本發(fā)明涉及質(zhì)譜法，并且更確切地說，涉及用于通過包含以下操作的方法對蛋白質(zhì)或多肽的復(fù)雜混合物的質(zhì)譜分析的方法：使電離樣本經(jīng)受質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)以使電離蛋白質(zhì)和多肽與其它分子分離，且執(zhí)行所得反應(yīng)產(chǎn)物的數(shù)學(xué)解卷積分析以同時表征所述混合物中的多個蛋白質(zhì)和/或多肽。

背景技術(shù)：

活細(xì)胞和組織中的蛋白質(zhì)的研究(蛋白質(zhì)組研究)是臨床和基本科學(xué)研究的作用領(lǐng)域，因為細(xì)胞和組織中的代謝控制是在蛋白質(zhì)層級鍛煉的。舉例來說，健康的與患病的組織之間或者病原的與非病原的微生物菌株之間的蛋白質(zhì)水平表達的比較可加速新的藥物化合物或農(nóng)業(yè)產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)與開發(fā)。此外，患病的組織或從經(jīng)受處理的生物切離的組織中的蛋白質(zhì)表達模式的分析也可充當(dāng)疾病病況的診斷或處理策略的功效，以及提供關(guān)于個別患者的合適的處理模態(tài)與治療選擇的預(yù)測信息。再者，從微生物(例如，細(xì)菌)導(dǎo)出的樣本中的蛋白質(zhì)集合的識別可提供識別微生物的物質(zhì)和/或菌株以及關(guān)于細(xì)菌識別此些物質(zhì)或菌株的可能抗藥性性質(zhì)的手段。

蛋白質(zhì)組研究的一個重要方面是具有更改的表達含量的蛋白質(zhì)的識別。隨著時間或群體當(dāng)中的和代謝物水平的差異可與患病的狀態(tài)、藥物治療或代謝改變相關(guān)聯(lián)。經(jīng)識別的分子物質(zhì)可充當(dāng)所討論的疾病或病況的生物標(biāo)記，從而允許開發(fā)診斷和治療的新方法。常規(guī)地，由于從自然組織或細(xì)胞提取的任何樣本中一般存在的大量蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)必須首先通過凝膠或毛細(xì)電泳法或親和力技術(shù)而分離為個別組分，然而所述個別蛋白質(zhì)水平可以被評估且與數(shù)據(jù)庫進行比較或在樣本之間進行比較。

因為其可提供詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息，所以質(zhì)譜法(ms)當(dāng)前被認(rèn)為是用于生物化學(xué)混合物分析和蛋白質(zhì)識別的有價值的分析工具。蛋白質(zhì)分析的常規(guī)方法因此常常組合用于分離和定量的二維(2d)凝膠電泳與蛋白質(zhì)的質(zhì)譜識別。而且，毛細(xì)管液相層析以及各種其它“前端”分離技術(shù)已經(jīng)與用于大尺度蛋白質(zhì)識別的電噴射電離串連質(zhì)譜法組合而無需凝膠電泳。使用質(zhì)譜法，可識別質(zhì)譜之間的定性差異，且對應(yīng)于僅在譜的某部分中發(fā)生的峰的蛋白質(zhì)充當(dāng)候選生物標(biāo)記。

近年來，質(zhì)譜法由于其在與傳統(tǒng)的用于識別微生物的方法相比時增加的準(zhǔn)確性和縮短的得到結(jié)果的時間，也已經(jīng)作為用于識別微生物的工具而獲得普及。到目前為止，用于微生物識別的最常見質(zhì)譜法方法是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間(maldi-tof)質(zhì)譜法。在maldi-tof中，未知微生物的細(xì)胞與合適的紫外光吸收基質(zhì)溶液混合且允許在樣本板上干燥。替代地，使用微生物細(xì)胞的提取而不是完整細(xì)胞。在轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜儀的離子源之后，使激光束指向樣本以用于蛋白質(zhì)的解吸附和電離，且收集時間相依性質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

由maldi-tof方法產(chǎn)生的微生物的質(zhì)譜揭露了來自完整的肽、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段以及其它分子的若干個峰，其構(gòu)成微生物的“指紋”。此方法依賴于未知微生物的質(zhì)譜中的峰分布與參考數(shù)據(jù)庫的圖案匹配，所述參考數(shù)據(jù)庫包括使用基本上相同實驗條件獲得的已知微生物的質(zhì)譜的收集。隔離的微生物的譜與參考數(shù)據(jù)庫中的譜之間的匹配越好，在種屬、物質(zhì)或在一些情況下亞種水平下對生物的識別的置信度水平越高。因為所述方法依賴于匹配maldi-tof質(zhì)譜中的峰的圖案，所以不要求識別或另外表征所述未知微生物的譜中表示的蛋白質(zhì)以便對其進行識別。

雖然maldi-tof方法是快速且經(jīng)濟的，但它們具有的局限是限制了對病原體表征和識別的應(yīng)用范圍，包含但不限于毒性檢測和定量、電阻標(biāo)記確定、應(yīng)變匹配以及抗生素易感性測試(僅舉幾例)。maldi質(zhì)譜內(nèi)的信息內(nèi)容反映了在所使用實驗條件下一般受限于核糖體蛋白質(zhì)的大多數(shù)充足且可電離的蛋白質(zhì)。因為核糖體蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞當(dāng)中是高度守恒的，所以通過maldi-tof對接近相關(guān)的微生物的區(qū)分受到限制。在此情況下，跨越接近相關(guān)的物質(zhì)的許多核糖體蛋白質(zhì)含有相同或稍微不同的氨基酸序列(即，單氨基酸取代)，這無法以低分辨率質(zhì)譜儀有效地區(qū)分。此外，菌株和/或血清變型類型、抗生素抗性、抗生素易感性、毒性或其它重要特性的確定依賴于除核糖體蛋白質(zhì)外的蛋白質(zhì)標(biāo)記的檢測，這進一步限制maldi-tof用于微生物分析的應(yīng)用。使用maldi-tof用于微生物識別的實驗室必須使用其它方法來進一步表征經(jīng)識別的微生物。另外，maldi-tof方法對匹配譜圖案的依賴要求純的培養(yǎng)基以得到高質(zhì)量結(jié)果，且因此一般不適合于直接測試、混合培養(yǎng)基、血培養(yǎng)基或含有不同微生物的其它復(fù)雜樣本。

已經(jīng)使用用于微生物檢測的若干其它質(zhì)譜法方法。舉例來說，已經(jīng)描述基于質(zhì)譜法的蛋白質(zhì)定序方法，其中液相層析與串連質(zhì)譜法結(jié)合(lc-ms/ms)，且根據(jù)從微生物樣本導(dǎo)出的蛋白質(zhì)的酶消化獲得序列信息。被稱為“從下到上”蛋白質(zhì)組研究的此方法是用于蛋白質(zhì)識別的廣泛實踐的方法。所述方法可提供對亞種或菌株層級的識別，因為色譜分離允許除僅核糖體蛋白質(zhì)外的額外蛋白質(zhì)的檢測，包含可用于抗生素抗性標(biāo)記和毒性因數(shù)的表征的那些。

與“從下到上”蛋白質(zhì)組研究相比，“從上到下”蛋白質(zhì)組研究指代其中將蛋白質(zhì)樣本完整地引入質(zhì)譜儀而無需酶、化學(xué)品或其它分解方式的分析方法。從上到下的分析實現(xiàn)完整蛋白質(zhì)的研究，從而允許直接在蛋白質(zhì)層級的識別、主要結(jié)構(gòu)確定以及轉(zhuǎn)譯后修飾(ptm)的局部化。從上到下的蛋白質(zhì)組分析通常包括將完整蛋白質(zhì)引入質(zhì)譜儀的電離源中，使蛋白質(zhì)離子斷裂，且測量如此產(chǎn)生的各種片段的質(zhì)荷比和豐度。所得分段比肽分段復(fù)雜得多，這在無本文教示的方法存在下可能必須要使用具有極高質(zhì)量準(zhǔn)確性和分辨率能力的質(zhì)譜儀以便以可接受的確定性解譯分段圖案。所述解譯一般包含將觀測的分段圖案與包含從已知樣本產(chǎn)生的經(jīng)編譯實驗分段結(jié)果的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進行比較，或替代地與理論上預(yù)測分段圖案進行比較。舉例來說，舉例來說，liu等(《經(jīng)由四極/飛行時間串連質(zhì)譜儀中的離子阱碰撞引起的解離和離子/離子反應(yīng)對先驗未知蛋白質(zhì)的從上到下的蛋白質(zhì)識別/表征(top-downproteinidentification/characterizationofaprioriunknownproteinsviaiontrapcollision-induceddissociationandion/ionreactionsinaquadrupole/time-of-flighttandemmassspectrometer)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，2009，81，1433-1441)已經(jīng)描述對具有多達28kda的質(zhì)量的經(jīng)改質(zhì)和未改質(zhì)的未知蛋白質(zhì)的從上到下的蛋白質(zhì)識別和表征。

從上到下的分析優(yōu)于從下到上的分析的優(yōu)點在于可直接識別蛋白質(zhì)，而不是如從下到上的分析中肽的情況那樣進行推斷。另一優(yōu)點在于可以識別蛋白質(zhì)的替代形式，例如轉(zhuǎn)譯后修飾和拼接變體。然而，從上到下的分析當(dāng)與從下到上的分析相比時具有的缺點在于許多蛋白質(zhì)會難以隔離和純化。因此，不完全分離混合物中的每一蛋白質(zhì)可在質(zhì)譜分析后即刻產(chǎn)生多個離子物質(zhì)，每一物質(zhì)對應(yīng)于不同相應(yīng)質(zhì)子化程度和不同相應(yīng)電荷態(tài)，且每一此類離子物質(zhì)可帶來多個同位素變體。從上到下的分析中測得的單個ms譜可容易含有屬于不同分析物的數(shù)百到甚至數(shù)千個峰，全部在給定m/z范圍上交織，其中具有極不同強度的離子信號重疊且相互抑制。

因為在從上到下分析中獲得的生物樣本的質(zhì)譜一般是極復(fù)雜的，所以需要改進的方法用于解譯質(zhì)譜。此些方法必須克服的所得計算挑戰(zhàn)是追溯每一峰返回至某一分析物，并且一旦這對于一個或幾個分析物完成便在最佳地描述為數(shù)學(xué)分解(此項技術(shù)中也稱為數(shù)學(xué)解卷積)的過程中確定分析物的分子量。與臨床設(shè)置中的蛋白質(zhì)和多肽的質(zhì)譜分析的使用相關(guān)聯(lián)的再另一挑戰(zhàn)是在可能的最短時間周期中導(dǎo)出此信息，常常被稱為“實時”分析。顯然，所述計算在自動從上到下數(shù)據(jù)相依性分析期間實時的是更有挑戰(zhàn)性的，因為尤其當(dāng)涉及層析分離時這應(yīng)當(dāng)極快速地發(fā)生。為了繼續(xù)，需要提供以下兩者：(i)經(jīng)優(yōu)化實時計算策略，以及(ii)質(zhì)譜數(shù)據(jù)獲取策略，其針對每一離子物質(zhì)預(yù)測多個質(zhì)譜線且從潛在眾多的污染化合物預(yù)測所關(guān)注的分析物化合物的有效隔離。

現(xiàn)有數(shù)據(jù)相依性和動態(tài)排除工作流技術(shù)及對應(yīng)算法是針對小分子、小肽和在電噴射電離過程中獲取有限數(shù)目的電荷(例如，1-3個電荷)的其它分析物而開發(fā)。當(dāng)應(yīng)用于較高分子量生物聚合物分析物(最經(jīng)常是在從上到下蛋白質(zhì)組研究的過程期間的完整蛋白質(zhì))時，這些常規(guī)方法由于不同電噴射行為和計算限制的組合而顯著執(zhí)行不足。更具體來說：(1)一般來說完整高質(zhì)量分析物且確切地說蛋白質(zhì)形成的電荷態(tài)(每分子多達50個電荷或更多，例如圖12c)比在電噴射電離過程期間的小分子多得多，原因是導(dǎo)致復(fù)雜得多的ms譜的較大數(shù)目的電荷獲取位點；(2)在例如細(xì)胞裂解物或其部分等復(fù)雜混合物中，存在分子量的寬分布以及導(dǎo)致具有變化強度的電荷態(tài)分布圖案的極復(fù)雜重疊的副本數(shù)目；(3)相同或不同化學(xué)性質(zhì)的高質(zhì)量分析物的生理化學(xué)性質(zhì)的變化率產(chǎn)生層析峰形狀的顯著變化率和柱上的分析物保持；(4)如果在例如orbitrap^tm質(zhì)量分析器(一類靜電阱質(zhì)量分析器)或飛行時間(tof)質(zhì)量分析器等具有高分辨力的質(zhì)譜儀上獲取質(zhì)譜，那么對應(yīng)峰進一步解析為質(zhì)量常常遠離理論二項分布的一系列群集中的同位素的數(shù)目；(5)多種不同蛋白質(zhì)的基質(zhì)電離效應(yīng)可極大地影響多個重疊物質(zhì)的觀測強度以便使任何給定標(biāo)準(zhǔn)或樣本中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)強度的真實比率失真。相同分析物或加成物的氧化物質(zhì)、同位素群集的重疊以及現(xiàn)有軟件工具不能正確地計算高質(zhì)量物質(zhì)的電荷態(tài)引入了額外的復(fù)雜性水平。

實際上，以上考慮暗示在完整蛋白質(zhì)和其它生物聚合物的情況下，現(xiàn)有數(shù)據(jù)相依性算法是混雜的，且對來自同一生物聚合物的若干不同電荷態(tài)以冗余方式執(zhí)行ms/ms。并且，當(dāng)同位素群集并不匹配由給定生物聚合物中存在的碳、氫、氮、氧和硫原子的數(shù)目界定的傳統(tǒng)二項分布模式或并不滿足強度閾值或信噪比要求時，從對屬于同一同位素群集的多個同位素進行分段發(fā)生冗余。此重復(fù)工作導(dǎo)致最充足的/可電離的蛋白質(zhì)的識別中的冗余，同時關(guān)于其它物質(zhì)的信息丟失且提供觸發(fā)msⁿ分析的極少機會。

關(guān)于高效儀器相關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)獲取策略，可注意到離子-離子反應(yīng)在近十年來已經(jīng)在生物質(zhì)譜法領(lǐng)域中得到較大實用性，主要使用電子轉(zhuǎn)移解離(etd)來解離肽/蛋白質(zhì)且確定主要序列信息和表征轉(zhuǎn)譯后修飾。作為另一類型的離子-離子反應(yīng)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移也已經(jīng)在生物應(yīng)用中充分使用。以實驗方式，在一種形式的質(zhì)子轉(zhuǎn)移中，允許來自樣本的多正電荷蛋白質(zhì)離子(即，蛋白質(zhì)陽離子)與單電荷反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)以便減少個別蛋白質(zhì)陽離子的電荷態(tài)以及蛋白質(zhì)陽離子的此些電荷態(tài)的數(shù)目。當(dāng)反應(yīng)劑陰離子大量超過蛋白質(zhì)陽離子群體而存在時，這些反應(yīng)以偽一級反應(yīng)動力學(xué)繼續(xù)。反應(yīng)的速率與蛋白質(zhì)陽離子(或其它多電荷陽離子)的電荷的平方乘以反應(yīng)劑陰離子上的電荷成正比。同一關(guān)系也適用于相反極性的反應(yīng)，此處經(jīng)界定為單電荷反應(yīng)劑陽離子與從蛋白質(zhì)樣本導(dǎo)出的多電荷陰離子的群體之間的反應(yīng)。這產(chǎn)生一系列偽一級連續(xù)反應(yīng)曲線，如由起始的多電荷蛋白質(zhì)陽離子群體界定。雖然所述反應(yīng)是高度發(fā)熱的(超過100千卡/摩爾)，但質(zhì)子轉(zhuǎn)移是在1毫托的背景氣體(即氦氣)存在下執(zhí)行的偶電子過程，且因此不使起始的多電荷蛋白質(zhì)陽離子群體分段。碰撞氣體用以在微秒時間尺度(10⁸碰撞每秒)上移除過量能量，因此防止所得產(chǎn)物離子群體的分段。碰撞氣體用以在微秒時間尺度(10⁸碰撞每秒)上移除過量能量，因此防止所得產(chǎn)物離子群體的分段。

質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)(ptr)已經(jīng)成功地用以識別蛋白質(zhì)混合物中的蛋白質(zhì)。具體來說，質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)方法的應(yīng)用可設(shè)想為混合物簡化過程，其在質(zhì)譜儀中實時(幾毫秒)實行，其使得蛋白質(zhì)和多肽的質(zhì)譜特征彼此分離以及與一般低電荷污染離子分離。此程序?qū)崿F(xiàn)分析物蛋白質(zhì)和多肽離子作為群組或作為個別離子物質(zhì)的隔離，且因此已經(jīng)用以確定高質(zhì)量蛋白質(zhì)的電荷態(tài)和分子量。ptr也已經(jīng)用于簡化從多電荷前驅(qū)體蛋白質(zhì)離子的碰撞激活導(dǎo)出的產(chǎn)物離子譜。雖然ptr減少了從多電荷蛋白質(zhì)離子導(dǎo)出的總體信號，但這由所得ptr產(chǎn)物離子的信噪比的顯著增益更多地補償。ptr過程是100％高效的，其產(chǎn)生僅單一系列的反應(yīng)產(chǎn)物，且不產(chǎn)生需要特殊解譯和數(shù)據(jù)分析的副反應(yīng)產(chǎn)品。

ptr對肽、多肽和蛋白質(zhì)的分析的應(yīng)用的各種方面已經(jīng)在以下文獻中描述：在發(fā)明人hunt等的名義下的第7,749,769b2號美國專利、在發(fā)明人hartmer等的名義下的第2012/0156707a1號美國專利預(yù)授權(quán)公開案、在發(fā)明人zabrouskov的名義下的第2012/0205531a1號美國預(yù)授權(quán)公開案；mcluckey等的《離子/離子質(zhì)子轉(zhuǎn)移動力學(xué)：用于從蛋白質(zhì)混合物的電噴射導(dǎo)出的離子的分析的暗示(ion/ionproton-transferkinetics:implicationsforanalysisofionsderivedfromelectrosprayofproteinmixtures)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》1998，70，1198-1202；stephenson等的《涉及非共價交互的生物離子的離子-離子質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)：全肌紅蛋白(ion-ionprotontransferreactionsofbio-ionsinvolvingnoncovalentinteractions:holomyoglobin)》，《美國質(zhì)譜學(xué)會期刊(j.am.soc.massspectrom.)》，1998，8，637-644；stephenson等的《氣相中的離子/離子反應(yīng)：涉及多電荷蛋白質(zhì)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)(ion/ionreactionsinthegasphase:protontransferreactionsinvolvingmultiply-chargedproteins)》，《美國化學(xué)學(xué)會期刊(j.am.chem.soc.)》，1996，118，7390-7397；mcluckey等的《用于電噴射質(zhì)譜法中改進的有效質(zhì)量分辨率的離子/分子反應(yīng)(ion/moleculereactionsforimprovedeffectivemassresolutioninelectrospraymassspectrometry)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，1995，67，2493-2497；stephenson等的《用于蛋白質(zhì)混合物分析的離子/離子質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)(ion/ionprotontransferreactionsforproteinmixtureanalysis)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，1996，68，4026-4032；stephenson等的《用于寡肽混合物分析的離子/離子反應(yīng)：對由0.5-100kda組分構(gòu)成的混合物的應(yīng)用(ion/ionreactionsforoligopeptidemixtureanalysis:applicationtomixturescomprisedof0.5-100kdacomponents)》，《美國質(zhì)譜學(xué)會期刊(j.am.soc.massspectrom.)》，1998，9，585-596；stephenson等的《用于通過電噴射質(zhì)譜法的高質(zhì)量物質(zhì)和混合物組分的改進質(zhì)量確定的電荷操縱(chargemanipulationforimprovedmassdeterminationofhigh-massspeciesandmixturecomponentsbyelectrospraymassspectrometry)》，《質(zhì)譜學(xué)期刊(j.massspectrom.)》，1998，33，664-672；stephenson等的《經(jīng)由離子/離子化學(xué)方法從多電荷母代離子導(dǎo)出的產(chǎn)物離子譜的簡化(simplificationofproductionspectraderivedfrommultiplychargedparentionsviaion/ionchemistry)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，1998，70，3533-3544，以及scalf等的《電荷減少電噴射質(zhì)譜法(chargereductionelectrospraymassspectrometry)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，2000，72，52-60。一般離子/離子化學(xué)方法的各種方面已經(jīng)在mcluckey等的《高質(zhì)量多電荷離子的離子/離子化學(xué)方法(ion/ionchemistryofhigh-massmultiplychargedions)》，《質(zhì)譜學(xué)回顧(massspectrom.rev.)》，1998，17，369-407以及在發(fā)明人mcluckey等的名義下的第7,550,718b2號美國專利中描述。用于執(zhí)行ptr且用于減少質(zhì)譜儀中的離子電荷態(tài)的設(shè)備已經(jīng)在以下各者中描述：在發(fā)明人chen等的名義下的第2011/0114835a1號美國預(yù)授權(quán)公開案，在發(fā)明人brown等的名義下的第2011/0189788a1號美國預(yù)授權(quán)公開案，在發(fā)明人brown等的名義下的第8,283,626b2號美國專利，以及在發(fā)明人frey等的名義下的第7,518,108b2號美國專利。ptr電荷減少技術(shù)對生物的檢測和識別的適配已由mcluckey等描述(《用于生物的檢測和識別的電噴射/離子阱質(zhì)譜法(electrospray/iontrapmassspectrometryforthedetectionandidentificationoforganisms)》，生物質(zhì)譜法的首次聯(lián)合服務(wù)研討會會刊，巴爾的摩，馬里蘭州，1997年7月28-30日，127-132)。

由ptr過程產(chǎn)生的產(chǎn)物離子可通過使用被稱為“離子停車”的技術(shù)積聚到一個或若干電荷態(tài)中。離子停車在反應(yīng)周期期間使用補充ac電壓在特定質(zhì)荷比(m/z)值下將由任何給定蛋白質(zhì)分子的原始不同地質(zhì)子化離子形成的ptr產(chǎn)物離子固結(jié)為特定電荷態(tài)。此技術(shù)可用以將產(chǎn)物離子信號集中到單個或有限數(shù)目的電荷態(tài)中(且因此集中到單個或幾個相應(yīng)m/z值中)以用于較高靈敏度檢測或者使用碰撞激活、etd或其它離子操縱技術(shù)的進一步操縱。離子停車的各種方面已經(jīng)在以下各者中描述：在發(fā)明人mcluckey的名義下的第7,064,317b2號美國專利；在發(fā)明人mcluckey的名義下的第7,355,169b2號美國專利；在發(fā)明人mcluckey的名義下的第8,334,503b2號美國專利；在發(fā)明人leblanc的名義下的第8,440,962b2號美國專利；且在以下文獻中描述：mcluckey等的《在電動離子阱中的離子/離子反應(yīng)期間的離子停車(ionparkingduringion/ionreactionsinelectrodynamiciontraps)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，2002，74，336-346；reid等的《來自復(fù)雜混合物的完整蛋白質(zhì)的氣相濃度、純化和識別(gas-phaseconcentration,purification,andidentificationofwholeproteinsfromcomplexmixtures)》，《美國化學(xué)學(xué)會期刊(j.am.chem.soc.)》，2002，124，7353-7362；he等的《在單個氣相純化和濃度程序之后多個蛋白質(zhì)離子電荷態(tài)的解離(dissociationofmultipleproteinionchargestatesfollowingasinglegas-phasepurificationandconcentrationprocedure)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，2002，74，4653-4661；xia等的《混合線性離子阱中的相互存儲模式離子/離子反應(yīng)(mutualstoragemodeion/ionreactionsinahybridlineariontrap)》，《美國質(zhì)譜學(xué)會期刊(j.am.soc.massspectrom.)》，2005，16，71-81；chrisman等的《平行離子停車：改善電子轉(zhuǎn)移解離中的母代到第一代產(chǎn)物的轉(zhuǎn)換(parallelionparking:improvingconversionofparentstofirst-generationproductsinelectrontransferdissociation)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，2005，77(10)，3411-3414，以及chrisman等的《蛋白質(zhì)混合物的平行離子停車(parallelionparkingofproteinmixtures)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，2006，78，310-316。

由于用于實時或近實時分析復(fù)雜的自然樣本的質(zhì)譜蛋白質(zhì)組分析的此項技術(shù)中的進行中的要求，因此存在對起作用的且計算的質(zhì)量分析的改進方法的需要，其可有效分離分析物與污染物，區(qū)分信號與噪聲，正確地分配相關(guān)m/z值到恰當(dāng)同位素群集中，正確地確定電荷態(tài)，且將各種電荷態(tài)恰當(dāng)?shù)亟M織到分布包絡(luò)中。在數(shù)據(jù)獲取以及任選地獲取后處理工作流中的成功都需要這些改進。優(yōu)選地，改進的起作用的方法、工作流和算法應(yīng)當(dāng)能夠在“實時”環(huán)境中工作以使得可在正獲取質(zhì)譜的同時做出自動數(shù)據(jù)相依性決策，且使得可在隨后不久做出臨床解譯。本發(fā)明解決這些需要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明教示離子-離子反應(yīng)化學(xué)方法的應(yīng)用，其中：(i)使用一個或多個階段的質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，任選地由數(shù)據(jù)相依性分段補充，以簡化從樣本的電噴射電離導(dǎo)出的錯離子群體的質(zhì)譜分析，所述樣本包括從組織、生物流體、微生物或其它細(xì)胞的樣本提取的化合物的混合物；以及(ii)采用經(jīng)優(yōu)化譜解卷積程序以在充分短時間內(nèi)(即，一秒或更短的計算時間)自動區(qū)別簡化譜中的多個生物聚合物分子的質(zhì)譜標(biāo)志，以使得可實時做出關(guān)于同一相應(yīng)樣本的后續(xù)質(zhì)譜分析步驟的過程的決策。

確切地說，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過使此些離子的質(zhì)荷比受限子集經(jīng)受ptr，所得產(chǎn)物離子的群體包括具有較低總電荷值的電荷態(tài)的簡單得多的群體(其中詞“較低”或“減少”在此上下文中指代在絕對值方面較低或減少)，其可容易解析且指派給特定蛋白質(zhì)或肽離子。因為ptr產(chǎn)物離子表示比原始前驅(qū)體離子小的從電荷態(tài)的復(fù)雜混合物導(dǎo)出的多電荷物質(zhì)的子集，所以極大地簡化質(zhì)譜解譯，且可對從微生物提取物導(dǎo)出的單個蛋白質(zhì)或其它組分執(zhí)行使用串連質(zhì)譜法(ms/ms或msⁿ)的目標(biāo)分析。

