成像。

本發(fā)明的裝置中，為了使我們的成像達到單顆粒水平，樣品準備階段需要將所測納米顆粒旋涂在蓋玻片上，以保證顆粒之間的間隔大于1微米。同時選用折射率隨熱改變大的介質(如甘油等)，使其充分浸潤在納米顆粒的表面，并且利用隔片和蓋玻片使樣品密封起來。

本發(fā)明的裝置中，利用編寫的控制軟件，實現(xiàn)超精細三維平移臺與鎖相放大器聯(lián)用。通過設置平移臺步進與鎖相放大器讀取數(shù)據(jù)的時序，并設置平移臺步進大小，掃描范圍，實現(xiàn)對單個顆粒的光熱差分顯微成像。

本發(fā)明的裝置中，選用油浸物鏡的優(yōu)點是，其大的數(shù)值孔徑可以將激光光斑聚集的很小，有利于實驗的進行。另外，鎖相放大器和高速光電探測器的挑選應當由實驗中信號發(fā)生器所提供的信號頻率決定。

本發(fā)明的裝置中，兩個激光器波長的選擇是依據(jù)所測樣品來制定的，比如在具體實施方式中待測樣品是直徑20nm左右的金屬顆粒，由于此尺寸結構下金屬顆粒的共振吸收峰位在532nm附近，所以可采取第一束激光器的波長為532nm，能夠更有效的加熱樣品。第二束激光器所起作用是探測功能，所以選擇的是遠離金屬納米顆粒共振吸收峰的633nm激光器。

該發(fā)明技術克服了傳統(tǒng)熒光成像技術中光漂白的缺點，并能廣泛地運用于分子生物學和材料科學。

附圖說明

圖1為本發(fā)明光熱差分顯微成像裝置的示意圖。

圖1中：1、第一激光器，2和11、可調圓形衰減片，3、聲光調制器，4、光闌，5、6、12、13、15、19和24、反射鏡，7和14、激光擴束器，8、雙色鏡，10、第二激光器，16、油浸物鏡，17、超精細三維平移臺，18、空氣物鏡，20、半透半反鏡，21和25、帶通濾波片，9、22和26、凸透鏡，23、cmos傳感器，27、高速光電探測器，28、計算機，29、鎖相放大器，30、函數(shù)信號發(fā)生器。

圖2為對樣品實現(xiàn)平面掃描的二維平面掃描裝置結構示意圖。

圖3為對加熱激光光束進行光強調制的結構示意圖。

具體實施方式

下面結合附圖來解釋本發(fā)明內容及其應用。所述的實施方案是為了更好地說明本發(fā)明，而不能理解為是對本發(fā)明的權利要求的限制。

具體工作過程是：

圖1是光熱差分顯微成像裝置的示意圖，第一激光器1是波長為532nm的激光器，它發(fā)出的激光經過可調圓形衰減片2衰減后進入到聲光調制器3中，聲光調制器3在函數(shù)信號發(fā)生器30給出的信號頻率下實現(xiàn)對激光光強的調制，調制后的激光束依次經光闌4、反射鏡5和6后進入激光擴束器7，經過激光擴束器7的作用，光束會變寬，擴束后的激光再經過雙色鏡8和反射鏡9進入油浸物鏡16(60x)聚焦，即可對加載在三維平移臺17上的樣品進行加熱。加熱后的粒子會使其周圍介質的折射率隨溫度發(fā)生變化，且折射率隨時間的變化率與加熱激光束光強隨時間的變化率相一致。為了提取粒子周圍的熱輻射信息，我們引入另一束探測激光束。第二激光器10是波長為633nm的激光器，其發(fā)出的激光通過可調圓形衰減片11衰減后經反射鏡12、13進入激光擴束器14，然后再經過雙色鏡8和凸透鏡9后進入油浸物鏡16(60x)，同樣被油浸物鏡16聚焦，且其聚焦光斑與532nm的激光聚焦光斑嚴格重合?？諝馕镧R18(40x)用來接收從樣品表面散射出來的光束，散射光束由反射鏡19反射而經過半透半反鏡20后，一部分經帶通濾波片21和凸透鏡22進入cmos傳感器23，另一部分會經反射鏡24、帶通濾波片25和凸透鏡26進入高速光電探測器27。其中633nm帶通濾波片21和25的作用是濾掉起加熱作用的532nm激光光束。cmos傳感器23可以用來尋找樣品所在位置的標記物，而高速光電探測器27可以接收到633nm激光的外差信號。利用鎖相放大器29即可提取出與聲光調制器調諧頻率匹配的強度信號。保持兩束激光的良好聚焦，利用超精細三維平移臺17進行20nm步進的二維掃描，即可獲得二維的熱量分布圖，實現(xiàn)對單個顆粒的光熱差分顯微成像。

二維平面掃描裝置，如圖2所示。在進行二維掃描前，兩束激光必須嚴格共軸，且被油浸物鏡16(60x)聚焦在同一焦點處，樣品被加載在超精細三維平移臺17上。超精細三維平移臺17的控制器安裝在計算機28上，通過控制軟件即可控制平移臺17的步進、掃描方式和掃描范圍。

加熱激光光束光強的調節(jié)，如圖3所示。函數(shù)信號發(fā)生器30與聲光調制器3相連結，調節(jié)激光光束入射到聲光調制器3的入射角大小，當入射角的大小正好滿足布拉格衍射角時，激光通過聲光調制器3會產生單一的衍射，再利用小孔光闌4濾掉其零級衍射光，使+1級衍射光透過。即可實現(xiàn)通過信號發(fā)生器所給信號頻率大小調制激光光強。