一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明為一種基于模擬酶標(biāo)記銀納米粒子的高靈敏化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，通過構(gòu)建可拋式免疫傳感芯片，設(shè)計新型dna模擬酶標(biāo)記銀納米粒子探針，實現(xiàn)化學(xué)發(fā)光信號放大，用于蛋白質(zhì)的高靈敏高通量成像免疫分析。

二、

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)標(biāo)志物的檢測在心血管疾病的臨床診斷和監(jiān)測中發(fā)揮著重要作用。免疫分析因其對生物分子高特異識別能力，在蛋白質(zhì)標(biāo)志物的檢測中得到了廣泛應(yīng)用。作為最普及的免疫分析方法，酶聯(lián)免疫分析需要專業(yè)人員操作，儀器復(fù)雜，步驟繁冗，耗時昂貴，這些缺點大大限制了它的進一步應(yīng)用。

發(fā)展簡單易操作、成本低、高通量的免疫分析方法，是蛋白質(zhì)檢測一直以來所追求的目標(biāo)。在單個分析流程中同時或者類同時實現(xiàn)多個樣品的檢測，具有分析通量高、所需時間短、樣品消耗少等突出優(yōu)點，因此基于可拋式免疫傳感芯片的免疫分析方法近年來得到了越來越多的關(guān)注。然而，常見的蛋白質(zhì)陣列芯片多采用光刻技術(shù)、點陣技術(shù)或印刷技術(shù)制備而成，步驟非常復(fù)雜，而且需要配備相應(yīng)機器，非專業(yè)人士很難完成。

此外在實際應(yīng)用領(lǐng)域中，免疫分析對高靈敏方法的需求也與日俱增，為了實現(xiàn)對低豐度組分的準(zhǔn)確檢測，大多數(shù)免疫檢測方法都選擇將天然酶如辣根過氧化酶、堿性磷酸酶負(fù)載到納米粒子上實現(xiàn)信號放大，但天然酶常常因為微小的構(gòu)象變化就影響它們的催化活性從而導(dǎo)致變質(zhì)，而用于負(fù)載酶的納米粒子如金納米粒子、碳納米管、石墨烯等，無論合成或生物修飾都條件苛刻、價格昂貴。

三、

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：用最簡單的手工貼膜技術(shù)，構(gòu)建可拋式免疫傳感芯片，使非專業(yè)人士也能輕松開展高通量檢測，同時設(shè)計一種dna模擬酶標(biāo)記的銀納米粒子探針，進行化學(xué)發(fā)光信號放大，兩者結(jié)合，提出一種新型高通量高靈敏化學(xué)發(fā)光成像免疫分析方法。

本發(fā)明提出的高靈敏化學(xué)發(fā)光成像免疫分析方法如圖1所示，由可拋式免疫傳感芯片(1)、模擬酶標(biāo)記銀納米粒子探針(2)和信號產(chǎn)生體系(3)構(gòu)成，通過以下技術(shù)方案來制備：

1)可拋式多組分免疫傳感陣列是通過手工貼膜技術(shù)，在醛基基片上獲得4×12陣列，在每個傳感池內(nèi)包被一定量的捕捉抗體ab1，抗體的氨基與醛基陣列上的芳香醛基共價結(jié)合，反應(yīng)結(jié)束后沖洗，再滴加封閉液，封閉結(jié)束后沖洗，晾干，制得可捕捉目標(biāo)抗原的陣列芯片(圖2)；

2)模擬酶標(biāo)記銀納米粒子探針是在銀納米粒子表面同時修飾信號抗體ab2和高比例g-四鏈體dna而制成，后者結(jié)合血紅素形成模擬酶，如圖3所示；

3)信號產(chǎn)生體系是利用模擬酶的過氧化物酶特性催化化學(xué)發(fā)光底物過氧化氫氧化魯米諾的反應(yīng)，產(chǎn)生強化學(xué)發(fā)光信號。

免疫分析方法的工作原理：

1)在可拋式免疫傳感芯片的每個傳感池表面滴加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待檢測樣品，進行溫育；

2)沖洗后，在每個傳感池表面滴加模擬酶標(biāo)記銀納米粒子探針，反應(yīng)結(jié)束后沖洗；

3)在每個傳感池表面滴加化學(xué)發(fā)光底物，通過電感耦合裝置ccd相機進行化學(xué)發(fā)光成像檢測；

4)每個傳感池的化學(xué)發(fā)光信號與其所對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度成正相關(guān)，可據(jù)此獲得工作曲線，求出待檢測樣品中目標(biāo)蛋白質(zhì)(抗原)的濃度，實現(xiàn)多個樣品中蛋白質(zhì)的同時高靈敏成像免疫分析。

上述的分析方法，封閉液為含5％牛血清白蛋白(bsa)的0.01m磷酸鹽緩沖液，ph7.4；沖洗液為含0.05％吐溫-20的0.01m磷酸鹽緩沖液，ph7.4。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下特點：

本發(fā)明設(shè)計了模擬酶標(biāo)記的銀納米粒子探針進行化學(xué)發(fā)光信號放大，通過可拋式免疫傳感芯片，提出了一種高靈敏高通量化學(xué)發(fā)光成像免疫傳感方法。相對于現(xiàn)有檢測系統(tǒng)，具有以下特點：