從給定質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)生的電荷減少的蛋白質(zhì)和肽產(chǎn)物離子產(chǎn)生比原始m/z值大的質(zhì)荷比(m/z)值。對于具有相同m/z值但不同質(zhì)量和電荷的蛋白質(zhì)離子的混合物，所述混合物可在微秒或毫秒時間尺度上分離。此外，具有不同質(zhì)量和電荷的相同m/z值的這些多電荷蛋白質(zhì)離子可基于反應(yīng)的電荷平方相依性而與從小分子、脂質(zhì)、溶劑或其它干擾物導(dǎo)出的低m/z值背景離子分離。多電荷離子因此及時與背景信號分離因此在高度增加的信噪比(s/n)比率下產(chǎn)生分離蛋白質(zhì)混合物。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于這兩個因素，蛋白質(zhì)/肽或任何其它分析物產(chǎn)物離子的譜特征可以與大多數(shù)干擾物離子的那些譜特征顯著分離。另外，可執(zhí)行ptr反應(yīng)的多個階段以在低分辨率儀器上分離蛋白質(zhì)混合物，例如線性離子阱質(zhì)譜儀，以便簡化且隔離這些蛋白質(zhì)和其它分析物以使得可經(jīng)由msⁿ分析執(zhí)行目標(biāo)分析。本發(fā)明人已進一步發(fā)現(xiàn)，通過與ptr反應(yīng)結(jié)合執(zhí)行“離子停車”程序可甚至進一步放大簡單ptr反應(yīng)的有利性質(zhì)，因此使得系統(tǒng)分析師能夠至少部分地選擇或控制由ptr反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物離子電荷態(tài)分布。

ptr也可用以改善質(zhì)譜法中的高質(zhì)量性能。在質(zhì)譜法中，可對離子指派整數(shù)標(biāo)稱質(zhì)量或質(zhì)荷比或者準(zhǔn)確或確切的質(zhì)量或質(zhì)荷比。準(zhǔn)確或確切的質(zhì)量或質(zhì)荷比可視為包括整數(shù)分量或值以及十進制分量或值。原子和分子質(zhì)量是以道爾頓(da)的單位測得，且m/z比值一般是以每基本電荷的道爾頓或da/e或湯姆森(th)的單位給定。應(yīng)注意，在本文檔中的m/z比的描述數(shù)值的實例中，此些比率應(yīng)理解為以每基本電荷的道爾頓或th的單位提供。準(zhǔn)確或確切(即非整數(shù))質(zhì)量或m/z比可表示為整數(shù)標(biāo)稱質(zhì)量或質(zhì)荷比值或分量以及對應(yīng)的十進制分量。因此，如本文檔中所使用，準(zhǔn)確質(zhì)量確定或質(zhì)量分析可視為包括子整數(shù)精度，即±0.5da或更好且優(yōu)選0.1da或更好的準(zhǔn)確性。

替代地，準(zhǔn)確或確切質(zhì)量或m/z比可在百萬分率(ppm)質(zhì)量準(zhǔn)確性方面界定。對于多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)譜確定，一般需要50ppm或更好、較優(yōu)選10ppm或更好且再優(yōu)選1ppm或更好的實驗質(zhì)量準(zhǔn)確性，因為這些分子及其離子經(jīng)常具有至少10,000da且多達100,000da的分子或離子量。因此，如本文檔中所使用，準(zhǔn)確質(zhì)量確定或質(zhì)量分析可替代地被視為包括50ppm或更好、較優(yōu)選10ppm或更好且再優(yōu)選1ppm或更好的準(zhǔn)確性。

除改善此類型分析的信噪比之外，本發(fā)明人還考慮了蛋白質(zhì)離子上的電荷減少造成這些大離子在氣相中再折疊，如zhao等的《離子/離子質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)對氣相細(xì)胞色素c離子的構(gòu)形的影響(effectsofion/ionprotontransferreactionsonconformationofgas-phasecytochromecions)》，《美國質(zhì)譜學(xué)會期刊(j.am.soc.massspectrom.)》2010，21，1208-1217中描述。據(jù)相信，這帶來更緊湊的配置，其減少蛋白質(zhì)離子的碰撞橫截面并且因此增加其穩(wěn)定性而防止由于與存在于質(zhì)量分析器腔室中的背景氣體分子的碰撞而分段。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)此效應(yīng)可特別有益于采用鏡像電流檢測的質(zhì)量分析器，例如傅里葉變換離子回旋共振(ft-icr)質(zhì)量分析器或orbitrap^tm質(zhì)量分析器(可購自美國馬薩諸塞州的thermofisherscientificofwaltham的一類靜電阱質(zhì)量分析器)中所完成。改進的高質(zhì)量性能的另一潛在原因是進入由ptr過程產(chǎn)生的給定蛋白質(zhì)離子的大的能量沉積。由于ptr過程而沉積的能量超過100千卡/摩爾，且隨后因碰撞能量的存在而有效地衰減。此快速加熱過程使得可能經(jīng)由離子-偶極子、離子-引發(fā)偶極子或偶極子-引發(fā)偶極子交互而附著到蛋白質(zhì)的中性分子“沸騰”。最重要的是，用于高質(zhì)量蛋白質(zhì)的電荷態(tài)的減少可顯著改善這些離子從其中通常執(zhí)行ptr過程的離子導(dǎo)向器、離子存儲或離子捕獲裝置的相對高壓力傳送到例如orbitrap^tm質(zhì)量分析器等質(zhì)量分析器的較低壓力區(qū)。減少的電荷態(tài)意味著離子以較少動能傳送，因此限制了離子散射、直接分段或亞穩(wěn)定物質(zhì)的形成。本發(fā)明人進一步考慮此后一種性質(zhì)在例如orbitrap^tm型靜電阱質(zhì)量分析器等準(zhǔn)確質(zhì)譜儀中實現(xiàn)ptr產(chǎn)物離子的高準(zhǔn)確性質(zhì)量分析方面尤其顯著，所述準(zhǔn)確質(zhì)譜儀檢測在一延伸時間范圍中通過循環(huán)離子運動產(chǎn)生的鏡像電流。

本發(fā)明教示尤其可用于具有超過50kda的分子量的完整蛋白質(zhì)的分析和識別。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)出人意料的結(jié)果，所述結(jié)果與上文提到的各種有利因素結(jié)合在一起可實現(xiàn)從自然微生物樣本導(dǎo)出的極復(fù)雜混合物中準(zhǔn)確識別多個完整蛋白質(zhì)或大的肽。此識別可在物質(zhì)、亞種或甚至菌株層級上實現(xiàn)微生物識別。目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽離子單物質(zhì)或多物質(zhì)可經(jīng)選擇以便基于先驗知識或信息個別地或組合地指示特定微生物或細(xì)胞類型或者微生物或細(xì)胞類型的特定菌株或變體或者給定毒性因數(shù)或毒素在樣本中的存在，或者指示微生物或細(xì)胞抵抗抗菌劑化合物或抗生素藥品的能力。

本發(fā)明在一個方面中提供對傳統(tǒng)的從下到上蛋白質(zhì)組研究方法的替代，即經(jīng)由方法對從微生物細(xì)胞導(dǎo)出的完整蛋白質(zhì)的從上到下分析，所述方法適用于大體上所有微生物，包含革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、分枝桿菌、霉?jié){菌、酵母、原生動物、絲狀(即，微觀)真菌。本發(fā)明提供甚至在含有微生物的混合物和/或直接來自純的和/或混合培養(yǎng)基及來自直接樣本(例如，表面棉簽、體液等)分析的微生物的樣本中在種屬、物質(zhì)、亞種、菌株致病變型和血清變型層級對微生物的識別。另外，本文教示的方法可用于毒性因數(shù)、抗生素抗性和易感性標(biāo)記或其它特性的目標(biāo)檢測。本發(fā)明教示的從上到下方法是簡單且快速的，因為不需要樣本的化學(xué)或酶分解且實時地實現(xiàn)數(shù)據(jù)處理。

根據(jù)本發(fā)明教示的方法可包括以下步驟中的至少一或多個：微生物細(xì)胞中斷，蛋白質(zhì)的溶解，樣本凈化(脫鹽、移除不可溶組分和殘渣，和/或聚集)，樣本灌注或流動注入，快速部分液體層析分離，標(biāo)準(zhǔn)層析分離，等電點聚焦，溶液中蛋白質(zhì)的電離，離子的給定m/z范圍的隔離，致使離子的隔離范圍經(jīng)受ptr以便形成第一代ptr產(chǎn)物離子，第一代ptr產(chǎn)物離子的m/z范圍的任選隔離，ms或ms/ms模式中的任選質(zhì)譜法，任選地致使第一代ptr產(chǎn)物離子的隔離范圍經(jīng)受第二ptr反應(yīng)以便形成第二代ptr產(chǎn)物離子，ms或ms/ms模式中的質(zhì)譜法，以及經(jīng)由分子量分析和/或蛋白質(zhì)序列分析的微生物識別，或使用任何統(tǒng)計分類方法。優(yōu)選但不一定地，以高分辨率、高準(zhǔn)確性質(zhì)譜儀執(zhí)行質(zhì)譜法步驟，例如包括orbitrap^tm質(zhì)量分析器的質(zhì)譜儀。

因為執(zhí)行使用化學(xué)反應(yīng)劑的有限集合的常用方法，所以本發(fā)明教示的方法適合于在完全自動系統(tǒng)內(nèi)使用以用于樣本制備和質(zhì)譜法。理想地，這些方法可從樣本制備到結(jié)果報告都是自動的。結(jié)果可自動傳送到醫(yī)院的電子醫(yī)療記錄系統(tǒng)，其中結(jié)果可直接鏈接到患者治療策略、保險、記賬或在流行病報告中使用。此集成系統(tǒng)促進了在醫(yī)院、本地、地區(qū)和全球?qū)蛹墝α餍胁”l(fā)的跟蹤。對于高處理量實驗室，多個系統(tǒng)可介接到中央計算機，所述中央計算機在報告之前整合來自不同儀器的數(shù)據(jù)。所述系統(tǒng)可導(dǎo)入表現(xiàn)型易感性數(shù)據(jù)，其中所述數(shù)據(jù)可與由本發(fā)明產(chǎn)生的識別、毒性、抗生素抗性和鍵入信息組合。

本文所描述的計算方法實現(xiàn)有效的(1)非冗余數(shù)據(jù)相依性質(zhì)譜法分析，其采用基于計算結(jié)果的質(zhì)譜工作流決策，以及任選地用于個別高質(zhì)量分析物及其不同復(fù)雜度的混合物的獲取后數(shù)據(jù)處理。對于數(shù)據(jù)相依性質(zhì)譜法分析，本文描述的新穎“最高p個唯一分析物特定群集”工作流及相關(guān)聯(lián)計算代替了先前常規(guī)現(xiàn)有技術(shù)的“最高p個最充足前驅(qū)體”邏輯。每一此類物質(zhì)相關(guān)的包絡(luò)是根據(jù)本發(fā)明教示的方法指示為全部從單個唯一分子產(chǎn)生的相關(guān)質(zhì)譜線(m/z值)的集合。每一物質(zhì)相關(guān)的包絡(luò)將經(jīng)指示為已經(jīng)從單個分子產(chǎn)生的各種電荷態(tài)和同位素群集分組在一起。所述方法還有用于其中未觀測到可歸因于同位素分布的峰(例如低分辨率數(shù)據(jù)的情況)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)或者具有經(jīng)解析同位素分布但每分子僅一個電荷態(tài)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。然而，物質(zhì)相關(guān)的包絡(luò)可在需要時排除在數(shù)據(jù)分析之前移除的加成物。

可基于計算結(jié)果僅對給定物質(zhì)相關(guān)的電荷態(tài)分布包絡(luò)的選定代表執(zhí)行串連質(zhì)譜法(或更一般的msⁿ分析)，在此之后數(shù)據(jù)獲取是針對在先前ms譜中所確定的下一物質(zhì)相關(guān)的電荷態(tài)分布包絡(luò)(即，不同化合物的包絡(luò))，等等。在各種實施例中，使用如上所述從質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)(ptr)對從生物樣本導(dǎo)出的離子子集的應(yīng)用的一個或多個階段導(dǎo)出的數(shù)據(jù)進行計算，所述生物樣本包括蛋白質(zhì)和/或多肽和其它有機分子的復(fù)雜混合物。在msⁿ分析之前，對計算的電荷態(tài)分布模式進行過濾以便排除同一分析物的氧化(或其它指定)物質(zhì)和各種其它不希望的加成物。在此方法中，在層析時間尺度上或者在通過灌注、流動注入或借助于任何其它樣本引入裝置將樣本引入到質(zhì)譜儀中的實驗中檢索關(guān)于樣本中的分析物的最可能的充足信息。在所有情況下，全部消除或顯著減少數(shù)據(jù)獲取冗余。

經(jīng)優(yōu)化“最高p個唯一分析物特定群集”計算工作流可包含以下各者中的一或多者：(1)用于表示峰位置的質(zhì)心的使用；(2)用于表示峰高度的二進制或簡化強度尺度的使用；(3)電荷態(tài)對掃描中找到的同位素群集中的每一峰(質(zhì)心)的正確計算指派；(4)用以將同位素群集(經(jīng)解析或未解析)指派到適當(dāng)電荷態(tài)包絡(luò)的關(guān)于電荷態(tài)的信息的使用；(5)分子量的任選確定；以及(6)以每一個別電荷態(tài)包絡(luò)僅允許一個(或選定數(shù)目)msⁿ事件的方式對數(shù)據(jù)相依性獲取的控制?！白罡遬個唯一群集”方法可經(jīng)設(shè)置以辨識且作用于給定生物聚合物的最密集電荷態(tài)、所檢測最高電荷態(tài)與觀測到的最密集電荷態(tài)之間的中值電荷態(tài)，或任何其它所需電荷態(tài)(即，不僅是最大或中值電荷態(tài))或電荷態(tài)組合。所述方法因此非常適合與用于離子分段的多種離子激活方法一起使用，包含但不限于碰撞引發(fā)的解離(cid)以及電子轉(zhuǎn)移解離(etd)，其是針對給定分子量范圍或在其中首先查詢最不充足的蛋白質(zhì)物質(zhì)的實例中界定。可采用類似方法用于獲取后數(shù)據(jù)處理，其中將同一計算邏輯應(yīng)用于在所述新穎方法的執(zhí)行之前完成獲取的原始ms譜。實時或獲取后數(shù)據(jù)處理可進一步包含分子量確定和分析物識別。

本發(fā)明教示的這些原理可在高分辨率串連質(zhì)譜法系統(tǒng)上應(yīng)用于各種分子量和化學(xué)性質(zhì)的分析物，所述系統(tǒng)包含但不限于基于或包含orbitrap^tm質(zhì)量分析器的質(zhì)譜儀儀器。此些儀器包含orbitrapfusion^tm、orbitrapvelos-pro^tm、q-exactive^tm和orbitrapelite^tm以及四極飛行時間(qtof)質(zhì)譜儀和傅立葉變換離子回旋共振(ft-icr)質(zhì)譜儀。此外，相同計算原理可應(yīng)用于在用于相對極高質(zhì)量分析物的高分辨率質(zhì)譜法系統(tǒng)上獲得的質(zhì)譜中可見的同位素未解析電荷態(tài)包絡(luò)，或應(yīng)用于在例如離子阱或任何其它paul阱配置等質(zhì)量分析器上獲得的單位分辨率質(zhì)譜。在實例中，并非基于同位素群集的個別解析線之間的距離做出電荷確定，而是使用同一電荷態(tài)包絡(luò)內(nèi)的電荷態(tài)之間的距離計算這些確定。再次，此基于群集的策略可應(yīng)用于單位分辨率數(shù)據(jù)以及通過線性離子阱和三重四極儀器產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。

當(dāng)與層析分離結(jié)合使用時，所提議的計算工作流方法使得來自在層析運行過程期間獲得的每一個別質(zhì)譜的信息最大化。所述新穎方法也可以與其中通過灌注或流動注入而引入樣本的質(zhì)譜實驗結(jié)合使用。在大多數(shù)實驗情形中，所述新穎方法顯著減少總分析時間。當(dāng)應(yīng)用于已經(jīng)獲取的數(shù)據(jù)時，新穎的“最高p個唯一分析物特定群集”工作流方法可使來自ms譜的信息產(chǎn)量最大化且可實時計算分析物的分子量。

本發(fā)明中描述且教示的新穎原理、工作流和算法及方法在所有情況下當(dāng)若干分析物在同一質(zhì)譜內(nèi)以質(zhì)譜法(ms)可檢測時適用。舉例來說，可在兩個或更多個分析物從層析柱共溶離且將共溶離分析物同時引入到質(zhì)譜儀中的情況下采用所述新穎教示。作為第二實例，可在使用流動注入方法將兩個或更多個分析物引入到質(zhì)譜儀中的情況下采用所述新穎教示。在再第三實例中，可在使用針筒灌注將兩個或更多個分析物引入到質(zhì)譜儀中的情況下采用所述新穎教示。在再其它實例中，可在通過毛細(xì)電泳法設(shè)備或芯片實驗室設(shè)備的分離之后將分析物引入到質(zhì)譜儀中的情況下采用所述新穎教示。所述新穎方法可與采用任何已知電離技術(shù)的質(zhì)譜儀結(jié)合使用，例如(但不限于)光電離、熱噴射電離、電噴射電離(esi)、解吸附電噴射電離(desi)、紙噴霧電離、大氣壓化學(xué)電離(apci)。

因此，在第一方面中，揭示一種用于識別液體樣本內(nèi)的蛋白質(zhì)/多肽或其它生物相關(guān)化合物的存在或不存在的方法，所述液體樣本包括化合物的混合物，所述混合物包含多種蛋白質(zhì)化合物或多種多肽化合物或多種蛋白質(zhì)和多肽或其它化合物，其中所述方法包括：(a)將所述液體樣本的一部分或全部引入到質(zhì)譜儀的電噴射電離源中；(b)通過電噴射電離形成所述液體樣本的所述部分的所述化合物混合物的帶正電離子，所述帶正電離子包括多個離子物質(zhì)；(c)隔離包括第一質(zhì)荷比(m/z)比率范圍的所述離子物質(zhì)的第一子集，所述范圍包含所述分析物化合物的多質(zhì)子化分子物質(zhì)的m/z比；(d)通過致使所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集在預(yù)定持續(xù)時間中與反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而從所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集產(chǎn)生多個第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)，所述反應(yīng)劑陰離子在反應(yīng)后從一或多個離子物質(zhì)中的包括蛋白質(zhì)或多肽化合物的質(zhì)子化物質(zhì)的每一者提取質(zhì)子；(e)使用質(zhì)量分析器產(chǎn)生所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)或從所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；(f)進行對所述第一代或所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述質(zhì)譜的搜索以找到作為所述蛋白質(zhì)或多肽分析物化合物的診斷的一或多個m/z比的集合；以及(g)基于在所述質(zhì)譜中識別的m/z比的集合與一或多個診斷m/z比的集合之間的相似性量度而產(chǎn)生所述樣本內(nèi)的所述分析物化合物的存在或不存在的確定。所述相似性量度可包括基于發(fā)現(xiàn)在經(jīng)識別m/z比的測得集合中發(fā)生的一或多個診斷m/z比的所確定百分比或比例而計算的度量。替代地，可通過比較所述質(zhì)譜中識別的m/z比的集合與基于蛋白質(zhì)、dna或碳水化合物的數(shù)據(jù)庫中包含的集合之間的相似性量度；以及(h)使用前述信息作為使用譜庫、基于序列的搜索、統(tǒng)計分類方法(包含但不限于貝葉斯、邏輯回歸和決策樹分類器)積極地識別任何未知的微生物，來確定樣本內(nèi)的分析物化合物的存在。作為在步驟(b)中形成帶正電離子的一個替代方案，實際上可產(chǎn)生帶負(fù)電分析物離子物質(zhì)。在此些情況下，選擇反應(yīng)劑陰離子以便將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到分析物離子物質(zhì)，進而減少其負(fù)電荷的絕對值。

在第二方面中，揭示一種識別樣本中的微生物類型的存在或不存在的方法，其包括：(i)識別在所述樣本中的同時存在是所述樣本中的所述微生物類型的存在的診斷的一系列分子量；(ii)識別在所述樣本中的同時存在是所述樣本中的所述微生物類型的存在的診斷的分析物化合物列表，所述分析物化合物列表包括蛋白質(zhì)化合物、多肽化合物或蛋白質(zhì)和多肽化合物兩者；(iii)從所述樣本提取包括從樣本導(dǎo)出的蛋白質(zhì)和多肽的混合物的液體溶液；(iv)針對所述列表中的每一相應(yīng)分析物化合物執(zhí)行分析步驟的集合；以及(v)如果所述液體溶液內(nèi)識別出所述分析物化合物列表的微生物特定分析物化合物的存在，那么識別所述樣本內(nèi)的微生物類型的存在。針對所述列表中的每一相應(yīng)分析物執(zhí)行的分析步驟包括：(a)將所述液體溶液的一部分引入到質(zhì)譜儀的電噴射電離源中；(b)通過電噴射電離形成所述液體溶液的所述部分的所述化合物混合物的帶正電離子，所述帶正電離子包括多個離子物質(zhì)；(c)隔離包括第一質(zhì)荷比(m/z)比率范圍的所述離子物質(zhì)的第一子集，所述范圍包含所述相應(yīng)分析物化合物的隨機或特定預(yù)定多質(zhì)子化分子物質(zhì)的m/z比；(d)通過致使所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集在預(yù)定持續(xù)時間中與反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而從所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集產(chǎn)生多個第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)，所述反應(yīng)劑陰離子從一或多個離子物質(zhì)中的包括蛋白質(zhì)或多肽化合物的質(zhì)子化物質(zhì)的每一者自發(fā)地提取質(zhì)子；(e)使用質(zhì)量分析器產(chǎn)生所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)或從所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；(f)進行所述第一代或所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述質(zhì)譜的搜索以找到作為所述相應(yīng)分析物化合物的診斷的一或多個m/z比的集合；以及(g)基于所述質(zhì)譜中識別的m/z比的集合與一或多個診斷m/z比的所述集合之間的相似性量度而識別所述液體溶液內(nèi)的所述相應(yīng)分析物化合物的存在。所述相似性量度可包括基于發(fā)現(xiàn)在經(jīng)識別m/z比的測得集合中發(fā)生的一或多個診斷m/z比的所確定百分比或比例而計算的度量。可從譜庫或序列數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出診斷m/z比。如果在步驟(c)中隔離的m/z比是隨機多質(zhì)子化分子物質(zhì)，那么在步驟(f)中進行的搜索是基于序列的搜索。否則，如果在步驟(c)中隔離的m/z比是特定預(yù)定多質(zhì)子化分子物質(zhì)，那么在步驟(f)中進行譜庫搜索。除使用前述信息作為使用譜庫或基于序列的搜索而積極地識別未知微生物之外，還可利用統(tǒng)計分類方法(包含但不限于貝葉斯、邏輯回歸和決策樹分類器)用于微生物表征和識別。作為在步驟(b)中形成帶正電離子的一個替代方案，實際上可產(chǎn)生帶負(fù)電分析物離子物質(zhì)。在此些情況下，選擇反應(yīng)劑陰離子或陽離子以便將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到分析物陰離子物質(zhì)，從而減少其負(fù)電荷的絕對值。本文所描述的ptr實驗過程的控制可使用實時光譜解卷積實時地手動或自動執(zhí)行。

在上文中的術(shù)語“實時譜解卷積”指代質(zhì)譜數(shù)據(jù)的譜解卷積，其與產(chǎn)生(或已經(jīng)產(chǎn)生)所述質(zhì)譜數(shù)據(jù)的質(zhì)譜實驗或分析運行是同時執(zhí)行的。舉例來說，通過在梯度溶離期間在第一保持層析滯留時間溶離的分析物的質(zhì)量分析獲取的質(zhì)譜數(shù)據(jù)可經(jīng)解卷積，以便識別分析物，同時繼續(xù)在同一梯度溶離期間在第二較晚的滯留時間溶離的額外分析物的額外質(zhì)譜數(shù)據(jù)的收集。同樣，可執(zhí)行額外質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解卷積以便識別額外分析物，同時繼續(xù)在同一梯度溶離期間在第三溶離時間溶離的分析物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的收集。可通過使用快速計算機來促進實時光譜解卷積，例如采用并行處理或圖形處理單元(gpu)執(zhí)行必要計算的計算機。替代地或另外，可通過使用計算上高效或經(jīng)優(yōu)化算法來促進實時譜解卷積，例如至少部分以匯編語言編寫或廣泛利用高速緩沖存儲器中查找表的算法。有利地且如根據(jù)本發(fā)明教示的解卷積計算方法(附錄中描述)提供，相對于在不執(zhí)行解卷積計算的情況下的同一工作流，所述數(shù)學(xué)計算將不引入任何顯著延遲(即，大于1.0秒)到工作流中。

更一般地，術(shù)語“實時”可理解為意味著當(dāng)參考與數(shù)據(jù)獲取過程相關(guān)聯(lián)的事件或活動而使用時，在所述數(shù)據(jù)獲取過程的一些方面或子過程在進行中的同時發(fā)生所述事件或活動。數(shù)據(jù)獲取過程自身可包含以下個別子過程中的一或多個：樣本純化(例如，固相萃取、尺寸排阻層析)；樣本分離(例如，層析法)；進入質(zhì)譜儀的樣本傳送(例如，溶離液從層析儀的灌注或進入)；離子源中的樣本電離以產(chǎn)生第一代離子；離子的選擇和隔離以用于進一步操縱；致使從樣本導(dǎo)出的離子的分段或從樣本導(dǎo)出的離子與反應(yīng)劑離子的反應(yīng)以便產(chǎn)生第一代產(chǎn)物離子；產(chǎn)物離子的任選選擇和隔離；產(chǎn)物離子的任選進一步分段或產(chǎn)物離子的進一步反應(yīng)；離子(第一代離子或第一代或后續(xù)代產(chǎn)物離子)到質(zhì)量分析器的傳送，質(zhì)量分析器的檢測器對離子質(zhì)荷比的檢測和測量；以及從檢測和測量導(dǎo)出的數(shù)據(jù)向用于存儲、數(shù)學(xué)分析等的數(shù)字處理器的傳送。如此界定的可“實時”發(fā)生的事件或活動可包含但不一定限于：樣本中的分析物的存在的確定或識別；樣本中的微生物的存在的識別或確定；以及向用戶提供樣本中的分析物或微生物的存在的識別或確定的通知。

本發(fā)明教示的上述以及各種其它特征和優(yōu)點將從以下描述和所附權(quán)利要求書變得更完全明了，或可通過如下文闡述的本發(fā)明的實踐而習(xí)得。

附圖說明

為進一步闡明本發(fā)明的以上和其它優(yōu)點及特征，將參照附圖中說明的其特定實施例呈現(xiàn)本發(fā)明的更具體描述。應(yīng)了解，這些圖只是描繪了本發(fā)明的所說明的實施例，且因此不應(yīng)當(dāng)被看作限制了本發(fā)明的范圍。本發(fā)明將以額外特殊性和細(xì)節(jié)經(jīng)由使用隨附圖式進行描述和闡述，附圖中：

圖1是示意性地說明用于來自至少一個微生物的可溶蛋白質(zhì)的快速提取和分析以用于識別所述至少一個微生物的系統(tǒng)的框圖；

圖2是適合于與根據(jù)本發(fā)明教示的方法結(jié)合采用的示范性質(zhì)譜儀的示意性表示，所述質(zhì)譜儀包括混合系統(tǒng)，所述混合系統(tǒng)包括四極濾質(zhì)器、雙壓力四極離子阱質(zhì)量分析器和靜電阱質(zhì)量分析器；

圖3a是根據(jù)本發(fā)明教示的第一方法的流程圖；

圖3b是根據(jù)本發(fā)明教示的替代方法的流程圖；

圖3c是根據(jù)本發(fā)明教示的另一替代方法的流程圖；

圖3d和圖3e說明根據(jù)本發(fā)明教示的又一替代方法的流程圖；

圖3f是根據(jù)本發(fā)明教示的再另一替代方法的流程圖；

圖4a是經(jīng)由典型大腸桿菌提取物的直接輸注的esi質(zhì)譜；

圖4b是通過隔離以m/z＝750th為中心的2th質(zhì)量窗口內(nèi)的圖4a的大腸桿菌提取物的離子且使隔離的離子與ptr反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而產(chǎn)生的ptr產(chǎn)物離子質(zhì)譜；

圖5a是通過隔離以1200th為中心的寬度5th的質(zhì)量窗口內(nèi)的大腸桿菌提取物的離子且使隔離的離子與ptr反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而產(chǎn)生的第一代ptr產(chǎn)物離子的質(zhì)譜；

圖5b是通過隔離以1320th為中心的寬度5th的質(zhì)量窗口內(nèi)的圖5a的第一代ptr產(chǎn)物離子的離子且第二次使隔離的第一代產(chǎn)物離子與ptr反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而產(chǎn)生的第二代ptr產(chǎn)物離子的質(zhì)譜；

圖6a是通過隔離以640th為中心的寬度5th的質(zhì)量窗口內(nèi)的大腸桿菌提取物的離子且使隔離的離子與ptr反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而產(chǎn)生的ptr產(chǎn)物離子的質(zhì)譜；

圖6b是選自圖6a的產(chǎn)物離子集合且具有833th的m/z比的隔離的ptr產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；

圖6c是通過圖6b的隔離的ptr產(chǎn)物離子物質(zhì)的碰撞引發(fā)的解離(cid)產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子的質(zhì)譜；

圖6d是選自圖6a的產(chǎn)物離子集合且具有926th的m/z比的隔離的ptr產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；

圖6e是通過圖6d的隔離的ptr產(chǎn)物離子物質(zhì)的碰撞引發(fā)的解離產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子的質(zhì)譜；

圖6f是選自圖6a的產(chǎn)物離子集合且具有917th的m/z比的隔離的ptr產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；

圖6g是圖6f的隔離的ptr產(chǎn)物離子物質(zhì)的碰撞引發(fā)的解離產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子的質(zhì)譜；

圖7a是根據(jù)本發(fā)明教示的通過電噴射產(chǎn)生的第一代前驅(qū)體離子的多個m/z范圍的同時隔離和反應(yīng)進行的選定分析物的離子向ptr產(chǎn)物離子集合的改進效率的ptr轉(zhuǎn)換的方法的示意性繪圖；

圖7b是如離子的改進效率的ptr轉(zhuǎn)換方法的初始步驟中可采用的用于ptr反應(yīng)的電噴射產(chǎn)生的第一代前驅(qū)體離子的第一隨機所選范圍的隔離的示意圖；

圖7c是如可用作離子的改進效率的ptr轉(zhuǎn)換的方法的中間步驟的對應(yīng)于不同分析物分子的ptr產(chǎn)物離子的兩個電荷態(tài)序列的辨識的示意性繪圖；

圖8是根據(jù)本發(fā)明教示的選定分析物的離子向ptr產(chǎn)物離子集合的改進效率的ptr轉(zhuǎn)換的方法的流程圖；

圖9a是在大腸桿菌提取物的十分鐘梯度反相液相層析分離的過程期間在10分鐘30秒的滯留時間下從溶離液產(chǎn)生的第一代離子的全掃描質(zhì)譜；

圖9b是在以750th為中心的10th寬隔離窗口內(nèi)使六氟化硫與圖9a的樣本的隔離離子群體反應(yīng)10ms產(chǎn)生的ptr產(chǎn)物離子譜；

圖10a是在大腸桿菌提取物的六十分鐘梯度反相液相層析分離的過程期間在42分鐘30秒的滯留時間下從溶離液產(chǎn)生的第一代離子的全掃描質(zhì)譜；

圖10b是通過在以750th為中心的10th寬隔離窗口內(nèi)使六氟化硫與圖10a的樣本的隔離離子群體反應(yīng)10ms產(chǎn)生的ptr產(chǎn)物離子譜；

圖11a是在三十分鐘梯度反相液相層析分離的過程期間在18分鐘9秒的滯留時間下從溶離液產(chǎn)生的第一代離子的全掃描質(zhì)譜；

圖11b是通過在以750th為中心的10th寬隔離窗口內(nèi)ptr反應(yīng)劑離子與圖11a的樣本的隔離離子群體的反應(yīng)產(chǎn)生的ptr產(chǎn)物離子譜；

圖11c是在圖11a中標(biāo)繪了其較早溶離結(jié)果的同一三十分鐘梯度反相液相層析分離的過程期間以22分鐘27秒的滯留時間從溶離液產(chǎn)生的第一代離子的全掃描質(zhì)譜；

圖11d是通過在以750th為中心的10th寬隔離窗口內(nèi)ptr反應(yīng)劑離子與圖11c的樣本的隔離離子群體的反應(yīng)產(chǎn)生的ptr產(chǎn)物離子譜；

圖12a是展現(xiàn)良好解析層析峰的兩個分析物的簡單基于強度閾值的數(shù)據(jù)相依性質(zhì)譜分析的示意性說明；

圖12b是具有兩者均高于分析閾值的高度重疊溶離峰的層析圖的一部分的示意性說明；

圖12c是兩個同時溶離的生物聚合物分析物的多個交錯質(zhì)譜峰的圖示；

圖13是從大腸桿菌提取物的單個液相層析質(zhì)譜法實驗運行收集的一組層析圖，其包含總離子電流層析圖(頂部曲線)并且還說明貢獻于總離子電流的各種提取離子層析圖(下部曲線)，每一提取離子層析圖表示相應(yīng)的m/z比范圍；

圖14是根據(jù)本發(fā)明教示的各種方法采用的一般步驟集合的流程圖；

圖15是根據(jù)本發(fā)明教示的將以實驗方式測得的質(zhì)譜質(zhì)心轉(zhuǎn)換為占用陣列的方法的流程圖，所述陣列具有通過囊封于矩陣中的電荷態(tài)而彼此相關(guān)的索引；

圖16是根據(jù)本發(fā)明教示的用于從以實驗方式確定的質(zhì)譜質(zhì)心數(shù)據(jù)在數(shù)學(xué)變換質(zhì)荷比空間內(nèi)構(gòu)造布爾型占用陣列的方法的流程圖；

圖17a和接續(xù)的圖17b是根據(jù)本發(fā)明教示的用于為多個以實驗方式確定的質(zhì)譜質(zhì)心指派試驗性電荷態(tài)的方法的流程圖；

圖18是根據(jù)本發(fā)明教示的用于調(diào)整先前嘗試性地指派的電荷態(tài)的集合以使得所得最終經(jīng)指派電荷態(tài)自一致的方法的流程圖；

圖19是根據(jù)本發(fā)明教示的用于將具有經(jīng)指派電荷態(tài)的以實驗方式確定的質(zhì)心的集合分解為分析物特定群集的方法的流程圖；

圖20a和接續(xù)的圖20b、20c和20d是展示典型分子量、最充足同位素中的c¹³原子的預(yù)期數(shù)目(模式)、所有同位素當(dāng)中的c¹³原子的預(yù)期平均數(shù)以及預(yù)期平均數(shù)與模式之間的差，因為它們隨著蛋白質(zhì)中的c¹²原子的總數(shù)變化；

圖21a、21b、21c和21d是計算機屏幕用戶接口的繪圖，其可與對采用根據(jù)本發(fā)明教示的方法的計算機軟件的用戶控制和來自所述計算機軟件的信息顯示相結(jié)合；

圖22a是說明如由采用根據(jù)本發(fā)明教示的方法的計算機軟件產(chǎn)生的峰群集分解結(jié)果的計算機屏幕信息顯示的描述，其是從由細(xì)胞色素c、溶菌酶、肌血球素、胰蛋白酶抑制劑和碳酸酐酶組成的五組分蛋白質(zhì)混合物的質(zhì)譜所計算；

圖22b是說明如由采用根據(jù)本發(fā)明教示的方法的計算機軟件產(chǎn)生的峰群集分解結(jié)果的計算機屏幕信息顯示的描述，所述顯示說明圖22a中所示的分解結(jié)果的擴展部分；

圖22c是說明如由采用根據(jù)本發(fā)明教示的方法的計算機軟件產(chǎn)生的峰群集分解結(jié)果的計算機屏幕信息顯示的描述，所述顯示說明圖12b中所示的分解結(jié)果的甚至進一步擴展部分；

圖23a是說明如由采用根據(jù)本發(fā)明教示的方法的計算機軟件產(chǎn)生的峰群集分解結(jié)果的計算機屏幕信息顯示的描述，所述顯示說明從直接灌注到質(zhì)譜儀中的細(xì)菌大腸桿菌的粗提取物的單級質(zhì)譜計算的峰群集分解結(jié)果；

圖23b是說明如由采用根據(jù)本發(fā)明教示的方法的計算機軟件產(chǎn)生的峰群集分解結(jié)果的計算機屏幕信息顯示的描述，所述顯示說明圖23a中所示的分解結(jié)果的擴展部分；

圖23c是圖23a-23b中展示其峰群集分解的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的描述，展示如由常規(guī)質(zhì)譜峰分析計算機程序提供的峰位置和電荷態(tài)指派；

圖23d是圖23a-23b中展示其峰群集分解的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的描述，展示如由根據(jù)本發(fā)明教示的方法提供的電荷態(tài)指派；

圖24a是具有變化程度的糖基化的完整抗體的質(zhì)譜的描述(主繪圖)，還展示(插圖)說明所述抗體的不同糖型的譜的擴展部分；

圖24b是說明如由采用根據(jù)本發(fā)明教示的方法的計算機軟件產(chǎn)生的峰群集分解結(jié)果的計算機屏幕信息顯示的描述，其是從圖24a中所示的質(zhì)譜數(shù)據(jù)計算，展示范圍從148378da到148763da的抗體的四個經(jīng)分解糖型的計算的分子量；

圖25a是由在m/z＝807.00da處發(fā)生的蛋白質(zhì)的+26電荷態(tài)的碰撞引發(fā)的解離產(chǎn)生的蛋白質(zhì)碳酸酐酶ii的ms²譜的描述，展示如由常規(guī)質(zhì)譜分析方法所確定的峰指派；

圖25b是說明如由采用根據(jù)本發(fā)明教示的方法的計算機軟件產(chǎn)生的峰群集分解結(jié)果的計算機屏幕信息顯示的描述，其是從圖25a中所示的ms²質(zhì)譜數(shù)據(jù)計算；

圖25c是由在m/z＝1001.00da處的蛋白質(zhì)的+21電荷態(tài)的碰撞引發(fā)的解離產(chǎn)生的蛋白質(zhì)碳酸酐酶ii的第二ms²譜的描述，展示如由常規(guī)質(zhì)譜分析方法所確定的峰指派；以及

圖25d是說明如由采用根據(jù)本發(fā)明教示的方法的計算機軟件產(chǎn)生的峰群集分解結(jié)果的計算機屏幕信息顯示的描述，其是從圖25c中所示的ms²質(zhì)譜數(shù)據(jù)計算。

具體實施方式

呈現(xiàn)以下描述以使得所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠制作并使用本發(fā)明，并且在特定應(yīng)用以及其要求的背景下提供以下描述。對于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，對所描述的實施例的各種修改將是顯而易見的，并且本文中的通用原理可以應(yīng)用到其它實施例。因此，本發(fā)明并不希望限于所示的實施例和實例，而是應(yīng)被賦予根據(jù)權(quán)利要求書的最廣可能的范圍。本發(fā)明的特定特征和優(yōu)點將與本文檔的主體中的以下描述結(jié)合參考附圖1到11d以及與本文檔的附錄中的描述結(jié)合的圖12a到25d變得更顯而易見。

現(xiàn)參看圖1，示意性地說明用于從一或多種微生物提取蛋白質(zhì)、檢測所述蛋白質(zhì)且識別所述一或多種微生物的系統(tǒng)100。系統(tǒng)100包含樣本處置裝置115、可由樣本處置裝置115接達的樣本110，以及反應(yīng)劑、緩沖劑及類似物的源120，這些源通過各種管道或其它傳輸線流體地耦合到樣本處置裝置115。系統(tǒng)100進一步包含第一以及任選地第二樣本純化裝置135(例如固相萃取盒)，其經(jīng)配置以用于清潔樣本(例如，去鹽、移除污染物、聚集蛋白質(zhì))，以及任選的層析柱140，其可經(jīng)配置以用于通過在質(zhì)譜分析之前的液相層析而至少部分地純化樣本110。至少一個樣本純化裝置135可包括直列式尺寸排阻層析柱，其可用以不僅移除鹽而且還移除小分子和脂質(zhì)。樣本110、第一和任選的第二樣本純化裝置135以及任選的層析柱140與流體處置泵130、各種反應(yīng)劑、緩沖劑和其它流體120以及質(zhì)譜儀150成流體連通。

樣本處置裝置115能夠準(zhǔn)備含有一或多種微生物的某一范圍的樣本類型，且將從所述微生物提取的可溶蛋白質(zhì)部分遞送到質(zhì)譜儀150用于分析。樣本110可為疑似含有一或多種微生物的任何類型，包含但不限于來自培養(yǎng)基板的隔離的群落、來自液體生長介質(zhì)的細(xì)胞、血液、血培養(yǎng)基、唾液、尿、糞便、痰液、傷口和身體部位棉簽、土壤、食物、飲料、水、空氣以及環(huán)境表面棉簽。

樣本處置裝置115可包含細(xì)胞中斷構(gòu)件、機器人液體處置構(gòu)件、離心機、過濾構(gòu)件、孵育箱、混合構(gòu)件、真空泵、流體泵以及反應(yīng)劑120中的一或多者，其可用于微生物的中斷以及可溶蛋白質(zhì)部分的隔離。細(xì)菌、真菌、霉?jié){菌細(xì)胞、病毒及類似物的中斷可通過機械、化學(xué)、酶和其它方式實現(xiàn)，如此項技術(shù)中通常已知。機械方法包含打珠、例如french壓機及類似物的壓力的使用、超聲處理或此項技術(shù)中已知的其它方法?；瘜W(xué)方法包含暴露于例如尿素、硫脲或胍hcl等離液劑以使微生物細(xì)胞裂解且溶解其內(nèi)含物。替代地，有機酸/溶劑混合物可用來破壞細(xì)胞。酶方法包含使用溶菌酶、溶葡球菌酶或其它裂解酶類以在細(xì)菌細(xì)胞壁中形成“孔”，其允許內(nèi)含物滲出到周圍溶液中。

如圖1中所說明，系統(tǒng)100進一步包含任選的控制單元160，其可通過聯(lián)動裝置170a-170d鏈接到系統(tǒng)100的各種組件。舉例來說，控制單元160可鏈接到樣本110以控制樣本施加，鏈接到反應(yīng)劑120以控制各種反應(yīng)劑的施加，鏈接到泵130以控制流體處置、流動速率等，鏈接到樣本處置裝置115以控制樣本準(zhǔn)備，且鏈接到質(zhì)譜儀150以控制質(zhì)譜法參數(shù)。在所說明的實施例中，控制單元160也可充當(dāng)數(shù)據(jù)處理單元以例如處理來自質(zhì)譜儀150的數(shù)據(jù)，或?qū)?shù)據(jù)轉(zhuǎn)發(fā)到服務(wù)器以用于處理和存儲(圖1中未圖示服務(wù)器)。控制單元160也可實時確定ptr產(chǎn)物離子的任何產(chǎn)生的分子量和電荷態(tài)以用于ms/ms、msⁿ或分子量確定?？刂茊卧?60也可用以將結(jié)果自動轉(zhuǎn)發(fā)到醫(yī)療保健專業(yè)人士。

在一些實施例中，系統(tǒng)100經(jīng)設(shè)計以由臨床醫(yī)生或一般實驗室技術(shù)員使用，其不一定在樣本準(zhǔn)備、lc-ms操作、lc-ms方法開發(fā)及類似等所有方面中都有專業(yè)技能。因此，控制單元160可經(jīng)設(shè)計以通過為用戶提供簡化應(yīng)用程序接口而囊封數(shù)據(jù)系統(tǒng)環(huán)境，所述應(yīng)用程序接口可用以起始且監(jiān)視測定樣本110的基本上所有方面而不需要用戶與系統(tǒng)100的總體硬件和控制系統(tǒng)交互?？刂茊卧?60因此經(jīng)配置以提供用戶與控制著裝置、數(shù)據(jù)文件和用于將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為用戶可讀形式的算法的底層服務(wù)之間的分離程度。即，控制單元160使得用戶不需要知道或控制硬件以用于分析臨床樣本，且提供簡化接口以從質(zhì)譜儀發(fā)送和接收信息。

控制單元160可經(jīng)配置以內(nèi)部地監(jiān)視每一樣本分析請求，且能夠通過系統(tǒng)100始終跟蹤分析請求。一旦系統(tǒng)100正在獲取或已經(jīng)獲取樣本110的數(shù)據(jù)，則控制單元160可經(jīng)配置以基于由用戶選擇的測定類型而自動開始后處理數(shù)據(jù)。最重要的是，控制單元160可經(jīng)配置以在獲取過程期間實時處理數(shù)據(jù)。此處實時地將結(jié)果返回到用戶，其包含微生物識別、毒性和抗性表征、菌株匹配信息，以及關(guān)于抗生素易感性測試的數(shù)據(jù)。此外，控制單元160可經(jīng)配置以基于由用戶選擇的測定類型而自動選擇后處理參數(shù)，從而一旦測定已選定且開始用于分析則進一步減少用戶與系統(tǒng)交互的需要?？刂茊卧?60可被設(shè)計為配合于系統(tǒng)100與用戶之間的層，以減少設(shè)置樣本測定以用于獲取所需的復(fù)雜性?？刂葡到y(tǒng)160還可經(jīng)配置以僅將最相關(guān)數(shù)據(jù)返回到用戶以避免用戶接收太多的額外信息。

在一個實施例中，系統(tǒng)100可進一步包含可操作地耦合到樣本處置裝置115或與其集成的樣本檢測裝置(未圖示)。所述樣本檢測裝置可與樣本處置裝置115一起工作或獨立于樣本處置裝置115而執(zhí)行以下功能中的至少一者：i.識別進入系統(tǒng)的樣本；ii.識別用于進入系統(tǒng)的樣本的測定類型；iii.基于預(yù)期測定類型和/或所關(guān)注的分析物而選擇測定協(xié)議；iv.引導(dǎo)樣本處置裝置和/或控制系統(tǒng)以起始對樣本中所關(guān)注的分析物的分析；v.引導(dǎo)控制系統(tǒng)基于針對測定類型和/或所關(guān)注的分析物選定的測定協(xié)議而選擇一或多種反應(yīng)劑；vi.引導(dǎo)控制系統(tǒng)基于針對測定類型和/或所關(guān)注的分析物選定的測定協(xié)議而選擇液相層析移動相條件，且致使液相層析系統(tǒng)執(zhí)行測定和/或純化所關(guān)注的分析物；vii.引導(dǎo)控制系統(tǒng)基于針對測定類型和/或所關(guān)注的分析物選定的測定協(xié)議而選擇質(zhì)譜儀設(shè)定，且致使質(zhì)譜儀產(chǎn)生與選定測定類型和/或所關(guān)注的分析物相關(guān)聯(lián)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)；以及viii.引導(dǎo)控制系統(tǒng)分析與選定測定類型和/或所關(guān)注的分析物相關(guān)聯(lián)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)以識別所關(guān)注的分析物的存在和/或濃度。

樣本或經(jīng)處理樣本可在質(zhì)譜法的分析之前經(jīng)凈化和或純化。此純化或樣本凈化可指代從粗細(xì)胞提取物移除鹽或脂質(zhì)的程序，或使所關(guān)注的一或多種分析物相對于樣本的一或多種其它組分變豐富的程序。其也可指代具有用于處置分枝桿菌或絲狀真菌的生物安全三級機構(gòu)的單獨實驗室中的樣本處理和凈化。在此實施例中，樣本傳送到系統(tǒng)且可如先前所描述進行分析。在一個實施例中，此純化或樣本凈化可通過固相萃取裝置、直列式尺寸排阻層析和/或任選的層析柱140實現(xiàn)。

在一個實施例中，第一和/或第二樣本純化裝置135可包含固相萃取(spe)盒。在一些實施例中，spe盒可直接與高分辨率/高質(zhì)量準(zhǔn)確性質(zhì)譜儀150成直列式。在一個實施例中，spe盒可為具有具有小體積的二氧化硅或其它吸附劑的聚丙烯尖端，其含有固定于盒中的鍵合的c4、c8或c18或其它官能團，例如stagetip^tm盒(thermofisherscientific)。在替代實施例中，可使用聚合吸附劑或螯合劑。床體積可小達1μl或更小，但也可以使用較大體積。所述設(shè)備和方法良好地適合于從微生物細(xì)胞導(dǎo)出的復(fù)雜樣本，因為每一spe盒僅使用一次，從而使從一個樣本到另一樣本的殘留問題最小化。

在一個實施例中，樣本純化裝置135可為直列式尺寸排阻層析柱，其經(jīng)設(shè)計以從樣本110移除鹽、小分子和脂質(zhì)。所述方法還可用以分離媒介與大分子量蛋白質(zhì)。將相選擇為與部分(即，少于100％)有機溶液和有機酸相容。相可適應(yīng)分子量從10³到10⁸da不同的蛋白質(zhì)尺寸分布。實時經(jīng)調(diào)流動速率以實現(xiàn)完整蛋白質(zhì)從小分子的分離，其中分離流動速率通常比用以從系統(tǒng)移除小分子、脂質(zhì)和鹽的較高流動速率小得多。在此實施例中，樣本純化裝置135也可以經(jīng)加熱以促進完整蛋白質(zhì)的較快擴散速率，因此顯著縮短運行時間。移動相通過樣本純化裝置135的流動也可以在凈化過程的一部分期間分流，以從流動的流移除某些雜質(zhì)且防止其進入質(zhì)譜儀150。

在一個實施例中，任選的層析柱140可包含經(jīng)配置以用于樣本中的蛋白質(zhì)的至少部分層析分離的柱。層析柱中的固定相可為多孔或非多孔的二氧化硅或瓊脂糖顆粒，或所述柱內(nèi)部聚合或另外形成的單塊材料。所述固定相可涂覆有適當(dāng)材料，例如c18、c8、c4或另一合適的衍生物，或含有陽離子交換劑或其它材料，或以上的組合以促進蛋白質(zhì)的分離，且此材料可以化學(xué)方式鍵合到顆粒或在所述柱內(nèi)為單塊的。顆粒大小通常在1.5μm到30μm的范圍內(nèi)變化?？讖娇梢栽?0到300埃的范圍內(nèi)變化。柱的內(nèi)徑通常在50μm到2.1mm的范圍內(nèi)變化，且柱長度在約0.5cm到25cm的范圍內(nèi)或以其它方式變化。移動相或溶離劑可為純?nèi)軇┗蛘邇煞N或更多種溶劑的混合物，且可含有添加的鹽、酸和/或其它化學(xué)改質(zhì)劑。蛋白質(zhì)基于一或多個生理化學(xué)性質(zhì)在柱上分離，包含大小、凈電荷、疏水性、親和力或其它生理化學(xué)性質(zhì)。層析分離方法包含離子交換、尺寸排阻、hilic、疏水性交互、親和力、正常相或反向相層析法中的一或多者。

純化樣本的額外方法可包含(不限于)液相層析、hplc、uhplc、沉淀、固相萃取、液-液提取、透析、親和力捕獲、電泳、過濾、超過濾或此項技術(shù)中已知用于純化的其它合適的方法。

已經(jīng)描述涉及在質(zhì)譜法分析之前使用hplc用于樣本凈化的各種方法。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可選擇適合于在本發(fā)明中使用的hplc儀器和柱。層析柱通常包含媒介(即，填充材料)以在空間和時間上促進化學(xué)部分的分離。所述媒介可包含極小顆粒，其可具有與各種化學(xué)部分交互以促進所關(guān)注的分析物的分離的鍵合表面。一個合適的鍵合表面是疏水性鍵合表面，例如烷基鍵合表面。烷基鍵合表面可包含c4、c8或c18鍵合烷基。另外，也可以使用現(xiàn)有技術(shù)水平中已知的單塊和其它相。層析柱包含用于接收樣本的入口端口以及用于排放包含部分分離樣本的流出物的出口端口。舉例來說，測試樣本可在入口端口處施加于柱，以溶劑或溶劑混合物溶離，且在出口端口處排放。在另一實例中，多于一個柱可循序地使用或作為二維(2d)層析法系統(tǒng)，其中測試樣本可在入口端口處施加于第一柱，以溶劑或溶劑混合物溶離到第二柱上，且以溶劑或溶劑混合物從所述第二柱溶離到出口端口。可選擇不同溶劑模式用于溶離分析物。舉例來說，可使用梯度模式、等度模式或多型(即混合)模式執(zhí)行液相層析。