(1)可拋式免疫傳感芯片是以醛基基片為基底，手工貼膜、化學(xué)包被獲得，制備簡單、快速，成本低廉。利用空間分辨模式，48個陣列傳感池可同時進行48個樣品的免疫分析，具有通量高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好的優(yōu)點。

(2)設(shè)計的納米探針以銀納米粒子為負(fù)載物，原材料易獲得、價廉，制備方法簡單、條件溫和，生物修飾過程易操作，保存穩(wěn)定性好。

(3)設(shè)計新穎的表面負(fù)載有大量模擬酶的納米探針，結(jié)合模擬酶對過氧化氫魯米諾反應(yīng)的催化作用，進行信號放大，提高檢測靈敏度，使其更適于低豐度蛋白質(zhì)的檢測。

(4)該分析方法無需外加光源，設(shè)備和操作都非常簡單。

四、附圖說明

圖1.高靈敏化學(xué)發(fā)光成像免疫分析示意圖

圖2.免疫傳感芯片的制備及夾心免疫反應(yīng)、信標(biāo)結(jié)合反應(yīng)及化學(xué)發(fā)光信號產(chǎn)生示意圖

圖3.模擬酶標(biāo)記的銀納米粒子探針的制備示意圖

五、具體實施方式

實施例1：結(jié)合附圖3，模擬酶標(biāo)記銀納米粒子探針的制備

合成6nm粒徑的銀納米粒子，將信號抗體ab2和g-四鏈體dna按照一定的比例，分別通過靜電吸附和銀-巰鍵負(fù)載到銀納米粒子上。具體合成細(xì)節(jié)如下：首先將3.5μl2mg/ml信號抗體ab2加入到1.0ml銀納米粒子溶液中(事先用0.4mnaoh調(diào)節(jié)ph至9.0)，室溫下輕輕攪拌，溫育30分鐘。隨后緩慢加入150μl100μmg-四鏈體dna，不斷攪拌，溫育16小時。再加入122μl磷酸鹽緩沖液繼續(xù)反應(yīng)6小時。接著緩慢加入21μl2mnacl溶液，3小時后重復(fù)該步驟。12小時后再加入26μl2mnacl溶液，同樣地，3小時后重復(fù)該步驟。繼續(xù)攪拌反應(yīng)48小時后，向溶液中加入1.0ml封閉液，攪拌反應(yīng)30分鐘，未修飾的dna通過離心除去(13000rpm，20分鐘，4℃)。棄去上清液，沉淀溶于1.0ml含有0.1mkcl的0.01m磷酸鹽緩沖液，加入過量血紅素，室溫攪拌反應(yīng)1小時以形成模擬酶。然后將過量的血紅素離心除去(13000rpm，20分鐘，4℃)，棄去上清液，得到的信號探針重新分散于1.0ml含有0.1mkcl的0.01m磷酸鹽溶液，使用前在4℃暗處保存。

實施例2：結(jié)合附圖2，免疫傳感芯片的制備及夾心免疫反應(yīng)、探針結(jié)合反應(yīng)及化學(xué)發(fā)光信號產(chǎn)生過程

在醛基基片上手工粘貼一層設(shè)計有48個凹槽的不感光貼膜，獲得4行×12列的陣列，在每個傳感池表面包被捕捉抗體ab1，使其在4℃100％濕度條件下吸附過夜，抗體的氨基與基片的芳香醛基共價結(jié)合，反應(yīng)結(jié)束后沖洗，晾干后在每個傳感器表面滴加封閉液，封閉2小時后用沖洗液沖洗，晾干后，制得可捕捉目標(biāo)抗原的陣列。

在傳感池表面滴加標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品進行溫育，標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品與傳感池中抗體反應(yīng)充分后，以沖洗液洗去樣品，并滴加實施例1所制備的模擬酶標(biāo)記的銀納米粒子探針，進行第二步溫育，待納米探針充分結(jié)合到傳感池后，洗去未結(jié)合的銀納米探針，最后在免疫傳感器表面滴加化學(xué)發(fā)光底物過氧化氫-魯米諾，模擬酶催化過氧化氫氧化魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。

實施例3：結(jié)合附圖2，以ctnt為例，說明該高靈敏化學(xué)發(fā)光成像免疫分析方法的應(yīng)用

(1)滴加8μl10μg/ml的ctnt捕捉抗體ab1在醛基陣列表面，抗體的氨基與基片的芳香醛基共價結(jié)合，反應(yīng)結(jié)束后沖洗，再在每個傳感點表面滴加封閉液，封閉結(jié)束后沖洗，晾干，制成可拋式免疫傳感芯片(圖2)；

(2)在制成的免疫傳感芯片的每個傳感池表面分別滴加8μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品，室溫溫育30分鐘，沖洗液沖洗，隨后滴加6μl實施例1所制備的模擬酶標(biāo)記的銀納米粒子探針，室溫溫育30分鐘后用沖洗液沖洗，晾干；

(3)在傳感池表面加入化學(xué)發(fā)光底物，以ccd相機進行多組分化學(xué)發(fā)光成像，動態(tài)積分方式曝光1分鐘，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的化學(xué)發(fā)光值得到ctnt工作曲線，檢測待測樣品中ctnt的濃度。