圖2是可用作圖1的質(zhì)譜儀150的示范性質(zhì)譜儀150a的示意性繪圖。在圖2中說明的質(zhì)譜儀是混合質(zhì)譜儀，包括多于一個類型的質(zhì)量分析器。具體地說，質(zhì)譜儀150a包含離子阱質(zhì)量分析器216以及orbitrap^tm分析器，其為一類靜電阱質(zhì)量分析器。如下文將描述，由于根據(jù)本發(fā)明教示的各種分析方法采用多次質(zhì)量分析數(shù)據(jù)采集，因此混合質(zhì)譜儀系統(tǒng)可有利地用以通過同時使用兩個或更多個分析器而改善工作循環(huán)。orbitrap^tm質(zhì)量分析器212采用鏡像電荷檢測，其中通過借助離子阱內(nèi)的離子的運動檢測電極上引起的鏡像電流而間接檢測離子。

在質(zhì)譜儀150a的操作中，電噴射離子源201提供待分析的樣本的離子到撇渣器202的孔隙，在此處離子進入第一真空腔室。在進入之后，由堆疊環(huán)離子導(dǎo)向器204將離子捕獲且聚焦為密集束。第一離子光學(xué)傳送組件203a將束傳送到下游的質(zhì)譜儀的高真空區(qū)。大多數(shù)剩余的中性分子和不合意的高速度離子群集(例如溶合離子)通過彎曲束導(dǎo)向器206從離子束分離。中性分子和離子群集跟隨直線路徑，而所關(guān)注的離子由曳力場引起彎曲約九十度轉(zhuǎn)彎，從而產(chǎn)生分離。

質(zhì)譜儀150a的四極濾質(zhì)器208在其常規(guī)意義上用作可調(diào)諧的濾質(zhì)器以便僅在選定窄的m/z范圍內(nèi)使離子通過。后續(xù)離子光學(xué)傳送組件203b將經(jīng)過濾離子遞送到彎曲四極離子阱(“c阱”)組件210。c阱210能夠沿著四極濾質(zhì)器208與離子阱質(zhì)量分析器216之間的路徑傳送離子。c阱210也具有臨時收集且存儲離子群體并且然后將離子作為脈沖或包遞送到orbitrap^tm質(zhì)量分析器212中的能力。離子包的傳送是通過在c阱210與安置于c阱210和orbitrap^tm質(zhì)量分析器212之間的一組注入電極211之間施加電位差來控制。c阱的曲率經(jīng)設(shè)計以使得離子群體在空間上聚焦以便匹配orbitrap^tm質(zhì)量分析器212的入口孔徑的接受角。

多極離子導(dǎo)向器214和光學(xué)傳送組件203b用來在c阱210與離子阱質(zhì)量分析器216之間導(dǎo)引離子。多極離子導(dǎo)向器214提供臨時離子存儲能力以使得在分析方法的第一處理步驟中產(chǎn)生的離子可稍后被取得以用于后續(xù)步驟中的處理。多極離子導(dǎo)向器214也可充當(dāng)分段單元。沿著c阱210與離子阱質(zhì)量分析器216之間的路徑的各種柵電極是可控的，以使得離子可在任一方向上傳送，這取決于任何特定分析方法中所需的離子處理步驟的序列。

離子阱質(zhì)量分析器216是雙壓力線性離子阱(即，二維阱)，其包括高壓線性阱單元217a和低壓線性阱單元217b，所述兩個單元定位成鄰近于彼此，通過具有小孔隙的板透鏡分隔開，所述小孔隙準(zhǔn)許所述兩個單元之間的離子傳送且呈現(xiàn)泵送限制并允許在所述兩個阱中維持不同的壓力。高壓單元217a的環(huán)境有利于離子冷卻、通過碰撞引起的解離或電子轉(zhuǎn)移解離的離子分段，或例如質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)等離子-離子反應(yīng)。低壓單元217b的環(huán)境有利于以高分辨力和質(zhì)量準(zhǔn)確性進行分析掃描。低壓單元包含雙倍增極離子檢測器215。

質(zhì)量分析方法內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移解離或質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的步驟的使用需要在質(zhì)譜儀內(nèi)引起受控離子-離子反應(yīng)的能力。離子-離子反應(yīng)又需要產(chǎn)生反應(yīng)劑離子以及致使反應(yīng)劑離子與樣本離子混合的能力。如圖2中所描繪的質(zhì)譜儀150a說明兩個替代的反應(yīng)劑離子來源，第一反應(yīng)劑離子源299a安置于堆疊環(huán)離子導(dǎo)向器204與彎曲束導(dǎo)向器206之間，且第二反應(yīng)劑離子源299b安置在儀器的相對端，鄰近于線性離子阱質(zhì)量分析器216的低壓單元217b。大體上，任何特定系統(tǒng)將至多僅包含一個反應(yīng)劑離子源。然而，此處為了說明性目的而描繪且論述兩個不同反應(yīng)劑離子源。雖然以下論述是針對用于ptr的反應(yīng)劑離子源，但類似論述可應(yīng)用于etd反應(yīng)劑離子源。

第一可能的反應(yīng)劑離子源299a可位于堆疊環(huán)離子導(dǎo)向器204與彎曲束導(dǎo)向器206之間。反應(yīng)劑離子源299a包括輝光放電單元，其包括暴露于反應(yīng)劑氣體導(dǎo)管298a的一對電極(陽極和陰極)，所述反應(yīng)劑氣體導(dǎo)管從具有使反應(yīng)劑化合物揮發(fā)的加熱器的反應(yīng)劑液體(或固體)儲集器297a遞送反應(yīng)劑氣體。當(dāng)跨電極施加高電壓時，起始輝光放電，其使在電極之間流動的反應(yīng)劑電離。來自輝光放電源的反應(yīng)劑陰離子被引入到在四極濾質(zhì)器208前方的離子光學(xué)元件路徑，在其內(nèi)它們可進行m/z選擇。反應(yīng)劑離子接著可在多極離子導(dǎo)向器214中積聚，且隨后傳送到雙壓力線性離子阱216的高壓單元217b中，在其內(nèi)使得它們可用于ptr反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物可直接傳送到低壓力單元217a或orbitrap^tm質(zhì)量分析器212用于m/z分析。

可能的替代反應(yīng)劑離子源299a可鄰近于低壓力線性阱單元217b定位，在此其可包括額外高真空腔室292，反應(yīng)劑離子可以從所述高真空腔室通過腔室292與高壓單元之間的孔隙而引導(dǎo)到高壓力單元217b中。在操作中，氣態(tài)反應(yīng)劑化合物從具有使反應(yīng)劑化合物揮發(fā)的加熱器的反應(yīng)劑液體(或固體)儲集器297b供應(yīng)，且被引導(dǎo)通過反應(yīng)劑氣體導(dǎo)管298b，所述反應(yīng)劑氣體導(dǎo)管將反應(yīng)劑氣體遞送到部分地被限制的離子產(chǎn)生體積296中。在操作中，從電加熱長絲294供應(yīng)的熱離子電子通過在長絲294與加速器電極(未圖示)之間施加電位而以某一預(yù)定能量引導(dǎo)到離子產(chǎn)生體積296中。供應(yīng)的高能電子造成反應(yīng)劑氣體的電離以便產(chǎn)生反應(yīng)劑離子。反應(yīng)劑離子接著可在柵電極(未圖示)的操作下由離子光學(xué)傳送組件203a導(dǎo)引到高壓單元217b中。

根據(jù)本發(fā)明教示的示范性方法在圖3a到3f中所示的流程圖中示意性地說明。圖3a示意性地說明用于監(jiān)視生物樣本中的某些特定目標(biāo)分析物蛋白質(zhì)或肽的存在且任選地對其進行量化的第一此類示范性方法方法300。舉例來說，所述樣本可為微生物的樣本。方法300的初始步驟302、304和306分別是細(xì)胞裂解(如果所述樣本是微生物或其它細(xì)胞的樣本)和提取、固相凈化或尺寸排阻層析和層析分離的步驟，如上文所描述。步驟302可僅在所述樣本包括組織樣本、細(xì)菌細(xì)胞樣本、另一微生物的細(xì)胞樣本或另一形式的細(xì)胞樣本的情況下適用。在一些實驗情形中，可在后續(xù)樣本引入步驟308中將所提取樣本直接灌注到質(zhì)譜儀中，因此，步驟304和306由虛線展示為任選的。也可以使用離線方法制備樣本，包含透析或現(xiàn)有技術(shù)水平中已知的其它技術(shù)。然而，在許多其它實驗情形中，步驟304和306是有用的以便在質(zhì)譜分析之前至少部分地純化樣本。

當(dāng)必須根據(jù)時間約束完成分析時，如一些臨床應(yīng)用中，分析所需的時間可通過采用spe步驟304(如發(fā)明人enke的u.s.5,175,430中所描述的時間壓縮層析法步驟)或如國際(pct)專利申請公開案wo2013/166169a1中所描述的層析法步驟306中的“快速部分層析分離”(fpcs)的方法而縮短。大體上，在執(zhí)行fpcs中，含有各種有機和無機分析物的復(fù)雜混合物的微生物細(xì)胞的粗提取物(小有機分子、蛋白質(zhì)及其天然產(chǎn)生片段、脂質(zhì)、核酸、多糖、脂蛋白等)加載于層析柱上且經(jīng)受層析法。然而，并非允許梯度來單獨地溶離每一分析物(理想地，每層析峰一種分析物)，而是有意加速所述梯度以使得在例如近似八分鐘或更短時間內(nèi)、且優(yōu)選地五分鐘或更短時間內(nèi)大體上不獲得層析峰，而不是獲得基線分離原本將需要的長得多的運行時間。在fpcs分離中，許多分析物是根據(jù)其性質(zhì)以及使用的層析法的類型(反相、hilic等)而在任何給定時間從柱有意地共溶離。部分或不完全分離也可通過所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它方法實現(xiàn)，包含但不限于減少化合物在柱上的保持的移動相溶劑和/或改質(zhì)劑的使用，減少化合物在柱上的保持的固定相媒介的選擇(包含粒度、微孔尺寸等)，層析系統(tǒng)以較高流動速率的操作，層析系統(tǒng)以高溫的操作，或不同層析分離模式(即，反相、尺寸排阻等)的選擇。fpcs技術(shù)產(chǎn)生很少或可能不產(chǎn)生跨越整個梯度的解析層析峰。因此，從層析圖導(dǎo)出的大體上僅相關(guān)信息是從柱的溶離時間。記錄的每一質(zhì)譜表示共溶離分析物的“子集”，其隨后經(jīng)電離、在質(zhì)量分析器中分離且被檢測。

在步驟308(圖3a)中，將樣本引入到質(zhì)譜儀中。所述樣本可提供為從spe盒、層析法設(shè)備或替代地通過溶離液溶液的直接輸注而出現(xiàn)的溶離液材料。在提供到質(zhì)譜儀后，通過質(zhì)譜儀的電噴射電離源將樣本化合物電離(步驟308)。這些電噴射產(chǎn)生的離子在本文稱為“第一代”離子。在此時，可任選地執(zhí)行完整或分段ms¹掃描(步驟309)以便識別m/z空間中的富蛋白質(zhì)區(qū)。(應(yīng)注意在本文檔中，可采用術(shù)語“掃描”來當(dāng)用作名詞時一般指代質(zhì)譜，或替代地當(dāng)用作動詞時指代質(zhì)譜的獲取)。在優(yōu)選實施例中，可在質(zhì)譜儀儀器的完整質(zhì)量范圍上獲得ms¹掃描以便能夠隨后以數(shù)據(jù)相依或獨立方式選擇譜的富信息部分以用于隔離(步驟310)。然而，在目標(biāo)分析的情況下，ms¹掃描可能是不必要的，且方法300的執(zhí)行可直接繼續(xù)到步驟310，其中隨后隔離離子的子集以用于進一步反應(yīng)和分析。當(dāng)采用目標(biāo)分析時，在步驟310中執(zhí)行的隔離可以使得某一預(yù)定m/z范圍或可能多個預(yù)定m/z范圍內(nèi)的離子被保持以用于后續(xù)反應(yīng)和分析，而一或多個預(yù)定m/z范圍外的離子被丟棄。預(yù)定m/z范圍經(jīng)選擇以便對應(yīng)于目標(biāo)分析物蛋白質(zhì)或肽的優(yōu)選地已知m/z比，在方法的執(zhí)行中檢測或監(jiān)視所述目標(biāo)分析物蛋白質(zhì)或肽的存在或數(shù)量。

大體上，可以已知方式通過將來自離子源的離子引入到離子阱(例如三維離子阱、彎曲離子阱(有時稱為“c阱”)、單片段線性離子阱、多分段線性離子阱、多極離子導(dǎo)向器或四極濾質(zhì)器)中，并且然后通過跨離子阱的電極對施加補充ac電壓或施加適當(dāng)rf/dc電壓比以隔離所關(guān)注的離子群體而共振地噴出m/z比在所希望范圍之外的離子，來執(zhí)行步驟310的隔離。在一些實施例中，補充電壓的頻率可掃過各種頻率以使得離子根據(jù)其m/z比按順序噴出。在此些情況下，可在離子噴出時檢測離子以便產(chǎn)生離子的原始集合的質(zhì)譜。然而，由于在此階段可能不需要質(zhì)譜，因此可替代地施加補充ac電壓作為疊加頻率的組合，其經(jīng)選擇以便造成m/z比在所希望范圍之外的離子的基本上同時排出。在一些實施例中，疊加頻率的組合可具備遺失頻率的多個片段(即，“缺口”)以使得包括兩個或更多個非鄰接m/z比范圍的離子在阱內(nèi)同時隔離。非鄰接m/z比范圍中的每一個可對應(yīng)于相應(yīng)唯一目標(biāo)分析物蛋白質(zhì)或肽的優(yōu)選地已知m/z比。四極濾質(zhì)器的施加rf/dc電壓比率也可用以隔離所關(guān)注的經(jīng)界定或目標(biāo)質(zhì)量范圍。第一代離子的特定m/z范圍是通過單個或一系列固定rf/dc電壓比率而選擇以便選擇適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量隔離窗口。在此情況下采用的起作用的配置可為混合質(zhì)譜儀儀器，其包括四極、c阱、orbitrap^tm質(zhì)量分析器以及高能量碰撞池(hcd)，其中隔離的離子群體可存儲在c阱或hcd池中用于ptr實驗。第一代離子的隔離群體在本文稱為“前驅(qū)體”離子，因為這些離子將經(jīng)受后續(xù)離子-離子反應(yīng)或分段。

在優(yōu)選實施例中，前驅(qū)體離子群體的隔離可在分段線性離子阱的第一片段中執(zhí)行。在所需離子群體的隔離之后，多電荷蛋白質(zhì)離子群體可有利地移動到線性離子阱的另一片段。這些步驟可在ptr過程之前針對前驅(qū)體離子的隔離的經(jīng)界定范圍重復(fù)多次。

接著，使用具有化學(xué)電離的基于錸的長絲或輝光放電電離源從合適的基于高電子親和性的氣態(tài)反應(yīng)劑產(chǎn)生陰離子?？墒褂玫獨狻⒓淄?、異丁烷或現(xiàn)有技術(shù)水平中的其它已知氣體執(zhí)行化學(xué)電離。陰離子反應(yīng)劑可為在室溫下的氣體，或可為具有足夠蒸氣壓力以產(chǎn)生過量陰離子的液體，所述過量陰離子將在偽一級反應(yīng)條件下驅(qū)動ptr過程。陰離子隨后從源區(qū)傳送到分段線性阱，借此使用如上文所描述的補充ac電壓使特定陰離子反應(yīng)劑質(zhì)量隔離。陰離子源可與電噴射源成直列式或安裝在分段線性離子阱的相對端上。替代地，四極濾質(zhì)器也可執(zhí)行陰離子隔離，其中后續(xù)ptr過程在儀器的c阱或hcd池中發(fā)生。

在方法300(圖3a)的步驟312中，在步驟310中經(jīng)質(zhì)量隔離的離子(即，“前驅(qū)體”離子)經(jīng)受質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，其中反應(yīng)劑陰離子物質(zhì)在指定時間周期中與離子阱中的樣本前驅(qū)體離子反應(yīng)以便從前驅(qū)體陽離子提取質(zhì)子。在一個實施例中，通過調(diào)整分段線性離子阱的dc電壓偏移以便存儲多電荷正離子與單電荷陰離子以促進ptr過程，而使多電荷前驅(qū)體離子群體與單電荷陰離子群體反應(yīng)。反應(yīng)劑陰離子經(jīng)選擇以使得在此實例中反應(yīng)劑陰離子表現(xiàn)為堿，且使得前驅(qū)體離子表現(xiàn)為一或多種酸。反應(yīng)劑陰離子是通過具有足夠蒸氣壓力的合適的反應(yīng)劑氣體/液體的單獨電離而形成，其包含(但不限于)六氟化硫、全氟-1,3-二甲基環(huán)己烷、全氟萘烷以及全氟菲烷。在允許反應(yīng)繼續(xù)指定時間之后，跨越離子阱的電極施加補充ac電壓以便排出反應(yīng)劑陰離子，從而在離子阱內(nèi)留下產(chǎn)物離子并且可能留下一些殘余前驅(qū)體離子。

在相反極性實驗中，從蛋白質(zhì)或其它生物分子導(dǎo)出的多電荷陰離子也可與單電荷陽離子反應(yīng)?？刹捎枚喾N源來產(chǎn)生單電荷陽離子，包含電子、化學(xué)和電噴射電離過程。這些反應(yīng)遵循先前描述的相同反應(yīng)動力學(xué)。典型反應(yīng)劑陽離子包含吡啶、苯并(f)喹諾酮以及惰性氣體氬和氙。另外，相反極性的多電荷蛋白質(zhì)也已反應(yīng)，以及來自核酸的多電荷陰離子與蛋白質(zhì)的多電荷陽離子也已反應(yīng)。

在方法300(圖3a)的步驟314中，從在所關(guān)注的m/z比的完整范圍中保持于離子阱中的來自ptr過程的產(chǎn)物離子獲得質(zhì)譜?？捎靡阎绞酵ㄟ^按其m/z比次序檢測從3d或線性離子阱循序地噴出的離子而獲得質(zhì)譜。替代地，可將離子引導(dǎo)到質(zhì)譜儀的不同質(zhì)量分析器，例如飛行時間(tof)質(zhì)量分析器或orbitrap^tm型靜電阱質(zhì)量分析器，以用較大準(zhǔn)確性或質(zhì)量分辨率進行分析，隨后通過離子阱的順序掃描而可用。此外，通過將產(chǎn)物離子引導(dǎo)到單獨分析器，在正執(zhí)行質(zhì)量分析時可以對離子阱重新填充前驅(qū)體離子的新樣本。如果準(zhǔn)確質(zhì)量分析器是檢測由離子阱內(nèi)的循環(huán)離子運動產(chǎn)生的鏡像電流的類型，例如ft-icr質(zhì)量分析器或orbitrap^tm質(zhì)量分析器，那么ptr反應(yīng)步驟可有利地減少目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽分子的碰撞橫截面，以使得這些分子在阱中保持穩(wěn)定足夠的時間長度以產(chǎn)生高質(zhì)量質(zhì)譜。并且，ptr產(chǎn)物離子當(dāng)在其傳送到orbitrap^tm質(zhì)量分析器后離開高壓力c阱區(qū)時將具有較少動能。由于ptr過程，所得產(chǎn)物離子群體將完全去溶劑化，這將改善所得質(zhì)譜的質(zhì)量。

在方法300的步驟316中，自動檢查由在步驟314中執(zhí)行的質(zhì)量分析產(chǎn)生的質(zhì)譜，以便辨識一或多個個別系列的相關(guān)m/z比，其中一系列的每一m/z比表示單個完整蛋白質(zhì)或多肽分子的相應(yīng)不同電荷態(tài)，即不同質(zhì)子化程度。舉例來說，參見圖9c，其描繪兩個不同系列的行，分別由包絡(luò)905和包絡(luò)906表示。在電離之后以及在ptr反應(yīng)之后，具有質(zhì)量mp的每一蛋白質(zhì)或多肽分子m表示為至少一種(且可能若干不同)蛋白質(zhì)或多肽陽離子物質(zhì)。由特定分子m形成的相關(guān)系列的每一此類陽離子物質(zhì)可由化學(xué)式(m+zh)^z+表示，其中整數(shù)z是加合到原始分子的質(zhì)子的數(shù)目或是在ptr步驟之后在蛋白質(zhì)上剩余的質(zhì)子的數(shù)目。在此實例中，僅考慮單同位素離子，質(zhì)荷比(m/z)ion因此如下給出：

(m/z)ion≈(mp+z×1.007)/z≈(mp+z)/z≈mp/z(等式1)

其中最終近似是得自mp>>z的事實。因此，僅表示質(zhì)子化的不同狀態(tài)的此系列的離子物質(zhì)可通過實時使用自動軟件以確定單同位素離子而容易辨識。一旦已經(jīng)辨識出此系列，便可實時辨別母代蛋白質(zhì)或多肽分子的分子質(zhì)量mp。也可以使用平均或單同位素質(zhì)量將類似方法應(yīng)用于較大分子量的分子。質(zhì)譜數(shù)據(jù)的自動檢查以及相關(guān)m/z比的一或多個個別系列的辨識可通過具體地說為此目的設(shè)計的許多已知質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析程序或軟件包中的任一者執(zhí)行。然而，為了在臨床應(yīng)用或其它時間關(guān)鍵應(yīng)用中使用，此自動檢查優(yōu)選地由經(jīng)優(yōu)化計算方法執(zhí)行，例如本文檔的附錄中詳細(xì)描述的計算方法。

可隨后對照含有蛋白質(zhì)或多肽的m/z值或分子量的列表值的數(shù)據(jù)庫搜索由ptr過程產(chǎn)生的m/z值或替代地從ptr產(chǎn)物離子獲得的分子量(圖3a的步驟402)以便辨識樣本中此些分析物的存在。如果樣本是從微生物導(dǎo)出，那么數(shù)據(jù)庫可涉及含有來自已知參考標(biāo)準(zhǔn)/患者樣本的觀測m/z值或分子量的個別病原體標(biāo)準(zhǔn)。在此些情況下，通過從含有個別參考病原體的數(shù)據(jù)庫匹配這些m/z值或分子量，獲得可能的病原體識別的小子集。可通過確定特定質(zhì)量準(zhǔn)確性、將個別峰的強度加權(quán)和/或通過在給定評分系統(tǒng)中按質(zhì)量計將分子量值加權(quán)來限制所述子集。

在微生物研究的某些情況下，m/z或分子量匹配可提供與可自動確定的特定病原體識別的直接匹配(例如圖3a的步驟404)。然而，在所有概率中，m/z分子量信息將大體上減少可使用串連質(zhì)譜法明確地識別的可能病原體識別的數(shù)目。在國際(pct)專利申請公開案wo2013/166169a1中最初描述此過程以與步驟302、304、306和308-310結(jié)合使用。另外，可采用貝葉斯、邏輯回歸或基于決策樹的方法以進一步精煉病原體的識別。在優(yōu)選實施例中，在數(shù)據(jù)獲取期間(即，在正分析樣本時)實時執(zhí)行此m/z或分子量搜索。替代地，也可在獲取后(即，在已分析樣本)之后執(zhí)行搜索。蛋白質(zhì)的少量m/z值或分子量(3到10個)與參考數(shù)據(jù)庫的比較將一般足以顯著減少病原體識別的候選數(shù)目為五個或更少。

任選地，在如由圖3a中的虛線箭頭指示的步驟402的執(zhí)行之后，方法300的執(zhí)行可返回至步驟302、308或310中的任一者。此同一選項也適用于在圖3b中說明的方法370、在圖3c中說明的方法380、在圖3d到3e中說明的方法390以及在圖3f中說明的方法395。返回到步驟302對應(yīng)于在不同樣本的分析中重復(fù)方法300的全部。返回到步驟308對應(yīng)于將同一樣本的不同部分引入到質(zhì)譜儀系統(tǒng)中且對所述不同部分重復(fù)質(zhì)譜分析。在一些情況下，同一樣本的不同部分可包括同一樣本的不同化學(xué)分?jǐn)?shù)(即，其可包括與先前分析部分不同的組成)，前提是所述樣本例如通過層析法(步驟306)或通過某種其它化學(xué)部分分離技術(shù)而化學(xué)部分分離。在一些情況下，樣本的不同部分可包括與先前分析部分相同的組成(或可視為包括基本上相同的組成)，前提是不存在化學(xué)分餾步驟或者由分餾造成的化學(xué)組成的變化率比質(zhì)譜儀系統(tǒng)可重復(fù)步驟312-402的速率慢得多。

從步驟402返回到步驟310對應(yīng)于對步驟310中的離子物質(zhì)的一或多個第二不同預(yù)定m/z范圍(與步驟310的先前執(zhí)行中隔離的離子物質(zhì)的m/z范圍相比)進行質(zhì)量隔離，且隨后使用新隔離的離子物質(zhì)及其反應(yīng)產(chǎn)物重復(fù)步驟312-402。重復(fù)步驟310-402的此程序在可假定這些步驟的連續(xù)迭代之間樣本組成未改變的情況下尤其有用。在這些環(huán)境下，步驟310-402的重復(fù)可提供來自同一樣本組成的額外信息。所述樣本可常常假定保持恒定或幾乎沒有不同，前提是在樣本引入質(zhì)譜儀中之前不存在化學(xué)分餾或者由分餾造成的化學(xué)組成的變化率比質(zhì)譜儀系統(tǒng)可重復(fù)步驟312-402的速率慢得多。

圖3b示意性地說明根據(jù)本發(fā)明教示的第二示范性方法方法370的流程圖。方法370(圖3b)的步驟302-314相同于方法300(圖3a)的類似編號的步驟，且因此此處不重復(fù)這些步驟的描述。方法370不同于方法300之處僅關(guān)于在步驟314中產(chǎn)生質(zhì)譜之后的步驟。根據(jù)早先描述的方法300，ptr產(chǎn)物離子的質(zhì)譜假定足以檢測或定量所關(guān)注的蛋白質(zhì)和多肽。然而，在許多情況下，可能在ptr反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)生之后必須執(zhí)行串連質(zhì)譜法(有時稱為ms/ms或msⁿ)以便解析特定蛋白質(zhì)或多肽分子的辨識中的剩余不明確性。在其它情況下，可能必須執(zhí)行如下方進一步論述的ptr的第二階段。在其中需要分段的情況下，ptr反應(yīng)產(chǎn)物可視為包括第一代反應(yīng)產(chǎn)物，其隨后經(jīng)分段以形成第二代產(chǎn)物離子。第一代反應(yīng)產(chǎn)物的特定m/z比與片段離子的一或多個特定m/z比的組合在許多情況下可允許與給定病原體相關(guān)聯(lián)的特定蛋白質(zhì)或多肽分子的識別。在許多情況下，以特定病原體識別的蛋白質(zhì)也可以在其它類似病原體中找到。為了正確地識別單個病原體，可能需要對以給定ptr分?jǐn)?shù)或同一樣本的多個ptr分?jǐn)?shù)存在的一樣多的蛋白質(zhì)執(zhí)行方法370(具體地說串連質(zhì)譜法)。

在方法370的步驟316中，執(zhí)行計算方法以便自動分析在步驟314中獲得的ptr反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。所述計算方法嘗試識別蛋白質(zhì)或多肽的電荷態(tài)序列。在方法370的步驟316中獲得的實時自動計算分析的結(jié)果可稍后用作在后續(xù)步驟318中做出m/z選擇的基礎(chǔ)，其中包括m/z比的受限制范圍的ptr產(chǎn)物離子的子集被選擇且隔離以便稍后在步驟320中分段。優(yōu)選地，電荷態(tài)序列的自動識別(步驟316)是通過快速計算方法實行，例如本文檔的附錄中詳細(xì)描述的計算方法，其針對此些實時數(shù)據(jù)分析而優(yōu)化。

因此，方法370(圖3b)的步驟318-322表示應(yīng)用于由ptr形成的離子的串連質(zhì)譜法或選定反應(yīng)監(jiān)視(srm)的技術(shù)的應(yīng)用。如果特定采用的質(zhì)譜法系統(tǒng)準(zhǔn)許，那么ptr產(chǎn)物離子的一部分可能已經(jīng)存儲(緊接在步驟312之后)在質(zhì)譜儀系統(tǒng)的離子存儲設(shè)備中。在此些情況下，分支步驟315致使步驟317a的執(zhí)行，其中檢索先前存儲的離子用于進一步處理。否則，如果質(zhì)量分析步驟(步驟314)耗盡ptr產(chǎn)物離子的先前批次，那么根據(jù)替代的步驟317b，可能需要重新執(zhí)行步驟308-312以便產(chǎn)生此些ptr產(chǎn)物離子的新批次。

在方法370的步驟318中，一特定m/z范圍或多個特定m/z范圍內(nèi)的某些ptr反應(yīng)產(chǎn)物離子(即，第一代產(chǎn)物離子)通過噴出m/z比不在所關(guān)注的一或多個范圍內(nèi)的離子而被質(zhì)量隔離。在步驟320中隨后將隔離的離子分段。特定所選的一或多個范圍將一般響應(yīng)于在步驟316的執(zhí)行之前立即識別的特定經(jīng)識別電荷態(tài)序列的細(xì)節(jié)，且所述選擇將一般由計算機自動做出。因此，用于隔離和分段的一或多個特定m/z范圍的選擇是所謂的“數(shù)據(jù)相依分析”(或“數(shù)據(jù)相依獲取”等)的實例。

在涉及幾百到幾千道爾頓的低質(zhì)量分子的大多數(shù)常規(guī)ms/ms分析中，數(shù)據(jù)相依分段包括基于先前ms¹數(shù)據(jù)獲取的信息挑選“最高p數(shù)目的最充足的前驅(qū)體”用于串連質(zhì)量分析，其中數(shù)目p是常數(shù)或可能是由用戶輸入的變量。已發(fā)現(xiàn)此常規(guī)形式的數(shù)據(jù)相依分析當(dāng)在生物聚合物分析物的多組分樣本的分析中使用時表現(xiàn)并不良好。舉例來說，圖7c說明分別由包絡(luò)905和包絡(luò)906表示的兩個電荷態(tài)分布。在此實例中，每一包絡(luò)對應(yīng)于不同的相應(yīng)分析物分子物質(zhì)。因此，由包絡(luò)905和906包含的行的集合可被稱為“分子物質(zhì)相關(guān)電荷態(tài)分布”。考慮圖7c中的行(個別m/z值)表示前驅(qū)體離子，則如果p＝10，那么常規(guī)數(shù)據(jù)相依分段技術(shù)將選擇包絡(luò)906下方的十個最左邊實心垂直行用于分段。使用常規(guī)技術(shù)，將不選擇對應(yīng)于包絡(luò)905的點線。常規(guī)程序因此將產(chǎn)生與對應(yīng)于包絡(luò)906的分子物質(zhì)相關(guān)的冗余信息且不產(chǎn)生與對應(yīng)于包絡(luò)905的分子物質(zhì)相關(guān)的信息。

為了克服當(dāng)應(yīng)用于高分子量分子時常規(guī)數(shù)據(jù)相依分段的缺點，本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)本文使用的新穎“最高p個唯一分析物特定群集”數(shù)據(jù)相依技術(shù)以便替換先前的“最高p數(shù)目的最充足的前驅(qū)體”邏輯以應(yīng)用于高分子量分子。每一分子物質(zhì)相關(guān)電荷態(tài)分布是根據(jù)新穎“最高p個唯一分析物特定群集”邏輯解譯為全部從單個唯一分子產(chǎn)生的相關(guān)質(zhì)譜線(m/z值)的集合。每一分子物質(zhì)相關(guān)電荷態(tài)分布將被指示為在電離之前已經(jīng)從單個分子產(chǎn)生的各種電荷態(tài)和同位素群集分組在一起。然而，分子物質(zhì)相關(guān)分布排除了在數(shù)據(jù)分析之前移除的加成物。根據(jù)所述新穎方法，僅對給定分子物質(zhì)相關(guān)電荷態(tài)分布包絡(luò)的一個(或可能更多)選定代表執(zhí)行分段，從而避免上文與常規(guī)數(shù)據(jù)相依分段方法相關(guān)聯(lián)所述的冗余。根據(jù)新穎“最高p個唯一分析物特定群集”邏輯，在已針對第一分子物質(zhì)相關(guān)電荷態(tài)分布選擇代表性m/z比(或多個比率)之后，任何進一步分段是針對下一所確定的分子物質(zhì)相關(guān)電荷態(tài)分布的代表性m/z比，以此類推。

如先前描述，在方法370的步驟318中執(zhí)行的隔離可通過以下方式實現(xiàn)：跨離子阱的電極對施加補充ac電壓以使得m/z比不在所關(guān)注的一或多個范圍內(nèi)的離子從阱噴出，而m/z比在所述一或多個范圍內(nèi)的那些離子保持在阱內(nèi)。在一些情況下，用于質(zhì)量隔離的離子阱可相同于在步驟314中用以進行全掃描質(zhì)量分析的質(zhì)量分析器。

施加于用于質(zhì)量隔離的離子阱的補充ac電壓可包括疊加頻率的求和以使得兩個或更多個非鄰接m/z范圍內(nèi)的離子被同時隔離。在后續(xù)步驟320中，經(jīng)質(zhì)量隔離的第一代產(chǎn)物離子通過例如碰撞引發(fā)的解離(cid)等合適的離子分段技術(shù)分段。所述分段可通過用已知方式將第一代產(chǎn)物離子(由原始前驅(qū)體離子的ptr形成的產(chǎn)物離子)傳送到專用分段單元而實現(xiàn)，所述傳送的離子在所述分段單元內(nèi)分段以便產(chǎn)生片段離子，這些片段離子包括第二代反應(yīng)產(chǎn)物。任選地，在任選的步驟321中可存儲片段產(chǎn)物離子的一部分以用于可能的未來額外分段。

在方法370(圖3b)的步驟322中，由質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器對步驟320中產(chǎn)生的片段進行質(zhì)量分析。如果第二代產(chǎn)物離子是在具體來說專用于分段目的的分段單元內(nèi)產(chǎn)生，那么在步驟322的執(zhí)行之前所述離子必須首先傳送到質(zhì)量分析器。在步驟322中可采用離子阱質(zhì)量分析器以分析第二代產(chǎn)物離子，在此情況下用于步驟322的質(zhì)量分析器可相同于步驟314的用于進行全掃描質(zhì)量分析的質(zhì)量分析器。替代地，可采用能夠以10ppm或更好的準(zhǔn)確性測量質(zhì)荷比的準(zhǔn)確質(zhì)量分析器用于步驟322，例如ft-icr質(zhì)量分析器、飛行時間(tof)質(zhì)量分析器或orbitrap^tm型靜電阱質(zhì)量分析器。

如所已知，經(jīng)受分段的某一選定離子物質(zhì)的m/z值與由分段產(chǎn)生的一或多個片段離子物質(zhì)的m/z值(或多個值)之間的相關(guān)可足以自動確定(在步驟402b中)選定離子物質(zhì)的化學(xué)身份。在此情況下，選定離子物質(zhì)是在步驟318中經(jīng)質(zhì)量隔離的在步驟312中產(chǎn)生的ptr反應(yīng)產(chǎn)物物質(zhì)。少量(即，3到10種)此類蛋白質(zhì)的識別將一般足以唯一地識別微生物物質(zhì)(任選的步驟404b)。然而，單個階段的分段可能不足以用于執(zhí)行化學(xué)物質(zhì)識別。在此類情況下，第二代產(chǎn)物離子可進一步分段以便形成下一代產(chǎn)物離子，由從步驟322返回至步驟318的任選的重復(fù)(以虛線指示)指示，其中片段產(chǎn)物離子的選定子集根據(jù)其m/z值而被隔離，且如此隔離的片段離子被進一步分段。更一般化地，可選擇n^th代產(chǎn)物離子的子集用于通過任何合適的離子分段方法而進一步分段，例如(但不限于)碰撞引起的分段、較高能量碰撞解離、電子轉(zhuǎn)移解離、電子捕獲解離、負(fù)電子轉(zhuǎn)移解離、電子分離解離、源中分段、表面引起的解離或光致解離，從而形成(n+1)^th代產(chǎn)物離子。質(zhì)量分析步驟322的結(jié)果可形成關(guān)于是否需要每一額外分段以及如果需要則哪些m/z值對應(yīng)于待分段的離子物質(zhì)的自動決策的基礎(chǔ)。

在以上論述中，關(guān)于進一步分段先前產(chǎn)生的片段離子的目的而描述方法370的從步驟322返回至步驟318的任選重復(fù)。然而，在一些實施例中，步驟318的第二或后續(xù)執(zhí)行可出于以下目的：基于在步驟316中先前執(zhí)行的電荷態(tài)序列的自動識別而挑選ptr反應(yīng)產(chǎn)物的第二不同離子物質(zhì)(在步驟312中產(chǎn)生且可能存儲)用于分段。現(xiàn)在可參看圖12c理解第二ptr步驟的可能的需要。作為一實例，質(zhì)量隔離步驟(方法370的步驟318)的第一執(zhí)行可隔離對應(yīng)于屬于電荷態(tài)包絡(luò)a208的質(zhì)譜線的離子物質(zhì)，而步驟318的第二執(zhí)行可隔離對應(yīng)于屬于電荷態(tài)包絡(luò)a206的質(zhì)譜線中的一者的離子物質(zhì)。如本文檔的附錄中所描述，質(zhì)譜線的每一此類集合(屬于包絡(luò)a208的集合或?qū)儆诎j(luò)a206的集合)。附錄中描述的新穎的“最高p個唯一分析物特定群集”工作流具體地說適于辨識對應(yīng)于不同相應(yīng)潛在分析物分子的此類群集。根據(jù)此工作流程序，執(zhí)行方法370的隔離步驟(步驟318)和分段步驟(步驟320)的第二執(zhí)行，以便排除對應(yīng)于包絡(luò)a208的離子物質(zhì)的隔離和分段(假定一種此類離子物質(zhì)在這些步驟的較早執(zhí)行期間隔離且分段)，即使它們可能具有比對應(yīng)于包絡(luò)a206的離子物質(zhì)大的強度也是如此。以此方式，在包括步驟318-322的任選循環(huán)的每一迭代期間獲得關(guān)于不同潛在分析物的片段信息。

上文所論述的圖3a中描繪的方法300提供了樣本分析的相對簡單且直接的方法，其可適用于相對低復(fù)雜性的樣本，例如當(dāng)在將層析部分引入到質(zhì)譜儀中(步驟308)之前已執(zhí)行高度解析層析分離(步驟306)時。然而，簡單方法300可能不適合于更復(fù)雜的樣本，且此些樣本的分析可能存在一些挑戰(zhàn)。首先，復(fù)雜混合物中存在的蛋白質(zhì)具有廣泛范圍的分子量。第二，由大量離胺酸、精胺酸、組胺酸殘余的存在引起的大量電荷態(tài)可導(dǎo)致多個重疊的峰集合，每一峰集合對應(yīng)于不同化學(xué)物質(zhì)。第三，如果質(zhì)量分析(步驟314)具有充分高分辨率，那么任何給定電荷態(tài)的同位素分布的解析峰的存在會混淆大多數(shù)數(shù)據(jù)處理算法。最后，多個電荷態(tài)當(dāng)中以及可能多個同位素狀態(tài)當(dāng)中可用離子的分布必定減少質(zhì)量分析中的任何解析峰的信號強度。

為了解決復(fù)雜樣本的分析中的上述挑戰(zhàn)，在圖3c中說明其示意性流程圖的方法380提供了進行多個ptr階段的機會。在早先描述的方法300下，假定第一代ptr反應(yīng)產(chǎn)物(步驟312中產(chǎn)生)的(在步驟314中)獲得的質(zhì)譜展現(xiàn)信噪比的足夠改進以及同量異位干擾的足夠減少，以使得可辨識電荷態(tài)順序且可識別蛋白質(zhì)或多肽。如果質(zhì)譜質(zhì)量中的此改進在第一ptr反應(yīng)事件之后仍不足以用于此目的，那么可執(zhí)行方法380(圖3c)的額外精煉步驟327-330。此外，ptr階段中的一或多者可利用“離子停車”的已知技術(shù)以便簡化電荷態(tài)分布，如先前段落中所提到。離子停車是禁止離子阱內(nèi)的特定選定離子/離子反應(yīng)的技術(shù)。實際上，跨離子阱的電極對、離子導(dǎo)向器或其它離子存儲裝置施加諧振激發(fā)波形，其振幅不足以造成離子排出但足以增加具有選定m/z值的離子的速度。此激發(fā)過程增加了激發(fā)離子(陽離子，出于本論述的目的)與反應(yīng)劑陰離子之間的相對速度，且據(jù)信此相對速度增加造成激發(fā)陽離子與反應(yīng)劑陰離子之間的反應(yīng)速率的減少。

在ptr過程期間，陽離子與反應(yīng)劑陰離子之間的反應(yīng)速率隨著各種陽離子的電荷數(shù)的平方而變化，其中反應(yīng)劑離子上的陰離子電荷等于-1。因此，無離子停車存在下，ptr過程導(dǎo)致高度帶電陽離子的數(shù)目的快速減少。在反應(yīng)的過程中，從單個分子物質(zhì)m(具有質(zhì)量mp的蛋白質(zhì)或多肽分子)導(dǎo)出的陽離子的電荷態(tài)的分布朝向較低電荷態(tài)移位。具有中間電荷態(tài)的每一離子物質(zhì)的群體將首先隨著較高帶電前驅(qū)體離子失去質(zhì)子而增加，并且然后隨著每一相應(yīng)物質(zhì)丟失更多質(zhì)子而減小，隨后其從較高帶電陽離子的遞減數(shù)量得益。如果允許ptr反應(yīng)前進到完成，那么最終結(jié)果是所有此些陽離子的完全中和以及所有質(zhì)譜信號的全損耗。

當(dāng)在ptr反應(yīng)期間應(yīng)用離子停車技術(shù)時，則電荷減少過程基本上停止在電荷態(tài)z1，其對應(yīng)于由施加的ac波形諧振激發(fā)的離子的特定質(zhì)荷比(例如，mp/z1)。從具有初始電荷態(tài)z的分子物質(zhì)m導(dǎo)出以使得z>z1的那些前驅(qū)體陽離子將失去質(zhì)子，直到其電荷態(tài)減少到z1，在此之后將禁止進一步反應(yīng)和質(zhì)子損失。從具有初始電荷狀態(tài)z以使得z<z1的分子物質(zhì)m導(dǎo)出的那些前驅(qū)體陽離子將被完全中和。因此，在具有離子停車的ptr反應(yīng)之后，在質(zhì)譜中將通過具有電荷態(tài)z1的單個離子物質(zhì)表示分子m的原始質(zhì)子化分子離子(即，前驅(qū)體離子)的顯著部分。分子物質(zhì)m的此“集中”到單個電荷態(tài)中可有利地放大與所述物質(zhì)相關(guān)聯(lián)的質(zhì)譜信號，從而改善信噪比且降低檢測下限以及任選地降低物質(zhì)的定量下限。此外，從分子物質(zhì)m產(chǎn)生的離子的許多同位素變體將具有對應(yīng)于所施加ac諧振激發(fā)波形的值范圍之外的m/z值。此些同位素變體將被中和以便不干擾所關(guān)注的離子的質(zhì)譜識別。其它同位素變體包括在對應(yīng)于所施加ac諧振激發(fā)波形的值范圍內(nèi)的m/z值。此些同位素變體離子的同位素分布圖案將相對于原始前驅(qū)體離子中觀測到的同位素分布極大地簡化，因為它們將大部分涉及從分子m產(chǎn)生的離子的單個電荷態(tài)z1。

返回到圖3c中概括的方法380的論述，應(yīng)注意方法380的步驟302-310相同于方法300(圖3a)的類似編號的步驟且此處不再描述。隨后，在步驟328中，前驅(qū)體離子經(jīng)受ptr，任選地由離子停車技術(shù)改質(zhì)。如前文所述，通過跨離子阱的一對電極施加補充ac激發(fā)波形而執(zhí)行步驟328，樣本導(dǎo)出的陽離子在所述離子阱內(nèi)與反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)達預(yù)定時間段。如上文所描述，此“離子停車”程序的采用將使從任何特定蛋白質(zhì)或多肽導(dǎo)出的離子的分布集中于m/z值的特定受限范圍中。這將一般將從任何特定蛋白質(zhì)或多肽導(dǎo)出的離子限制到特定電荷態(tài)中，從而簡化所得質(zhì)譜且增加對應(yīng)于特定蛋白質(zhì)或多肽的任何質(zhì)譜峰的強度。離子受限于其中的m/z值的特定范圍可包括從不同相應(yīng)分子物質(zhì)導(dǎo)出的不同相應(yīng)電荷態(tài)的離子。在一些實施例中，用以實現(xiàn)離子停車的所施加ac波形可包括不同相應(yīng)頻率的波形的求和，以使得所求和波形致使ptr反應(yīng)產(chǎn)生對應(yīng)于兩個或更多個非鄰接m/z范圍的ptr產(chǎn)物離子的最終群體。

在后續(xù)步驟330中，通過質(zhì)量分析器對在步驟328中產(chǎn)生的ptr產(chǎn)物離子的群體進行質(zhì)量分析，并且在步驟331中，可對在質(zhì)量分析中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)執(zhí)行自動計算以便自動識別所述數(shù)據(jù)中可表示的任何電荷態(tài)序列，其中每一此類電荷態(tài)序列對應(yīng)于不同潛在蛋白質(zhì)或多肽分析物。在步驟330的質(zhì)量分析之前，可存儲ptr產(chǎn)物離子的一部分(步驟329)以準(zhǔn)備用于可能的后續(xù)ptr反應(yīng)。取決于電荷態(tài)序列的自動識別(步驟331)的結(jié)果，可做出使ptr產(chǎn)物離子經(jīng)受此進一步ptr反應(yīng)的自動決策，如由圖3c中所示的虛線任選路徑指示。所述決策也可以基于電荷態(tài)序列的自動識別的結(jié)果而做出以僅使ptr產(chǎn)物離子的選定子集經(jīng)受后續(xù)ptr反應(yīng)。在此些情況下，執(zhí)行步驟327。因此，根據(jù)一些實施例，步驟327-331可包括迭代循環(huán)，其中在循環(huán)的每一迭代，選擇且隔離對應(yīng)于不同相應(yīng)蛋白質(zhì)或多肽的不同相應(yīng)離子物質(zhì)以用于通過ptr過程的進一步純化?？筛鶕?jù)本文檔的附錄中描述的新穎的“最高p個唯一分析物特定群集”工作流在步驟331中確定以此方式選擇的離子物質(zhì)。

如果在步驟330中采用的質(zhì)量分析器是檢測通過離子阱或其它離子存儲裝置內(nèi)的循環(huán)離子運動產(chǎn)生的鏡像電流的類型，例如ft-icr質(zhì)量分析器或orbitrap^tm質(zhì)量分析器，那么ptr反應(yīng)步驟可有利地減少目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽分子的碰撞分布以使得這些分子在阱中保持穩(wěn)定達足夠時間長度以產(chǎn)生高質(zhì)量質(zhì)譜。在足夠數(shù)目的ptr反應(yīng)步驟之后，接著可通過匹配于已知分子質(zhì)量的數(shù)據(jù)庫而快速辨別蛋白質(zhì)或多肽的化學(xué)身份(在步驟402c中)。少量(3到10種)蛋白質(zhì)的識別將一般足以唯一地識別微生物物質(zhì)(任選的步驟404c)。識別也可經(jīng)由如先前所論述使用應(yīng)用于ptr數(shù)據(jù)的分類器而實現(xiàn)，其包含(但不限于)貝葉斯、邏輯回歸或基于決策樹的方法。

圖3d到3e以流程圖形式說明根據(jù)本發(fā)明教示的另一方法方法390。方法390的步驟302-331在圖3d中所示且相同于方法380(圖3c)的先前論述類似編號的步驟，因此，此處不再描述這些步驟。并非從步驟330直接前進到識別步驟402d(如圖3c的方法380中)，方法390(圖3d到3e)的執(zhí)行從步驟330前進到質(zhì)量選擇和隔離步驟332。在步驟332中，根據(jù)選定m/z比隔離通過ptr程序的一或多次應(yīng)用而產(chǎn)生的ptr產(chǎn)物離子的子集。關(guān)于在此步驟期間將隔離的特定m/z比的決策可基于在步驟330中獲得的質(zhì)譜結(jié)果或者相對于任選的后續(xù)質(zhì)量隔離和分段(參見圖3e的任選重復(fù)分支)基于片段離子本身的質(zhì)量分析的結(jié)果(步驟338)而自動執(zhí)行。在圖3e中說明的步驟332-338表示可迭代(參見任選的重復(fù)分支)以便產(chǎn)生多代分段產(chǎn)物離子的離子分段程序。這些步驟332-338類似于圖3b中說明的方法370的步驟318-322且因此不詳細(xì)論述。

在分段和質(zhì)量分析步驟的執(zhí)行之后，執(zhí)行方法390(圖3e)的肽識別步驟402d。方法300(圖3a)的識別步驟402a僅利用包括質(zhì)子化或多質(zhì)子化分析物分子的離子物質(zhì)的m/z比(或分子量)，而方法390的識別步驟402d還考慮了這些離子物質(zhì)的片段(可能多代)的m/z比。因此，在蛋白質(zhì)或多肽的復(fù)雜混合物的情況下，較大置信度可與使用方法390進行的識別的結(jié)果相關(guān)聯(lián)。根據(jù)一些實施例通過如上所述利用實時數(shù)據(jù)解卷積可實時執(zhí)行對實驗的控制。在步驟402d中對少量(3到10個)蛋白質(zhì)物質(zhì)的識別將一般足以在步驟404d中唯一地識別微生物物質(zhì)。

圖3f以流程圖形式概略地說明根據(jù)本發(fā)明教示的另一方法方法395。方法395(圖3f)中的大多數(shù)步驟類似于方法370(圖3b)中類似地編號的步驟且不再詳細(xì)地描述這些步驟。類似于方法370，方法395包含使原始前驅(qū)體離子經(jīng)受ptr電荷減少的步驟(步驟312)，隨后是隔離選定ptr產(chǎn)物離子物質(zhì)且使隔離的離子物質(zhì)經(jīng)受分段以便形成片段產(chǎn)物離子物質(zhì)的步驟(步驟318和320)。方法395通過提供使片段離子經(jīng)受ptr電荷減少的額外步驟步驟340而不同于方法370。由于從原始前驅(qū)體離子產(chǎn)生的各種ptr產(chǎn)物離子物質(zhì)可為多電荷的且可以各種程度的質(zhì)子化在物質(zhì)當(dāng)中分布，因此由其形成的片段離子本身可在多個質(zhì)子化狀態(tài)當(dāng)中分布。在步驟340中碎片離子物質(zhì)的ptr電荷減少可在步驟341中的其質(zhì)量分析之前簡化片段離子的電荷態(tài)分布。任選地，ptr步驟(步驟312和步驟340)中的任一者可采用離子停車。從步驟341返回至步驟318的任選重復(fù)以便重復(fù)步驟318-341可出于以下目的而執(zhí)行：基于在步驟316中先前執(zhí)行的電荷態(tài)序列的自動識別而挑選ptr反應(yīng)產(chǎn)物的第二不同離子物質(zhì)(在步驟312中產(chǎn)生且可能存儲)以用于分段。如先前相對于方法370(圖3b)論述，所述第二不同離子物質(zhì)可屬于第二電荷態(tài)包絡(luò)的線的集合，所述第二電荷態(tài)包絡(luò)不同于先前隔離且分段的離子物質(zhì)屬于的電荷態(tài)包絡(luò)(還參見圖12c)。附錄中描述的新穎的“最高p個唯一分析物特定群集”工作流具體地說適于辨識對應(yīng)于不同相應(yīng)潛在分析物分子的此類群集。以此方式，在包括方法395的步驟318-341的任選循環(huán)的每一迭代期間獲得關(guān)于不同潛在分析物的片段信息。

實例a

圖4a和4b提供由單個ptr反應(yīng)步驟提供的質(zhì)譜信號增強的實例(例如，如圖3a中所示的方法300中)。在第一應(yīng)用(圖4a，4b)中，經(jīng)由直接輸注分析來自病原體大腸桿菌的提取物，圖4a中示出第一代電噴射產(chǎn)生的離子的質(zhì)譜。正如期望，存在以各種m/z值重疊的許多蛋白質(zhì)，導(dǎo)致近似m/z＝780與m/z＝1420之間存在寬譜區(qū)域，其內(nèi)檢測到許多離子但在可辨別的蛋白質(zhì)電荷態(tài)分布方面只有極少的可用信息。接著，具有寬度2th且以m/z＝750為中心的第一代離子的m/z“窗口”被隔離，且所得隔離的離子群體經(jīng)受ptr反應(yīng)。圖4a中所示的m/z位置412a指示隔離窗口的中心位置。

圖4b展示大腸桿菌提取物的前驅(qū)體離子的ptr反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)譜。實行ptr反應(yīng)，其中在遞送到如圖2中所說明的相同一般配置的質(zhì)譜儀的離子光學(xué)元件內(nèi)含有的輝光放電反應(yīng)劑離子源的氮氣流中從3ppm的六氟化硫(sf6)導(dǎo)出的反應(yīng)劑陰離子。如同大多數(shù)ptr產(chǎn)物離子光譜，圖4b中所示的質(zhì)譜在原始第一代離子隔離窗口的位置(如位置412b指示)處展現(xiàn)相對強烈的隔離峰。在隔離窗口的位置處的這些峰一般指示在隔離的位置處偶然發(fā)生的殘余單電荷第一代離子(一般不關(guān)注)的存在。圖4b的譜中的其它峰表示從ptr反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物離子。這些產(chǎn)物離子一般包括相關(guān)離子的重疊集合，每一集合對應(yīng)于包括來自原始隔離窗口內(nèi)的原始多電荷前驅(qū)體離子的電荷態(tài)分布的離子。一種此類可能的電荷態(tài)分布圖案由包絡(luò)413近似指示。圖4a和4b中所示的結(jié)果展示ptr反應(yīng)過程一般顯著簡化譜且減少背景干擾。但是，由于許多蛋白質(zhì)導(dǎo)出或肽導(dǎo)出的前驅(qū)體離子可能存在于原始隔離窗口中，因此電荷態(tài)分布圖案可能重疊?？赡苄枰獢?shù)學(xué)分解(有時稱為“解卷積”)來辨識個別圖案。

實例b

圖5a和5b說明由包含ptr反應(yīng)的兩個階段的程序執(zhí)行的大腸桿菌提取物的分析的實例(例如，參見圖3c中的方法380的步驟327、328、329和330)。圖5a說明來自以m/z＝1200為中心的5th質(zhì)量窗口內(nèi)的ptr產(chǎn)物離子譜產(chǎn)生的隔離第一代前驅(qū)體離子，由圖5a中的位置711指示。在此實例中，初始ptr譜不包含經(jīng)充分良好解析以實現(xiàn)樣本中的任何蛋白質(zhì)的識別的峰。因此，針對來自以m/z＝1320為中心的5th質(zhì)量窗口內(nèi)的ptr的第二階段隔離第一代ptr產(chǎn)物離子的子集，由圖5a中的位置712a和圖5b中的位置712b指示。在圖5b中以大于1320的m/z比發(fā)生的第二代ptr產(chǎn)物離子展示可成功地用于樣本中蛋白質(zhì)的識別的清楚電荷態(tài)分布圖案。

圖6a到6g說明由包含通過ptr反應(yīng)的產(chǎn)物離子形成的第一階段隨后是ptr反應(yīng)產(chǎn)物離子的cid的后續(xù)階段的程序(例如，參見圖3b中的方法370的步驟312到322)執(zhí)行的大腸桿菌提取物分析的實例。圖6a說明來自以m/z＝640為中心的5th質(zhì)量窗口內(nèi)的ptr產(chǎn)物離子譜產(chǎn)生的隔離第一代前驅(qū)體離子，由圖6a中的位置811指示。ptr產(chǎn)物離子以比圖6a中位置811指示的情況更大的m/z比發(fā)生。圖6a中分別位于833、926和917的m/z比處且有質(zhì)譜峰813、814和815指示的三種最強烈ptr產(chǎn)物離子隨后被個別地隔離且單獨地經(jīng)受碰撞引起的解離以便產(chǎn)生第二代產(chǎn)物離子的三個集合。圖6b和6c分別描繪在m/z＝833處的隔離ptr產(chǎn)物離子以及通過隔離ptr產(chǎn)物離子的cid產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子(片段離子)。同樣，圖6d和6e分別描繪在m/z＝926處的隔離ptr產(chǎn)物離子以及通過在m/z＝926處的隔離ptr產(chǎn)物離子的cid產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子。同樣，圖6f和6g分別描繪在m/z＝917處的隔離ptr產(chǎn)物離子以及通過在m/z＝917處的隔離ptr產(chǎn)物離子的cid產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子。

實例c

如從先前論述將顯而易見，任何蛋白質(zhì)或多肽分子的陽離子電噴射電離將由于原始分子的不同程度質(zhì)子化而產(chǎn)生包括不同相應(yīng)電荷態(tài)(即，電荷數(shù)目)的多個離子。+50或更多的電荷態(tài)或者可能的及每一電荷態(tài)將由表示不同程度的自然同位素取代的多個質(zhì)譜線表示。另一并發(fā)情況從以下事實產(chǎn)生：對于大多數(shù)自然生物樣本，多肽分子的許多不同蛋白質(zhì)可在質(zhì)譜中表示。又一并發(fā)情況從以下事實產(chǎn)生：不一定關(guān)注的許多其它分子可能存在于樣本中。

在許多面向基本研究的研究中，多個分析物和多個干擾物質(zhì)的上述并發(fā)因素可以通過在將每一分離化合物個別地引入質(zhì)譜儀中之前執(zhí)行色度分離而部分地或完全地解析。然而，臨床分析常常會在緊張的時間約束下執(zhí)行，這并不允許傳統(tǒng)的耗時層析分離。臨床時間約束可僅允許使用固相萃取(spe)、尺寸排阻層析或上述快速部分層析分離(fpcs)的方法的不完全或部分分離。因此，當(dāng)采用這些部分分離程序時，任何特定蛋白質(zhì)或多肽的質(zhì)譜特征可以擴展到寬質(zhì)荷比之外，且可與其它化合物的質(zhì)譜特征復(fù)雜地重疊。由于由電噴射設(shè)備提供的可用電荷將在許多不同類型的離子上擴展，因此大多數(shù)觀測到的質(zhì)譜線將共存且可能隱藏于一般密集群體且低強度或不良界定的譜“背景”中，這由圖7a到7b中的譜包絡(luò)902示意性地指示。

發(fā)明人已經(jīng)實現(xiàn)任何特定蛋白質(zhì)、多肽或其它生物相關(guān)高分子量分析物的質(zhì)譜特征可通過以下方式假設(shè)地放大：同時隔離同一原始分子的多個電荷態(tài)，并且然后使多個態(tài)的集合與ptr反應(yīng)劑離子反應(yīng)以便將所述集合同時減少到在幾個電荷態(tài)值上分布的少量電荷態(tài)，這些電荷態(tài)值相對于原始電荷態(tài)經(jīng)減少。此概念由圖7a中上覆于一般電荷態(tài)包絡(luò)902上所示的垂直方框904a-904g說明。每一此垂直框表示特定前驅(qū)體離子物質(zhì)且表示經(jīng)選擇為對應(yīng)于特定分析物的特定電荷態(tài)(且可能包含幾個同位素變體)的m/z值的小范圍。假設(shè)地，如果可排除對應(yīng)于垂直方框的范圍之外的所有離子且僅來自所指示范圍內(nèi)的離子混合在一起，那么后續(xù)ptr將基本上提供來自各種原始的多個電荷態(tài)的信號的求和。多個前驅(qū)體離子物質(zhì)的此多物質(zhì)隔離的使用可使分析的靈敏度增加多達n倍，其中n是經(jīng)選擇且同時隔離的m/z范圍的數(shù)目。

當(dāng)在線性離子阱(例如在圖2中說明的低壓線性阱單元217b)中執(zhí)行時此多物質(zhì)隔離相當(dāng)容易實現(xiàn)，因為用以排出不希望的離子的諧振激發(fā)波形可構(gòu)造有多個缺口。每一此缺口對應(yīng)于不同的相應(yīng)m/z窗口，其內(nèi)將不排出離子(且因此隔離)。因此，在一些實施例中，可通過同時隔離全部多個前驅(qū)體離子物質(zhì)而執(zhí)行多個電噴射產(chǎn)生(第一代)前驅(qū)體離子物質(zhì)的共同隔離。進行此的一種方式是通過將寬帶諧振排出頻率波形應(yīng)用于從電噴射源接收的離子已經(jīng)引入其中的離子阱，其中所述波形包括多個求和的正弦頻率分量，其中包含的頻率分量對應(yīng)于希望從阱排出的離子的m/z范圍且排除的頻率分量對應(yīng)于希望在阱內(nèi)保持的離子的m/z范圍。在此程序中，省略的頻率界定排出頻率波形中的一或多個頻率缺口。可通過首先挑選所需的多缺口波形并且然后計算所需波形的傅里葉逆變換而計算所述頻率分量。

替代地，可通過使用施加于離子阱的相應(yīng)單缺口波形在常規(guī)意義上每次一種離子物質(zhì)地隔離個別前驅(qū)體離子物質(zhì)而執(zhí)行所述多個前驅(qū)體離子物質(zhì)的共同隔離。個別地隔離的前驅(qū)體離子物質(zhì)可一次一個地傳送到離子存儲組件(例如在圖2中說明的多極離子導(dǎo)向器214)，其中各種選定且隔離的離子物質(zhì)隨時間而積聚。作為又一替代例，可通過使從電噴射源接收的多個離子通過四極濾質(zhì)器，同時所述四極濾質(zhì)器的帶通經(jīng)循序地調(diào)諧以又優(yōu)先發(fā)射對應(yīng)于特定前驅(qū)體離子物質(zhì)的每一m/z范圍而執(zhí)行所述多個前驅(qū)體離子物質(zhì)的共同隔離。通過四極濾質(zhì)器的經(jīng)過濾離子隨后傳遞到離子存儲組件，所述組件積聚來自所有優(yōu)先發(fā)射的m/z范圍的離子。舉例來說，在圖2中說明的質(zhì)譜儀150a中，四極濾質(zhì)器208可執(zhí)行過濾步驟的序列且每一發(fā)射m/z范圍的離子可發(fā)射到多極離子導(dǎo)向器214內(nèi)且在其內(nèi)積聚。積聚的前驅(qū)體離子物質(zhì)接著可傳送返回至低壓單元217b用于ptr反應(yīng)。

采用同時的多物質(zhì)隔離的上述程序假定先驗已知的適當(dāng)隔離范圍904a-904g。關(guān)于將采用的正確隔離范圍的此知識在目標(biāo)分析的某些例子中當(dāng)待搜索的分析物的身份(和關(guān)于其的其它信息)已經(jīng)已知且分析的目的是確定所述分析物存在或不存在或者確定所述分析物的數(shù)量或濃度時是可用的。然而，在其中分析物的身份可能不是事先已知的調(diào)查分析的情況下以上假設(shè)可為無效的。在后面的這些情況下，可通過如圖7b中示意性地描繪隔離第一代離子的隨機質(zhì)量范圍903并且然后使隔離的離子與ptr反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而執(zhí)行初始隨機調(diào)查。如先前在圖4a和4b中說明，此程序可提供與一或多個分析物的電荷態(tài)分布相關(guān)的經(jīng)解析、可解譯的質(zhì)譜線。在許多情況下，可通過相關(guān)線的m/z值與用于連續(xù)整數(shù)z的某一序列的等式1的相互一致性來辨識相關(guān)線的集合。線位置的一致性的程度可通過計算機分析自動執(zhí)行以使得此些相關(guān)線的重疊集合可在數(shù)學(xué)上經(jīng)分解且辨識。

作為以上類型分析的實例，通過m/z范圍903內(nèi)的前驅(qū)體離子的隔離和反應(yīng)而產(chǎn)生的ptr產(chǎn)物離子線的數(shù)學(xué)分解可導(dǎo)致對如圖7c中所說明由包絡(luò)905和包絡(luò)906描繪的兩個重疊線集合的辨識。借助通過此初始調(diào)查程序提供的信息，可選擇適當(dāng)且一致的m/z值集合，其可用于后續(xù)同時的多物質(zhì)隔離和反應(yīng)程序中。舉例來說，可能可以自動選擇包絡(luò)905下方的線的某些解析實例的m/z值。對應(yīng)于這些所選m/z值的前驅(qū)體離子的后續(xù)多物質(zhì)隔離和ptr反應(yīng)將隨后提供放大的譜，所述譜可用以確定由包絡(luò)905表示的特定分子的數(shù)量或濃度。此程序可稍后使用相關(guān)聯(lián)包絡(luò)906重復(fù)以便確定另一分子的數(shù)量或濃度。所確定的數(shù)量或濃度在絕對意義上可能不是準(zhǔn)確的，但所確定的數(shù)量或濃度的比率可提供與相對數(shù)量或濃度相關(guān)的有用信息。上文概述的此整個程序可使用不同隨機選擇的m/z范圍903重復(fù)多次，從而提供若干化合物的相對數(shù)量或濃度的確定。如先前陳述，可利用實時光譜解卷積的結(jié)果以數(shù)據(jù)相依方式實現(xiàn)對此些實驗的控制。

圖8提供使用上文概括的通過ptr反應(yīng)劑離子與來自多個非鄰接m/z范圍的第一代離子的反應(yīng)的ptr信號放大進行調(diào)查分析的示范性方法方法397的一般流程圖。方法397的步驟302、304、306、308、309、312、314、316、402和404相同于在圖3a中說明的方法300的類似編號的步驟且因此此處不再描述。并且，新步驟311類似于方法300的先前描述的步驟310，但步驟311僅涉及第一代離子的隨機m/z范圍(例如圖7c中所描繪的范圍903)的質(zhì)量隔離，而不涉及如針對先前方法300描述的“一或多個隨機或預(yù)定m/z范圍”。在初始調(diào)查ptr反應(yīng)(步驟312)和電荷態(tài)序列的識別(步驟316)(后者優(yōu)選地通過本文檔的附錄中描述的計算方法執(zhí)行)之后，執(zhí)行步驟323，其中隔離且積聚第一代離子的多個非鄰接m/z范圍，其中所述非鄰接m/z范圍對應(yīng)于經(jīng)識別電荷態(tài)序列。可從先前存儲的此些離子的批次獲得第一代離子(先前步驟319a)，或替代地(先前步驟319b)，可能需要重復(fù)樣本引入和電噴射離子產(chǎn)生步驟。

在第一代離子的多個非鄰接m/z范圍的隔離和積聚(步驟323)之后，使積聚的離子與ptr反應(yīng)劑離子反應(yīng)(步驟324)。所得放大的譜將一般具有高質(zhì)量，從而促進例如對應(yīng)于多個非鄰接m/z范圍的分子的準(zhǔn)確分子量或者此分子的準(zhǔn)確數(shù)量、濃度或相對豐度的導(dǎo)出(步驟325)。如果步驟316的緊鄰在前的執(zhí)行識別出相關(guān)m/z比的多于一個集合，那么可使用對應(yīng)于不同經(jīng)識別電荷態(tài)序列的非鄰接m/z范圍的新集合再次執(zhí)行步驟319a或319b和步驟323-325(跟隨步驟326的最左邊“y”分支)。如果針對可能的額外分析物的搜索將繼續(xù)，那么執(zhí)行可返回到步驟311(跟隨步驟326的最右邊“y”分支)，在此選擇不同的隨機m/z范圍。

實例d

依據(jù)根據(jù)本發(fā)明教示的利用質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的樣本復(fù)雜性減少的另一方法，采用ptr的質(zhì)譜分析可與層析法直接關(guān)聯(lián)以便簡化且檢測原本將錯過的額外蛋白質(zhì)。在此實施例中，采取全掃描質(zhì)譜且使用實時解卷積程序計算蛋白質(zhì)分子量。接著，選擇具有經(jīng)界定寬度的隔離窗口，且使所述窗口中的m/z值的子集經(jīng)受ptr反應(yīng)。

舉例來說，圖9a展示在大腸桿菌提取物的十分鐘梯度反相液相層析分離的過程期間在10分鐘30秒的滯留時間下從溶離液產(chǎn)生的第一代離子的全掃描質(zhì)譜。如圖9a中的括號指示，此全掃描質(zhì)譜展現(xiàn)分別具有35.1和31.1kda的近似分子量的兩種蛋白質(zhì)的相異光譜特征。對于下一步驟，具有10th寬度且以750th為中心的m/z隔離窗口510內(nèi)的m/z值的離子群體被隔離。隨后使隔離的離子群體經(jīng)受與陰離子反應(yīng)劑六氟化硫的ptr反應(yīng)達10ms。圖9b中所示的所得產(chǎn)物離子質(zhì)譜展現(xiàn)了具有11220.07da和24599.56da的分子量的全掃描質(zhì)譜中未見的兩種額外蛋白質(zhì)的質(zhì)譜特征。另外，在全掃描質(zhì)譜中先前觀測到的35.1kda蛋白質(zhì)組分也展現(xiàn)ptr產(chǎn)物離子譜中的譜特征，其包含對應(yīng)于在749的標(biāo)稱m/z值處的+47電荷態(tài)的線，在方框520中描繪。在749th處的線表示35.1kda蛋白質(zhì)的甚至更高電荷態(tài)的電荷減少。在11.2和24.6kda處觀測到的蛋白質(zhì)在反相層析運行的此實例中無ptr步驟存在下將不會被識別，原因是復(fù)雜的譜重疊以及來自大量單電荷背景離子的干擾噪聲。

圖10a和10b展示來自六十分鐘梯度溶離運行的在42分鐘30秒的滯留時間下從溶離液獲得的類似層析法/ms實驗的結(jié)果。如圖10a中所示，在此溶離時間下的高背景造成識別全掃描譜中的分析物峰的困難。然而，圖10b中標(biāo)繪的ptr產(chǎn)物離子譜更容易經(jīng)受解譯和質(zhì)譜解卷積。ptr產(chǎn)物離子譜展現(xiàn)原本將觀測不到的三種相異蛋白質(zhì)(具體地說具有11165.92da、13480.28da和18727.23da的分子量)的質(zhì)譜特征。在此實例中，從10th寬度的以m/z750為中心的質(zhì)譜窗口(圖10a中由方框610指示)產(chǎn)生的隔離前驅(qū)體離子產(chǎn)生ptr產(chǎn)物離子。通過對在單個實驗過程期間在各種不同滯留時間下溶離的溶離液執(zhí)行此類型的分析，可辨識足夠數(shù)目的樣本肽以便實現(xiàn)在物質(zhì)、亞種或菌株層級的對微生物的識別。如圖9a到9b中所示的結(jié)果也指示，如果存在來自隔離窗口內(nèi)的全質(zhì)譜的蛋白質(zhì)離子的m/z重疊，那么所述蛋白質(zhì)將也在ptr產(chǎn)物離子質(zhì)譜中見到。

有趣的是，全掃描質(zhì)譜和ptr產(chǎn)物離子質(zhì)譜可提供互補信息，如圖11a和11b中所說明，其表示在三十分鐘層析分離的過程中從在18分鐘9秒的滯留時間下溶離的溶離液獲得的質(zhì)譜結(jié)果。在此實例中，全掃描質(zhì)譜(圖11a)展現(xiàn)具有9534.3da的分子量的基本上單個蛋白質(zhì)的強質(zhì)譜特征，然而，當(dāng)ptr產(chǎn)物離子譜是從在以m/z750th為中心的10th寬窗口(方框530)內(nèi)隔離的離子產(chǎn)生時，質(zhì)譜特征包括來自具有14965.5da的分子量的蛋白質(zhì)(由在近似1247th處的+12電荷態(tài)的峰535最佳表示)以及具有12669.8da、14150.0da、14236.1da、14965.5da和15117.5da的分子量的五個其它微小蛋白質(zhì)的強信號。圖11c是在同一層析分離期間從在22分鐘27秒的滯留時間下溶離的溶離液獲得的全掃描質(zhì)譜。所述譜包含指示具有24961.3da的分子量的蛋白質(zhì)的存在的峰。在隔離窗口540內(nèi)隔離的離子的ptr反應(yīng)后，獲得圖11d中所示的ptr產(chǎn)物離子譜。ptr產(chǎn)物離子譜中的質(zhì)譜特征包含來自具有28461.5da的分子量的蛋白質(zhì)(由在近似1294th處的+22電荷態(tài)的峰545最佳表示)以及具有18590.5da和20168.0da的分子量的兩個其它蛋白質(zhì)的相對強信號。因此，僅從這兩個滯留時間處的數(shù)據(jù)，有可能檢測十一種不同蛋白質(zhì)的存在和分子量。

額外實例

以下段落列出根據(jù)本發(fā)明教示的各種具體實施例的額外具體實例。

實例1.一種用于識別液體樣本內(nèi)的蛋白質(zhì)或多肽分析物化合物的存在或不存在的方法，所述液體樣本包括化合物的混合物，所述混合物包含多種蛋白質(zhì)化合物或多種多肽化合物或多種蛋白質(zhì)和多肽化合物，所述方法包括：

(a)將所述液體樣本的一部分引入到質(zhì)譜儀的電噴射電離源中；

(b)通過電噴射電離形成所述液體樣本的所述部分的所述化合物混合物的帶正電離子，所述帶正電離子包括多個離子物質(zhì)；

(c)隔離包括第一質(zhì)荷比(m/z)比率范圍的所述離子物質(zhì)的第一子集，所述范圍包含所述分析物化合物的特定預(yù)定多質(zhì)子化分子物質(zhì)的m/z比；

(d)通過致使所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集在預(yù)定持續(xù)時間中與反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而從所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集產(chǎn)生多個第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)，所述反應(yīng)劑陰離子在反應(yīng)后從一或多個離子物質(zhì)中的包括蛋白質(zhì)或多肽化合物的質(zhì)子化分子物質(zhì)的每一者提取質(zhì)子；

(e)使用質(zhì)量分析器產(chǎn)生所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)或從所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；

(f)進行對所述第一代或所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述質(zhì)譜的搜索以找到作為所述蛋白質(zhì)或多肽分析物化合物的診斷的一或多個m/z比的集合；以及

(g)如果在所述質(zhì)譜中識別出一或多個m/z比的所述集合，那么識別所述樣本內(nèi)的所述分析物化合物的存在。

實例2.根據(jù)實例1所述的方法，其進一步包括第二次重復(fù)所述步驟(a)到(e)，其中在所述步驟(a)到(e)的所述第二次執(zhí)行期間或之前執(zhí)行所述步驟(f)和(g)。

實例3.根據(jù)實例1所述的方法，其進一步包括多次重復(fù)執(zhí)行步驟(a)到(g)，其中步驟(a)的每一重復(fù)包括將來自對應(yīng)于相應(yīng)滯留時間的層析柱的溶離液引入到所述電噴射電離源中。

實例4.根據(jù)實例1所述的方法，其中所述步驟(f)包括進行對所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述質(zhì)譜的搜索以找到對應(yīng)于所述分析物化合物的多質(zhì)子化離子物質(zhì)序列的一系列m/z比，所述多質(zhì)子化離子物質(zhì)序列相對于所述特定預(yù)定多質(zhì)子化分子物質(zhì)的電荷態(tài)漸進地電荷減少。

實例5.根據(jù)實例1所述的方法，其中：

所述步驟(c)包括進一步隔離所述離子物質(zhì)的第二子集，所述第二子集包括第二m/z比范圍，所述范圍包含第二蛋白質(zhì)或多肽分析物化合物的特定預(yù)定多質(zhì)子化分子物質(zhì)的m/z比；

所述步驟(f)包括進行對所述第一代或所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述質(zhì)譜的額外搜索以找到作為所述第二蛋白質(zhì)或多肽分析物化合物的診斷的一或多個m/z比的第二集合；以及

所述步驟(g)包括如果在所述質(zhì)譜中識別出m/z比的所述第二集合，那么識別所述樣本內(nèi)的所述第二分析物化合物的存在。

實例6.根據(jù)實例5所述的方法，其中所述第一m/z比范圍相同于所述第二m/z比范圍。

實例7.根據(jù)實例5所述的方法，其中所述步驟(c)包括同時隔離包括所述第一m/z比范圍的所述離子物質(zhì)的所述第一子集以及包括所述第二m/z比范圍的所述離子物質(zhì)的所述第二子集以使得所述第一和第二m/z比范圍是非鄰接的。

實例8.根據(jù)實例1所述的方法，其中產(chǎn)生多個第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述步驟(d)包括致使所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集和反應(yīng)劑陰離子在一持續(xù)時間中反應(yīng)，所述持續(xù)時間致使在步驟(e)中的所述質(zhì)譜的后續(xù)產(chǎn)生期間所述產(chǎn)物離子物質(zhì)穩(wěn)定而不會分解。

實例9.根據(jù)實例8所述的方法，其中所述步驟(e)包括使用質(zhì)量分析器產(chǎn)生所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜，所述質(zhì)量分析器通過檢測由離子阱內(nèi)所述產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述離子的運動造成的鏡像電流來產(chǎn)生所述質(zhì)譜。

實例10.根據(jù)實例1所述的方法，其中產(chǎn)生多個第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述步驟(d)包含跨越離子阱的電極施加補充ac電壓，在所述離子阱內(nèi)所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集與反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)，其中所述補充ac電壓的頻率使得禁止所述反應(yīng)劑陰離子與選定的第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)之間的離子-離子反應(yīng)。

實例11.根據(jù)實例10所述的方法，其中所述補充ac電壓的所述頻率使得在步驟(d)的執(zhí)行之后，由所述分析物化合物形成的產(chǎn)物離子大體上作為具有特定電荷態(tài)的單個離子物質(zhì)而存在。

實例12.根據(jù)實例11所述的方法，其中：

所述步驟(e)包括產(chǎn)生所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；以及

其中所述單個離子物質(zhì)的質(zhì)量大于20,000da且所述單個離子物質(zhì)的電荷態(tài)充分大以使得可在所述質(zhì)譜的產(chǎn)生期間通過四極質(zhì)量分析器、傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀或靜電阱質(zhì)量分析器檢測所述單個離子物質(zhì)的離子。

實例13.根據(jù)實例1所述的方法，其中產(chǎn)生質(zhì)譜的所述步驟(e)包括產(chǎn)生第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜，其中所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)是通過以下步驟產(chǎn)生：

隔離包括特定產(chǎn)物離子m/z比范圍的所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)的子集；以及

使所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述隔離的子集分段以便形成片段離子物質(zhì)，其中所述片段離子物質(zhì)包括所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)。

實例14.根據(jù)實例1所述的方法，其中產(chǎn)生質(zhì)譜的所述步驟(e)包括產(chǎn)生第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜，其中所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)是通過以下步驟產(chǎn)生：

致使所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)在第二預(yù)定持續(xù)時間中與所述反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)，其中所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)與所述反應(yīng)劑陰離子之間的反應(yīng)的產(chǎn)物包括所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)。

實例15.根據(jù)實例14所述的方法，其中跨越離子阱的電極施加補充ac電壓，在所述離子阱內(nèi)所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)與所述反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)，其中所述補充ac電壓的頻率使得禁止所述反應(yīng)劑陰離子與選定產(chǎn)物離子物質(zhì)之間的離子-離子反應(yīng)。

實例16.根據(jù)實例1到15中的任一者所述的方法，其進一步包括通過包括以下各項的程序產(chǎn)生包括所述化合物混合物的所述液體樣本：

(i)培養(yǎng)微生物或細(xì)胞；

(ii)裂解所述經(jīng)培養(yǎng)的微生物或細(xì)胞；以及

(iii)從經(jīng)培養(yǎng)的微生物或細(xì)胞的所述裂解物提取蛋白質(zhì)。

實例17.根據(jù)實例16所述的方法，其中從所述裂解物提取所述液體樣本的所述步驟(iii)包含使所述裂解物通過固相提取設(shè)備。

實例18.一種識別樣本中的微生物類型的存在或不存在的方法，其包括：

(i)識別在所述樣本中的同時存在是所述樣本中的所述微生物類型的存在的診斷的分析物化合物的列表，所述分析物化合物的列表包括蛋白質(zhì)化合物、多肽化合物或蛋白質(zhì)和多肽化合物兩者；

(ii)從所述樣本提取包括從樣本導(dǎo)出的蛋白質(zhì)和多肽的混合物的液體溶液；

(iii)對于所述列表中的每一相應(yīng)分析物化合物，執(zhí)行以下步驟：

(a)將所述液體溶液的一部分引入到質(zhì)譜儀的電噴射電離源中；

(b)通過電噴射電離形成所述液體溶液的所述部分的所述化合物混合物的帶正電離子，所述帶正電離子包括多個離子物質(zhì)；

(c)隔離包括第一質(zhì)荷比(m/z)比率范圍的所述離子物質(zhì)的第一子集，所述范圍包含所述相應(yīng)分析物化合物的特定預(yù)定多質(zhì)子化分子物質(zhì)的m/z比；

(d)通過致使所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集在預(yù)定持續(xù)時間中與反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而從所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集產(chǎn)生多個第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)，所述反應(yīng)劑陰離子在反應(yīng)后從一或多個離子物質(zhì)中的包括蛋白質(zhì)或多肽化合物的質(zhì)子化分子物質(zhì)的每一者提取質(zhì)子；

(e)使用質(zhì)量分析器產(chǎn)生所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)或從所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；

(f)進行對所述第一代或所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述質(zhì)譜的搜索以找到作為所述相應(yīng)分析物化合物的診斷的一或多個m/z比的集合；以及

(g)如果在所述質(zhì)譜中識別出一或多個m/z比的所述集合，那么識別所述液體溶液內(nèi)的所述相應(yīng)分析物化合物的存在；以及

(iv)如果在所述液體溶液內(nèi)識別出所述分析物化合物列表的每一和每個分析物化合物的存在，那么識別所述樣本內(nèi)的所述微生物類型的存在。

實例19.一種識別樣本中的微生物類型的存在或不存在的方法，其包括：

(i)識別在所述樣本中的同時存在是所述樣本中的所述微生物類型的存在的診斷的分析物化合物的列表，所述分析物化合物的列表包括蛋白質(zhì)化合物、多肽化合物或蛋白質(zhì)和多肽化合物兩者；

(ii)從所述樣本提取包括從樣本導(dǎo)出的蛋白質(zhì)和多肽的混合物的液體溶液；

(iii)將所述液體溶液的至少第一部分引入到質(zhì)譜儀的電離源中；

(iv)從所述電離源處的所述液體溶液的所述至少第一部分產(chǎn)生所述化合物混合物的帶正電離子，所述帶正電離子包括多個離子物質(zhì)；

(v)隔離所述多個離子物質(zhì)的至少第一子集，所述至少第一隔離的子集的每一隔離的子集包括相應(yīng)質(zhì)荷比(m/z)比率范圍；

(vi)通過使離子物質(zhì)的每一所述隔離的子集在預(yù)定持續(xù)時間中與反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而從離子物質(zhì)的每一隔離的子集產(chǎn)生多個第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)，所述反應(yīng)劑陰離子在反應(yīng)后從離子物質(zhì)的所述隔離的子集的一或多個離子物質(zhì)中的包括蛋白質(zhì)或多肽化合物的質(zhì)子化分子物質(zhì)的每一者提取質(zhì)子；

(vii)使用所述質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器產(chǎn)生第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)或通過所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)的進一步反應(yīng)產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的至少一個質(zhì)譜；

(viii)對于所述列表中的每一相應(yīng)分析物化合物，執(zhí)行以下步驟：

(a)進行對所述第一代或所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述至少一個質(zhì)譜的搜索以找到作為所述相應(yīng)分析物化合物的診斷的一或多個m/z比的集合；以及

(b)如果在所述質(zhì)譜中識別出一或多個m/z比的所述集合，那么識別所述液體溶液內(nèi)的所述相應(yīng)分析物化合物的存在；以及

(ix)如果在所述液體溶液內(nèi)識別出所述分析物化合物列表的每一和每個分析物化合物的存在，那么識別所述樣本內(nèi)的所述微生物類型的存在。

實例20.根據(jù)實例19所述的方法，其中與所述步驟(iii)到(vii)中的一或多者的執(zhí)行同時執(zhí)行所述步驟(a)和(b)的執(zhí)行。

實例21.根據(jù)實例19所述的方法，其中所述微生物類型經(jīng)界定為特定細(xì)菌種類，且所述分析物化合物列表包含作為所述特定細(xì)菌種類的診斷的足夠數(shù)目的分析物化合物以實現(xiàn)所述樣本中所述特定細(xì)菌種類的存在或不存在的識別。

實例22.根據(jù)實例19所述的方法，其中所述微生物類型經(jīng)界定為特定細(xì)菌物質(zhì)，且所述分析物化合物列表包含作為所述特定細(xì)菌物質(zhì)的診斷的足夠數(shù)目的分析物化合物以實現(xiàn)所述樣本中所述特定細(xì)菌物質(zhì)的存在或不存在的識別。

實例23.根據(jù)實例19所述的方法，其中所述微生物類型經(jīng)界定為特定細(xì)菌子物質(zhì)，且所述分析物化合物列表包含作為所述特定細(xì)菌子物質(zhì)的診斷的足夠數(shù)目的分析物化合物以實現(xiàn)所述樣本中所述特定細(xì)菌子物質(zhì)的存在或不存在的識別。

實例24.根據(jù)實例19所述的方法，其中所述微生物類型經(jīng)界定為特定病毒菌株，且所述分析物化合物列表包含作為所述特定病毒菌株的診斷的足夠數(shù)目的分析物化合物以實現(xiàn)所述樣本中所述特定病毒菌株的存在或不存在的識別。

實例25.根據(jù)實例19所述的方法，其中所述微生物類型經(jīng)界定為特定病毒菌株，且所述分析物化合物列表包含作為所述特定病毒菌株的診斷的足夠數(shù)目的分析物化合物以實現(xiàn)所述樣本中所述特定病毒菌株的存在或不存在的識別。

實例26.一種用于識別樣本內(nèi)的蛋白質(zhì)或多肽分析物化合物的存在或不存在的方法，所述樣本包括化合物的混合物，所述混合物包含多種蛋白質(zhì)化合物或多種多肽化合物或多種蛋白質(zhì)和多肽化合物，所述方法包括：

(a)將所述液體樣本的一部分引入到質(zhì)譜儀的電噴射電離源中；

(b)通過電噴射電離形成所述液體樣本的所述部分的所述化合物混合物的帶正電離子，所述帶正電離子包括多個第一代離子物質(zhì)；

(c)隔離包括相應(yīng)質(zhì)荷比(m/z)比率范圍的所述第一代離子物質(zhì)的多個子集，其中每一m/z比范圍包含包括所述分析物化合物的相應(yīng)質(zhì)子化狀態(tài)的離子物質(zhì)的m/z比；

(d)通過致使所述第一代離子物質(zhì)的所述隔離的多個子集在預(yù)定持續(xù)時間中與反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而從所述第一代離子物質(zhì)的所述隔離的多個子集產(chǎn)生多個第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)，所述反應(yīng)劑陰離子在反應(yīng)后從包括所述分析物化合物的相應(yīng)質(zhì)子化狀態(tài)的每一離子物質(zhì)提取質(zhì)子；

(e)產(chǎn)生所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；以及

(f)如果所述質(zhì)譜包括在相應(yīng)預(yù)定m/z比處的包括高于預(yù)定閾值的相應(yīng)強度的一或多條線，那么識別所述樣本內(nèi)的所述分析物化合物的存在，或否則識別所述樣本內(nèi)的所述分析物化合物的不存在。

實例27.根據(jù)實例26所述的方法，其進一步包括多次重復(fù)執(zhí)行步驟(a)到(f)，其中步驟(a)的每一重復(fù)包括將來自對應(yīng)于相應(yīng)滯留時間的層析柱的溶離液引入到所述電噴射電離源中。

實例28.根據(jù)實例26所述的方法，其中所述步驟(f)進一步包括如果所述質(zhì)譜包括在相應(yīng)預(yù)定m/z比處的包括高于預(yù)定閾值的相應(yīng)強度的一或多條線，那么基于所述一或多個強度確定所述樣本內(nèi)的所述分析物化合物的數(shù)量或濃度。

實例29.根據(jù)實例26所述的方法，其進一步包括在形成帶正電離子的所述步驟(b)之后且在隔離所述第一代離子物質(zhì)的多個子集的所述步驟(c)之前的以下步驟：

(b1)隔離包括隨機選擇的質(zhì)荷比(m/z)比率范圍的所述第一代離子物質(zhì)的子集；

(b2)通過致使所述第一代離子物質(zhì)的所述隔離的子集與反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而從所述第一代離子物質(zhì)的所述隔離的子集產(chǎn)生多個產(chǎn)物離子物質(zhì)，所述反應(yīng)劑陰離子在反應(yīng)后從包括所述分析物化合物的相應(yīng)質(zhì)子化狀態(tài)或者另一蛋白質(zhì)或多肽化合物的相應(yīng)質(zhì)子化狀態(tài)的每一離子物質(zhì)提取質(zhì)子；

(b3)產(chǎn)生所述產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；以及

(b4)基于所述產(chǎn)物離子的所述質(zhì)譜自動確定在所述后續(xù)步驟(c)中將使用的所述m/z比范圍。

實例30.根據(jù)實例28所述的方法，其中所述步驟(b4)包括從所述質(zhì)譜自動確定對應(yīng)于另一蛋白質(zhì)或多肽化合物的多質(zhì)子化離子物質(zhì)的m/z比的集合。

實例31.一種識別樣本中的微生物的存在或不存在的方法，其包括：

制作所述樣本的提取物；

重復(fù)執(zhí)行根據(jù)實例26所述的方法以便在每一執(zhí)行識別所述樣本提取物內(nèi)的不同相應(yīng)蛋白質(zhì)或多肽分析物化合物的存在或不存在；以及

如果所述樣本提取物內(nèi)每一相應(yīng)蛋白質(zhì)或多肽分析物化合物存在，那么識別所述樣本內(nèi)的所述微生物的存在，或否則識別所述樣本內(nèi)的所述微生物的不存在。

結(jié)論

如本文檔中教示的離子-離子反應(yīng)的ptr類型的使用具有若干優(yōu)點用于蛋白質(zhì)或多肽離子的復(fù)雜混合物的分析。通過比較圖3與圖4可容易觀測到第一顯著優(yōu)點是由極大地改進的信噪比提供。即使由于ptr過程而丟失一些電荷(即，完全中和)，由于多電荷蛋白質(zhì)與單電荷陰離子的反應(yīng)也獲得顯著信噪比。此反應(yīng)的速率與電荷的乘積的平方成比例。因此，最初高度帶電分析物離子轉(zhuǎn)換為較少帶電ptr產(chǎn)物離子，其質(zhì)譜特征在顯著較大質(zhì)荷比處出現(xiàn)。相比之下，低電荷態(tài)化學(xué)背景離子在典型實驗反應(yīng)周期期間受ptr過程影響顯著較少，原因是這些離子的反應(yīng)的低速率。此過程基本上從低質(zhì)量、低電荷態(tài)化學(xué)背景“噪聲”移除了蛋白質(zhì)和多肽的質(zhì)譜特征。舉例來說，如圖4中所示，背景離子由在m/z≈642的“左后方”的大的單電荷峰表示。還認(rèn)為仍粘附到大蛋白質(zhì)的加成物或水分子由于由ptr反應(yīng)沉積的發(fā)熱反應(yīng)熱(至少125千卡/摩爾)而移除。此些離子變換為簡單質(zhì)子化分子可進一步增強信噪比特性。潛在地，經(jīng)由此方法獲得的蛋白質(zhì)識別的數(shù)目可超過利用某一形式的分離技術(shù)的當(dāng)前復(fù)雜的從上到下方法。

與根據(jù)本發(fā)明教示的方法相關(guān)聯(lián)的第二重要優(yōu)點是由極大地改進的電荷態(tài)指派提供。舉例來說，本發(fā)明人已經(jīng)以實驗方式確定，通過采用根據(jù)本發(fā)明教示的方法可正確地指派用于個別電荷態(tài)的電荷態(tài)指派的近似75％。此改進的辨識電荷態(tài)的能力是得自顯著改進的信噪比。這又提供蛋白質(zhì)或多肽的分子量的較準(zhǔn)確確定。此比較適用于經(jīng)常用于實時電荷態(tài)確定的當(dāng)前patterson-fft電荷態(tài)算法。與根據(jù)本發(fā)明教示的方法相關(guān)聯(lián)的另一重要優(yōu)點是由執(zhí)行快速處理量分析的能力提供。當(dāng)與上文應(yīng)用的快速部分層析分離技術(shù)結(jié)合時，這些方法允許在一分鐘或更短的時間尺度上以高處理量方式分析樣本。

本申請中所包括的論述是希望充當(dāng)基本描述。盡管已經(jīng)根據(jù)所展示和描述的各種實施例描述了本發(fā)明，但所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將容易認(rèn)識到，可以存在對這些實施例的變化，并且那些變化將在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。因此，讀者應(yīng)該知道，具體的論述可以不明確地描述所有可能的實施例；很多替代方案是隱含的。因此，在不脫離如權(quán)利要求書所描述的本發(fā)明的范圍的情況下，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可做出許多修改。描述和術(shù)語均不希望限制本發(fā)明的范圍。本文中提到的任何專利、專利申請案、專利申請公開案或其它文獻在此被以引用的方式按其相應(yīng)的全部內(nèi)容并入本文中，如同在本文中被充分闡明一般。

附錄-數(shù)學(xué)計算方法

例如蛋白質(zhì)等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的電離分子的結(jié)構(gòu)闡明常常使用耦合到液體層析儀的串連質(zhì)譜儀實行。對從通過液相層析(lc)分離的化合物產(chǎn)生的離子進行質(zhì)譜法(ms)分析的一般技術(shù)可被稱為“l(fā)c-ms”。如果質(zhì)譜法分析作為串連質(zhì)譜法(ms/ms)進行，那么上述程序可被稱為“l(fā)c-ms/ms”。在常規(guī)lc-ms/ms實驗中，初始地通過質(zhì)譜法分析樣本以確定對應(yīng)于所關(guān)注的峰的質(zhì)荷比(m/z)。隨后通過對選定峰執(zhí)行產(chǎn)物離子ms/ms掃描而進一步分析樣本。具體地說，在經(jīng)常稱為“ms¹”的分析的第一階段中，獲得包括初始調(diào)查掃描的全掃描質(zhì)譜。此全掃描譜之后是一或多個前驅(qū)體離子物質(zhì)的選擇(從獲得的結(jié)果中)。選定物質(zhì)的前驅(qū)體離子經(jīng)受反應(yīng)，一般例如可采用碰撞池或采用另一形式的分段單元(例如采用表面引發(fā)的解離、電子轉(zhuǎn)移解離或光解離的那些)而實現(xiàn)分段。在第二階段中，檢測所得片段(產(chǎn)物)離子以用于使用同一或第二質(zhì)量分析器進行進一步分析(經(jīng)常稱為“ms/ms”或“ms²”)。所得產(chǎn)物譜展現(xiàn)一組分段峰(片段集合)，其在許多情況下可用作導(dǎo)出與前驅(qū)體肽或蛋白質(zhì)或其它生物化學(xué)寡聚物相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息的手段。應(yīng)注意，使用片段離子作為起始群體，離子選擇和后續(xù)分段的過程可再次重復(fù)，進而產(chǎn)生“ms³”譜。在一般情況中，在選擇和分段的(n-1)次迭代階段之后獲得的質(zhì)譜可被稱為“msⁿ”譜。這是耗時的過程，因為樣本需要分析至少兩次且僅針對有限數(shù)目的組分記錄ms/ms數(shù)據(jù)。

能夠串連分析的大多數(shù)當(dāng)前可用的質(zhì)譜儀配備有自動數(shù)據(jù)相依性功能，借此當(dāng)從ms¹中的離子峰選擇用于ms²分析的前驅(qū)體離子時以逐漸減小的強度選擇離子前驅(qū)體。在圖12a中所示的簡單數(shù)據(jù)相依性實驗中，檢測器連續(xù)地測量可歸因于進入質(zhì)譜儀檢測器的離子的總電流。設(shè)定總離子電流的閾值強度水平a8，在低于此水平下僅獲取ms¹數(shù)據(jù)。在作為峰a10所檢測的第一組分溶離時，總離子電流強度在時間t1跨越閾值a8。當(dāng)這發(fā)生時，質(zhì)譜儀的機載處理器或其它控制器確定ms¹譜中的最強烈離子且立即起始關(guān)于最強烈離子的ms/ms掃描。隨后，檢測另一溶離峰a12的前邊緣。當(dāng)總離子電流在時間t3再次突破閾值強度a8時，關(guān)于在時間t3之后檢測到的最強烈離子起始ms/ms掃描。大體上，峰a12將對應(yīng)于不同化學(xué)組分的溶離，且因此在時間t3之后檢測到的最充足離子將不同于在溶離峰a10期間進行其ms/ms分析的離子。以此方式，對每一組分在其溶離時獲取ms和ms/ms譜兩者。

上述簡單數(shù)據(jù)相依性實驗對于層析解析或部分地解析的組分良好地起作用，如在圖12a中說明。然而，在極復(fù)雜的混合物中可能存在溶離峰完全重疊的組分，如圖12b中離子電流強度對滯留時間的曲線圖所說明。在此實例中溶離峰a11表示可歸因于離子m11的離子電流，且溶離峰a13表示可歸因于離子m13的離子電流，這些離子的質(zhì)量在插圖方框a16中的質(zhì)譜表示中示意性地說明。在圖12b中所示的假設(shè)情形中，存在引起離子m11和m13的化合物的溶離的幾乎完全重疊，其中在溶離過程期間離子m11的質(zhì)譜強度始終大于離子m13的質(zhì)譜強度。在這些條件下，上文參考圖12a所論述的簡單數(shù)據(jù)相依性技術(shù)將不能一直起始離子m13(及可能其它重要離子)的ms/ms分析，因為將僅選擇最密集組分(m11)用于ms/ms。

在圖12b中說明的假設(shè)兩個離子情形是簡化實例。大多數(shù)現(xiàn)代的質(zhì)譜儀儀器能夠關(guān)于ms¹分析中所檢測的若干充足離子中的每一相應(yīng)一者執(zhí)行一系列ms/ms分析。通常，替代于挑選僅單個最充足的前驅(qū)體，現(xiàn)代的儀器將基于先前ms¹數(shù)據(jù)獲取的信息而選擇“最高p數(shù)目的最充足前驅(qū)體”用于串連質(zhì)量分析，其中數(shù)目p是常數(shù)或可能是由用戶輸入的變量。但是，由圖12b表明的基本問題尤其對于可能引起單個質(zhì)譜中的數(shù)十到數(shù)百個質(zhì)譜峰的生物聚合物分析物的多組分樣本仍然存在。無論如何將此樣本引入到質(zhì)譜儀(例如，通過層析分離、流動注入或毛細(xì)電泳法；作為從芯片實驗室裝置遞送的單獨化學(xué)品，通過灌注或其它方法)，都可以在來自單個時間點的單個質(zhì)譜中表示多于一個分析物，且每一此類分析物可引起許多離子，如在圖12c中說明的假設(shè)質(zhì)譜中所說明。在圖12c中，由包絡(luò)a208概括的實心垂直線表示從第一分析物化合物產(chǎn)生的質(zhì)譜峰的第一集合的質(zhì)心，且由包絡(luò)a206概括的點線垂直線表示從第二共溶離分析物化合物產(chǎn)生的質(zhì)譜峰的第二集合的質(zhì)心。顯然，即使有待分析的最充足的峰的數(shù)目p等于例如10，也多于將選擇分析物化合物中的僅一者的離子用于使用上述傳統(tǒng)的數(shù)據(jù)相依性方法進行ms/ms分析。與第二分析物相關(guān)的信息將丟失。此外，因此獲得的數(shù)據(jù)將包括關(guān)于同一組分的冗余信息。

為了更成功地解決共溶離化合物的質(zhì)譜分析的復(fù)雜度，許多質(zhì)譜儀器還采用所謂的“動態(tài)排除”原理，借此在獲取其msⁿ譜之后將質(zhì)荷比臨時放入排除列表中。msⁿ不再次分析排除的質(zhì)荷比，直到在先前msⁿ譜獲取之后已經(jīng)過某一持續(xù)時間為止。此技術(shù)使同一前驅(qū)體離子在若干后續(xù)掃描中分段的機會最小化，且允許質(zhì)譜儀收集關(guān)于原本將不檢查的具有較不密集峰的其它組分的msⁿ譜。在選定時間周期之后，將從列表移除排除的離子以使得可分析具有相同質(zhì)荷比的任何其它化合物。離子物質(zhì)在排除列表上的此持續(xù)時間一般是基于平均或估計層析峰寬度而估計。因此，動態(tài)排除原理的使用允許關(guān)于復(fù)雜混合物中的更多組分獲得更多數(shù)據(jù)。

不利的是，現(xiàn)有動態(tài)排除技術(shù)對于分析復(fù)雜生物分子的混合物的質(zhì)譜可能表現(xiàn)不良。舉例來說，再次考慮在圖12c中說明的假設(shè)情形。如果使用動態(tài)排除原理分析圖12c中所描繪的離子，那么將通過msⁿ分析按所說明的ms¹譜中其強度的降序分析從單個分析物導(dǎo)出的至少10個離子物質(zhì)(由包絡(luò)a208概括)，然后才考慮來自較低豐度分析物的任何峰(由包絡(luò)a206概括)。無論每一前驅(qū)體每一離子物質(zhì)在其相應(yīng)分析之后放置到排除列表上的事實，此序列都將發(fā)生。執(zhí)行十次不必要的冗余msⁿ分析消耗的時間量接著可導(dǎo)致最充足的離子的排除時間的到期(或可導(dǎo)致可用于完全分析少量最充足離子的時間的耗盡)，在此之后可重復(fù)msⁿ分析的整個序列。

將動態(tài)排除原理應(yīng)用于復(fù)雜生物分子的混合物的質(zhì)量分析中的另一并發(fā)因素得自以下事實：各種化合物的溶離分布是高度可變的且難以預(yù)測。由于層析固定相與具有多個分子交互位點的生物聚合物之間的復(fù)雜交互，不同生物聚合物化合物可展現(xiàn)不同溶離分布。此外，由于質(zhì)譜儀的電離源內(nèi)的電離抑制，從甚至單個此類化合物產(chǎn)生的各種離子的時間分布可能不能與未電離化合物的溶離分布相關(guān)或者與彼此的分布相關(guān)。

作為可能遇到的溶離分布變化率的實例，圖13說明從大腸桿菌提取物的單個液相層析質(zhì)譜法實驗運行收集的一組層析圖?？傠x子電流在最上部層析圖(曲線a40)中示出，且說明由相應(yīng)m/z比率范圍貢獻的離子電流的各種提取離子層析圖在最下部五個繪圖(曲線a50、a60、a70、a80和a90)中示出。曲線a50表示m/z范圍660.0-660.5da。類似地，曲線a60、a70、a80和a90表示m/z范圍700.5-701.5da、1114.5-1114.5da、942.5-943.5da和540.5-540.5da。峰a1、a2和a3是具有寬層析分布的峰的實例。峰a4和a5是窄的分布的實例。峰a6展示極寬的峰。峰寬度跨越一數(shù)量級，因此嚴(yán)重限制具有預(yù)定義排除持續(xù)時間的排除列表的適用性。為了解決以上計算困難，以下描述改進的經(jīng)優(yōu)化計算方法，用于進行電荷態(tài)指派且用于多路復(fù)用電荷態(tài)分布的實時辨識，此方法稱為“最高p個唯一分析物特定群集”的。

2.1.自一致映射電荷指派算法的關(guān)鍵特征

2.1.1.專門質(zhì)心的使用。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜電荷指派算法(例如，senko等，1995)使用質(zhì)譜中的線的全分布數(shù)據(jù)。相比之下，本發(fā)明方法中采用的新穎方法使用質(zhì)心。使用線分布上的質(zhì)心的關(guān)鍵優(yōu)點是數(shù)據(jù)精簡。通常分布數(shù)據(jù)點的數(shù)目大約比質(zhì)心的數(shù)目大一個數(shù)量級。使用質(zhì)心的任何算法將獲得優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)指派方法的計算效率的顯著優(yōu)點。對于需要實時電荷指派的應(yīng)用，優(yōu)選地設(shè)計僅需要質(zhì)心數(shù)據(jù)的算法。使用質(zhì)心的主要缺點是m/z值的不精確性。例如質(zhì)量準(zhǔn)確性、分辨率和峰挑選效率等因素全部趨于影響質(zhì)心數(shù)據(jù)的質(zhì)量。但這些問題可通過將m/z不精確性納入采用質(zhì)心數(shù)據(jù)的算法中而大部分減輕。

2.1.2.強度是二進制的。與大多數(shù)現(xiàn)有算法的另一關(guān)鍵不同是根據(jù)本發(fā)明方法將強度編碼為二進制(或布爾型)變量(真/假或存在/缺乏)。本發(fā)明方法僅考慮質(zhì)心強度是否高于閾值。如果強度值滿足基于信號強度或信噪比或這兩者的用戶可設(shè)定準(zhǔn)則，那么所述強度值采用布爾型“真”值，否則指派“假”的值，無論所述強度的實際數(shù)字值如何。數(shù)字值作為簡單二進制值的編碼再次帶來顯著的數(shù)據(jù)精簡。在許多編程語言中，雙精度值使用八字節(jié)的存儲器存儲，而二進制(或布爾型)值使用僅單個字節(jié)。并且，布爾型量的比較固有地比雙精度變量的比較快得多。使用布爾型值的眾所周知的缺點是信息的損失。然而，如果具有大量的數(shù)據(jù)點要處理，例如典型高分辨率譜中的數(shù)千個質(zhì)心，那么通過布爾型變量的絕對數(shù)目來較多地補償強度信息的損失。因此，發(fā)明人的方法及因此本文教示的算法利用此數(shù)據(jù)豐度來實現(xiàn)效率和準(zhǔn)確性兩者。

但是，可通過使用近似強度值而不是僅布爾型真/假變量來實現(xiàn)無顯著計算速度損失的額外準(zhǔn)確性。舉例來說，可設(shè)想其中僅將類似高度的峰彼此進行比較的情形?？赏ㄟ^將強度值離散化為少量低分辨率二進位(例如，“低”、“中”、“高”和“極高”)而容易地適應(yīng)添加的信息。此二進位化可實現(xiàn)具有“高度信息”的良好平衡，而不會犧牲強度的極簡化表示的計算簡單性。

2.1.3.將質(zhì)荷比值變換且組合為低分辨率二進位，且預(yù)先計算相對電荷態(tài)間隔一次且高速緩沖存儲以獲得效率。本發(fā)明中教示的方法的另一創(chuàng)新在于質(zhì)譜線的m/z值從其以道爾頓計的正常線性標(biāo)度變換為更自然的無量綱對數(shù)表示。如從以下具體論述可見，此變換極大地簡化屬于例如同一蛋白質(zhì)但表示潛在不同電荷態(tài)的任何峰的m/z值的計算。此變換不涉及精度的降低。當(dāng)執(zhí)行經(jīng)變換變量的計算時，可利用高速緩沖存儲的相對m/z值以改善計算效率。

2.1.4.基于簡單計數(shù)的計分和統(tǒng)計選擇準(zhǔn)則組合質(zhì)心強度作為布爾型值的編碼以及m/z值的變換，本發(fā)明方法將所討論的任何質(zhì)譜的整個內(nèi)容編碼為單布爾型值陣列。電荷態(tài)的計分減少到在適合于正查詢的電荷態(tài)的經(jīng)變換m/z位置處布爾型變量的是或否(真或假)的簡單計數(shù)。此方法再次繞過涉及雙精度變量的計算上代價大的操作。一旦針對某一范圍的潛在電荷態(tài)編譯出得分，便可通過簡單統(tǒng)計程序容易地拾取最優(yōu)值。使用統(tǒng)計準(zhǔn)則比使用任意得分截止或僅挑選最高計分電荷態(tài)更嚴(yán)格且可靠。

2.1.5.實現(xiàn)最優(yōu)性且由電荷指派的完全自一致性界定的迭代過程本發(fā)明新穎方法的最終關(guān)鍵特征是使用將電荷指派導(dǎo)向解決方案的適當(dāng)最優(yōu)性條件。最優(yōu)條件簡單地經(jīng)界定為譜的所有質(zhì)心的電荷的最一致指派。此條件下是推斷指派給每一質(zhì)心的電荷態(tài)應(yīng)當(dāng)與指派給譜中的其它質(zhì)心的那些電荷態(tài)一致。本發(fā)明算法實施迭代程序以產(chǎn)生如以上最優(yōu)性條件所指導(dǎo)的電荷態(tài)指派。此程序符合優(yōu)化程序的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)。即，首先界定適當(dāng)最優(yōu)性條件，并且然后設(shè)計算法以滿足此條件，并且最后可接著通過算法滿足最優(yōu)性條件的良好程度來判斷所述算法的有效性。大多數(shù)現(xiàn)有方法缺乏此邏輯框架，且其理論優(yōu)點因此難以客觀地評估。

2.2.分解算法的細(xì)節(jié)

本發(fā)明人已開發(fā)尤其能夠?qū)⒆砸恢码姾蓱B(tài)指派到質(zhì)譜線且將包括關(guān)于若干分析物的重疊信息的復(fù)雜質(zhì)譜分解為多個線集合的方法，其中每一線集合對應(yīng)于相應(yīng)分析物。圖14是用于實現(xiàn)這些結(jié)果的根據(jù)本發(fā)明教示的一般步驟集合的概述流程圖。圖14中列出的若干操作在伴隨的附圖集合的其它流程圖中更詳細(xì)說明。

2.2.1.高級方法。如圖所示，圖14描繪至少兩個一般執(zhí)行或工作流路徑。根據(jù)第一一般執(zhí)行路徑或工作流，此處僅出于參考目的而被稱為“文件解卷積工作流”，采用本發(fā)明教示的方法以用于分析且可能解譯先前收集且存儲的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的目的。根據(jù)第二一般執(zhí)行路徑或工作流，此處僅出于參考目的而被稱為“數(shù)據(jù)相依性獲取工作流”，在正獲取質(zhì)譜數(shù)據(jù)時以“實時”或“在線”方式采用本發(fā)明教示的方法，且基于根據(jù)本發(fā)明的計算或算法的結(jié)果而確定或控制數(shù)據(jù)獲取過程的至少一些方面。圖14中說明的一些步驟是上文界定的執(zhí)行路徑兩者所共同的，且在圖14中由雙線界定的方框表示。其它步驟是數(shù)據(jù)相依性獲取工作流路徑專有的，且由虛線界定的方框表示。至少一個步驟步驟a312是文件解卷積工作流路徑專有的，且由點線界定的方框表示。最后，由具有單實線的方框描繪的步驟a920和a925是關(guān)于數(shù)據(jù)相依性獲取工作流任選的，但將一般與文件解卷積工作流結(jié)合而執(zhí)行。文件解卷積工作流將通常跟隨由圖14的下部部分的點線箭頭指示的一般路徑。

仍參考圖14，文件解卷積工作流在步驟a312開始，其中呈至少一個質(zhì)譜形式的先前所獲取且存儲的質(zhì)譜數(shù)據(jù)從電子存儲裝置輸入且可用于后續(xù)分析中的使用。所述質(zhì)譜可為ms¹譜、ms²譜或大體上任何形式的msⁿ譜。相比之下，數(shù)據(jù)相依性獲取工作流開始于步驟a310，其中將樣本引入到質(zhì)譜儀中且隨后在步驟a315中電離。所述樣本引入可借助于注入或其它手段而來自層析儀。在步驟a320中產(chǎn)生離子的ms¹譜。假定在包含步驟a312的替代路徑中輸入的數(shù)據(jù)的產(chǎn)生中已經(jīng)執(zhí)行類似于步驟a310、a315和a320的步驟。

在步驟a325中，識別新的峰質(zhì)心(即，在所討論的實驗期間或在輸入數(shù)據(jù)的ms¹譜中先前未識別的質(zhì)心)且添加到質(zhì)心列表。在下一步驟a400中，變換質(zhì)心的m/z值且將強度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成布爾型值數(shù)據(jù)陣列，其中在經(jīng)變換m/z尺度上指派二進位。步驟a400包括構(gòu)造且填充布爾型占用陣列的第一子步驟a420以及構(gòu)造且填充相對分離矩陣的第二子步驟a460(參見圖15)。在本發(fā)明的后續(xù)部分中更詳細(xì)地描述這些子步驟的細(xì)節(jié)。

在僅應(yīng)用于數(shù)據(jù)相依性獲取工作流的步驟a510中，如果正對組成是時變的樣本(例如對來自層析柱的流出物)執(zhí)行質(zhì)量分析，那么從“選擇列表”移除已完成msⁿ分析的分析物的質(zhì)心且可添加到“排除列表”。選擇列表包含有待分析或正通過串連質(zhì)量分析(ms/ms分析)或可能msⁿ分析而由質(zhì)譜儀分析的一或多個質(zhì)荷比(m/z)值或值范圍，每一此類m/z值或范圍對應(yīng)于如通過本發(fā)明教示的方法識別的樣本的化學(xué)組分。所述排除列表包含在實驗的持續(xù)時間或?qū)嶒炂陂g的臨時時間周期中將從未來分析排除的一或多個質(zhì)荷比(m/z)值或值范圍?？筛鶕?jù)本發(fā)明教示的方法確定臨時時間周期(如果采用)，如本發(fā)明的后續(xù)部分中所描述。替代地對于直接輸注或流動注射分析，可基于信號等級而執(zhí)行將從未來分析排除的所述一或多個質(zhì)荷比值或值范圍。在步驟a515中從排除和選擇列表移除描繪低強度質(zhì)譜線的質(zhì)心。如果對應(yīng)質(zhì)譜信號強度隨后在實驗運行期間增加，那么稍后可將移除的m/z值或范圍添加到選擇列表。

在步驟a600中，做出嘗試性的電荷態(tài)指派，如圖17中概括以及下文參考所述圖進一步論述。隨后，在步驟a700中，使用自一致性的要求調(diào)整嘗試性地指派的電荷態(tài)且做出最終電荷態(tài)指派。此過程的細(xì)節(jié)在圖18中概括且下文參考所述圖進一步論述。一旦已經(jīng)做出最終電荷態(tài)指派，則在步驟a800中使用從同位素群集的間距導(dǎo)出的信息將以實驗方式觀測到的質(zhì)心分解為分析物特定的群集。步驟a800的細(xì)節(jié)在圖19中說明且參考所述圖進一步描述。

方法a300的執(zhí)行可在步驟a910處沿著分別由實線箭頭和點線箭頭指示的兩個可能的執(zhí)行路徑中的一者分支。如果通過先前數(shù)據(jù)分析的結(jié)果控制實時串連質(zhì)譜法，那么方法執(zhí)行可跟隨從步驟a910直接到步驟a915的“否”分支(由實線表示)，從而跳過步驟a920和a925。替代地，如果將對在步驟a320中測得的ms¹數(shù)據(jù)進行更多數(shù)據(jù)分析操作或者如果在步驟a312中先前輸入數(shù)據(jù)，那么跟隨步驟a910的“是”分支，然后可計算分子量或識別分析物物質(zhì)(步驟a920)，且可報告或存儲計算的結(jié)果(步驟a925)。如在步驟a915處所確定，如果將執(zhí)行串連質(zhì)譜法，如將一般跟隨數(shù)據(jù)相依性獲取工作流執(zhí)行路徑的情況，那么所述方法沿著“是”分支而分支到步驟a930。否則，執(zhí)行沿著“否”分支前進到步驟a960。

現(xiàn)在考慮在圖14的右側(cè)上說明的“在線”執(zhí)行路徑，在步驟a930中做出所考慮質(zhì)心集合中是否存在可歸因于已知加成物的質(zhì)心的確定。如此(步驟a930的“是”分支)則在步驟a935中將對應(yīng)于加合物物質(zhì)或另外經(jīng)改質(zhì)物質(zhì)(例如從中性分子的損失產(chǎn)生的物質(zhì))的質(zhì)心添加到排除列表。否則，繞過步驟a935。步驟a940是從上到下分析的開始，其中從在步驟a800中確定的最高p個分析物特定群集中的每一者選擇代表性峰用于分段。以下步驟a945、a950和a955分別是隔離對應(yīng)于選定質(zhì)心的m/z比的離子、對隔離的離子進行分段以及執(zhí)行產(chǎn)物離子的質(zhì)量分析(ms²)的常規(guī)步驟。

如果質(zhì)譜實驗或數(shù)據(jù)分析完成，那么方法a300的執(zhí)行可在步驟a960之后結(jié)束。否則，執(zhí)行返回至將樣本的下一部分引入到質(zhì)譜儀的步驟a310或返回至輸入質(zhì)譜數(shù)據(jù)的下一部分的步驟a312。

2.2.2.建置布爾型值占用陣列。圖16展示建置占用陣列[ok]的步驟a420的細(xì)節(jié)。所述陣列值是布爾型變量，且所述陣列的索引對應(yīng)于離散經(jīng)變換質(zhì)量/電荷值。步驟a420采取質(zhì)心集合ci(1≤i≤l)作為輸入，其中l(wèi)是觀測到的質(zhì)譜線的數(shù)目。每一ci的特征在于其質(zhì)量/電荷(m/z)i、其強度ii、其信噪比(s/n)i及其分辨率ri。接著，借助收集通過了強度和信噪比閾值的用戶可設(shè)定準(zhǔn)則的質(zhì)心的子集{f}而執(zhí)行質(zhì)心的過濾(步驟a422)。接著，在步驟a424中，通過采取質(zhì)量/電荷值減去質(zhì)子的質(zhì)量mproton的自然對數(shù)而對{f}中的每一ci執(zhí)行質(zhì)量/電荷變換，如等式1中那樣。

t(m/z)i＝ln((m/z)i-mproton)等式(1)

在此變換之后，子集{f}中的每一質(zhì)心ci的特征在于t(m/z)i、ii、(s/n)i和ri。在步驟a426中標(biāo)注來自子集{f}的t(m/z)值的最大值t(m/z)high和最小值t(m/z)low。此信息隨后用以產(chǎn)生值的陣列[ok]，其中所述陣列的每一元素是布爾型值“占用”，其維持“信號”是否被認(rèn)為在與所述陣列元素相關(guān)聯(lián)的相應(yīng)經(jīng)變換質(zhì)荷比值t(m/z)k處發(fā)生的記錄。在創(chuàng)建后，將所述陣列的每一元素ok初始化為布爾型值“假”。陣列中的離散元素的數(shù)目或陣列[ok]的“長度”表示為loccs，其確定為

其中d是陣列中的每一二進位的寬度且d＝ma/10⁶，其中通常為10的ma表示所關(guān)注的譜的質(zhì)量準(zhǔn)確性的用戶可設(shè)定參數(shù)。

在創(chuàng)建和初始化之后，必須以有意義的值填充陣列[ok](在步驟a436中執(zhí)行)。占用陣列[ok]的元素是以變量k(1≤k≤loccs)作索引，而經(jīng)過濾質(zhì)心子集{f}的元素是以變量i作索引。后者的索引在步驟a430中轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的k值，其中對于子集{f}中的每一質(zhì)心ci，對應(yīng)索引ki確定如下：

且被舍入到最近的整數(shù)(舍入操作由圖16中的算子“round[]”指示。如果質(zhì)心ci的分辨率ri可用(例如質(zhì)心模式中收集的那些的某個譜可能未做出此界定)，那么跟隨決策步驟a432的“是”分支，其中在步驟a434a中計算額外索引和如下

其中值舍入到最近的整數(shù)。在其中ri不可用的情況下，這些索引實際上在步驟a434b中分別設(shè)定成ki-1和ki+1。最后，在步驟a436中，將陣列值全部設(shè)定成用于范圍從到的索引的布爾型值“真”，即

ok:＝真；

2.2.3.建置相對分離矩陣(rsm)。如圖15中所示，步驟a460是構(gòu)造相對分離矩陣的步驟且是一般步驟a400的第二子步驟。相對分離矩陣的創(chuàng)建是通過以下觀測而促動：給定兩個質(zhì)心c1和c2，則如果它們屬于同一蛋白質(zhì)同位素峰但恰好電荷態(tài)不同，那么其質(zhì)量/電荷值如下相關(guān)

|z1|×((m/z)1-mproton)＝|z2|×((m/z)2-mproton)等式(6)

其中z1和z2分別是質(zhì)心c1和c2的電荷態(tài)，且mproton是質(zhì)子的質(zhì)量。電荷態(tài)值z1和z2將一般為全正或全負(fù)，這取決于進行分析的質(zhì)譜儀儀器中使用的電離模式。執(zhí)行如等式(1)中所描述的變換產(chǎn)生以下關(guān)系：

t(m/z)1＝t(m/z)2+ln|z2/z1|等式(7)

等式(7)的重要性質(zhì)在于在不同電荷態(tài)下的經(jīng)變換t(m/z)i值是通過獨立于經(jīng)變換值的相加性因數(shù)而相關(guān)。因此可預(yù)先計算且高速緩沖存儲量ln(z2/z1)作為可通過預(yù)先計算rsm的簡單查詢而在后續(xù)計算中再使用的矩陣。電荷態(tài)的絕對值將一般范圍在單位一與某個最大值|zmax|之間，或更具體來說1≤z1，z2≤|zmax|。最后步驟是通過如等式(4)中除以d而離散化ln|z2/z1|矩陣：

由zmax確定的矩陣的限制可由用戶預(yù)期在譜的集合中將遇到的最大和最小電荷態(tài)來設(shè)定。替代地，zmax可為預(yù)定或預(yù)先計算的值。通常，對于從上到下的實驗，電荷態(tài)的絕對值范圍是從1到50。因此在此情況下，rsm將為50x50反對稱矩陣。

2.2.4.建置每一質(zhì)心的計分分布且將其用于指派試驗性的電荷態(tài)。在可通過迭代確定電荷指派的自一致集合(在圖18的步驟a700中)之前，必須調(diào)配試驗性的電荷指派的合理初始集合。圖17a和17b中展示其細(xì)節(jié)的步驟a600通過將可能的電荷態(tài)指派到子集{f}的各質(zhì)心而產(chǎn)生此初始集合。步驟a601-a615考慮每一此類質(zhì)心，又并且針對每一考慮的質(zhì)心，從最小電荷態(tài)值zmin直到最大電荷態(tài)值zmax逐步通過假定電荷態(tài)z的假定值。舉例來說，可能針對每一質(zhì)心考慮從z＝1到z＝50的假定電荷態(tài)。對于質(zhì)心ci的每一組合(如在步驟a601或步驟a615中選擇)和假定的電荷態(tài)zi(如步驟a609的a603中設(shè)定)，在步驟a605中計算“探測索引”kp(ci,zi)的集合。探測索引是為了測試在這些索引中的每一者處的“真”值的目的而參考占用陣列[ok]的二進位的k值的集合。kp(ci,zi)矩陣包含的第一行的索引對應(yīng)于選定質(zhì)心ci的(+/-m)理論同位素峰的離散化t(m/z)i值。舉例來說，如果m＝5，那么對應(yīng)于(+/-5)理論同位素峰的探測索引是如下的經(jīng)變換值：

kp(ci,zi)矩陣還包含兩個額外行，其元素是通過針對上述行中的2m個探測索引中的每一者產(chǎn)生對應(yīng)于z-1峰的預(yù)期位置的額外探測索引以及對應(yīng)于z+1峰的預(yù)期位置的另一額外探測索引而計算出。具體地說，產(chǎn)生索引[kp(ci,zi)+rsm(zi-1,zi)]和[kp(ci,zi)+rsm(zi+1,zi)]，其中rsm是上述預(yù)先計算且高速緩沖存儲的相對分離矩陣。應(yīng)注意質(zhì)心ci自身的ki索引從探測索引矩陣排除，因為在算法的此執(zhí)行階段，假定占用陣列在此索引處含有“真”的值。類似地，也可增加探測矩陣而包含(z-m,z-m+1,…,z+m-1,z+m)的更多電荷態(tài)而不是如上文所描述的僅(z-1,z,z+1)。

在步驟a607中，針對每一測試的z值和每一質(zhì)心ci計算得分值。得分集合用以產(chǎn)生每一z值的計分分布。通過針對zi的每一可能的值將以實驗方式導(dǎo)出的占用值求和而計算得分s(z)。具體地說，z的每一值的得分如下確定：

s(z)＝∑ok/c等式(9)

其中所述總和是在kp(ci,zi)的k上以使得(1≤k≤loccs)且c恰好是此k的數(shù)目。換句話說，在z處的得分恰好是如在步驟a420(圖15)中構(gòu)造的占用陣列中經(jīng)譯碼的測得的高于閾值的質(zhì)譜信號(即，“真”的值)“占據(jù)”的kp(ci,zi)索引的分?jǐn)?shù)。因此，在步驟a605中的計算呈流線型近似“內(nèi)積”計算的形式，其中任何單個計算的最大可能的得分是單位一。通過從最低到最高用戶可設(shè)定限制將z的每一值的得分求和而形成得分分布。使用1和50的我們的實例作為低和高限制，我們將得到每一質(zhì)心的50個得分的分布。

決策步驟a611針對每一質(zhì)心確定是否已考慮z的最大值。如果否，那么執(zhí)行返回到步驟a605用于以z的新值(如在步驟a609中設(shè)定)計算探測索引。否則，執(zhí)行分支到?jīng)Q策步驟a613，其確定是否已考慮子集{f}中的最后質(zhì)心。如果否，那么執(zhí)行前進到步驟a615，其中選擇下一質(zhì)心，并且然后到步驟a603，其中將z值復(fù)位到其初始狀態(tài)。否則，執(zhí)行前進到步驟a617(圖17b)，在此開始調(diào)配試驗性的電荷指派的過程。

圖17b中所示的步驟a617-a635說明使用在步驟a607(圖17a)的多個迭代中先前產(chǎn)生的計分分布做出試驗性的電荷指派的過程。在步驟a617中，選擇第一質(zhì)心；稍后在步驟a635中更新正考慮的質(zhì)心的選擇。在這兩個步驟中的任一者之后，在步驟a620中計算相應(yīng)計分分布的平均值μ和標(biāo)準(zhǔn)差σ。因此，步驟a620-a635的重復(fù)迭代致使針對與每一質(zhì)心相關(guān)聯(lián)的計分分布計算這些統(tǒng)計量度。在步驟a625中，如果存在任何得分大于平均值μ+3σ，那么將具有最大得分的z值指派給質(zhì)心作為初始電荷態(tài)指派。如果不存在得分大于μ+3σ，那么提供空值作為用于所討論質(zhì)心的初始指派。

2.2.5.通過迭代實現(xiàn)完全自一致電荷指派的最優(yōu)性。在步驟a600中已經(jīng)做出試驗性的電荷態(tài)指派之后，方法a300(圖14)的執(zhí)行前進到步驟a700，其中調(diào)整試驗性的電荷態(tài)指派。步驟a700的細(xì)節(jié)在圖18中展示。最優(yōu)條件簡單地經(jīng)界定為譜的所有質(zhì)心的電荷的最一致指派。此條件下是推斷指派給每一質(zhì)心的電荷態(tài)應(yīng)當(dāng)與指派給譜中的其它質(zhì)心的那些電荷態(tài)一致。

步驟a700的細(xì)節(jié)在圖18中展示，其如上方最優(yōu)性條件指導(dǎo)而實施迭代程序以產(chǎn)生電荷態(tài)指派。具有非空指派(如圖17b的步驟a625中指派的每一質(zhì)心)繼而得到考慮。這些中的每一者可與如在圖17a的步驟a605中指示的探測索引的集合相關(guān)聯(lián)。針對具有非空指派的所有質(zhì)心重復(fù)此過程，且在每一探測索引處確定新的電荷態(tài)分布。具體地說，在步驟a702中，選擇具有非空嘗試性地指派的電荷態(tài)zt的第一或下一質(zhì)心。在步驟a704中，如果必要則如先前相對于圖17a的步驟a605描述而產(chǎn)生所討論質(zhì)心的探測索引。隨后，在步驟a706中，假定選定質(zhì)心的電荷態(tài)是zt，在對應(yīng)于所討論質(zhì)心的探測索引中的每一者處計算電荷態(tài)。對于每一探測索引，保持針對所述探測索引計算每一電荷態(tài)多少次的記錄。在開始通過步驟a702-a710的每一循環(huán)之前，在步驟a701中清除這些記錄(復(fù)位為零)。隨后，在每一循環(huán)期間，每次在步驟a706中針對探測索引計算電荷態(tài)，便遞增在所述探測索引處已如此計算電荷態(tài)的次數(shù)。如果在步驟a710，存在具有非空指派的額外質(zhì)心，那么執(zhí)行返回到步驟a702且選擇下一此類質(zhì)心。

在已考慮最后質(zhì)心之后，執(zhí)行分支到步驟a712。在步驟a712中，在每一探測索引處將每一電荷態(tài)的出現(xiàn)次數(shù)(如在步驟a706中計算)列表，進而產(chǎn)生每一探測索引的電荷態(tài)分布。使用新電荷態(tài)分布，在步驟a714中通過調(diào)整每一探測索引處的試驗性電荷態(tài)以便使電荷態(tài)等于相應(yīng)索引處列表的最高數(shù)目而獲得“按大多數(shù)的電荷指派”(cam)。所有此些cam電荷指派的集合形成值陣列-按大多數(shù)的電荷指派陣列。

如果在步驟a716，cam陣列的值不同于在cam陣列的產(chǎn)生中使用的電荷態(tài)值，那么電荷指派被認(rèn)為是不一致的。相比之下，將完全自一致電荷指派界定為在每一索引處的電荷指派以使得其與來自產(chǎn)生于其的cam陣列的指派完全一致。因此，在步驟a716，將經(jīng)調(diào)整試驗性的電荷態(tài)與其先前值進行比較。如果已存在大于某一可耐受限制的改變，那么所述電荷指派不是自一致的。在此情況下，跟隨步驟a716的“否”分支，且執(zhí)行返回到步驟a701，借此執(zhí)行新的計算集合以便實現(xiàn)自一致性。因此，通過使用來自每一cam的電荷以產(chǎn)生后續(xù)cam而執(zhí)行cam陣列確定的一組重復(fù)。當(dāng)實現(xiàn)收斂時實現(xiàn)最優(yōu)性，即，cam產(chǎn)生同一cam。

實際上，通過此程序可能不實現(xiàn)確切的收斂。然而，發(fā)明人的經(jīng)驗展示在幾次迭代之后，非一致的發(fā)生變成可忽視地小，且因此可在極好的電荷態(tài)指派下停止迭代。因此，在步驟a716中，當(dāng)連續(xù)cam陣列中的差在某一可耐受限制內(nèi)(即，某一容限內(nèi))時視為操作性地實現(xiàn)收斂。在此情況下，執(zhí)行分支到步驟a718，在此將最終自一致電荷態(tài)和每一質(zhì)心設(shè)定成等于發(fā)生操作性收斂的試驗性的電荷態(tài)。

2.3.分析物特定群集的確定

群集方法開始于由等式(10)界定的群集準(zhǔn)則，其中合理地預(yù)期在受限制m/z范圍內(nèi)發(fā)生的c¹³非單同位素峰的數(shù)目δn^c13如下給出：

其中z1和z2是指派給質(zhì)譜線的電荷態(tài)，(m/z)1和(m/z)2是以實驗方式測得的質(zhì)荷比值，mc13是碳同位素c¹³與c¹²之間的質(zhì)量差，且mproton是質(zhì)子的質(zhì)量。與所述計算相關(guān)聯(lián)的誤差(δ)或標(biāo)準(zhǔn)差是從用戶供應(yīng)的以ppm界定的準(zhǔn)確性值α以及考慮中的質(zhì)心的分辨率r1和r2計算，如等式(11)中描述：

為了確定任何兩個質(zhì)心(峰)是否屬于同一分析物特定群集(與例如蛋白質(zhì)等特定生物分子相關(guān)聯(lián))，使用等式(10)計算理論δn^c13值。如果計算的δn^c13值是測量誤差內(nèi)的整數(shù)，如等式(11)中計算，那么將所述兩個質(zhì)心視為屬于同一分析物特定群集，前提是c¹³峰的數(shù)目不超過用戶界定的限制(通常為10到15)。當(dāng)然，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地使用眾多其它類似統(tǒng)計測試，例如z測試或t測試，以確定所述兩個峰是否相差整數(shù)數(shù)目的c¹³，以α編碼的其m/z的不確定性以及分辨率r為前提。

圖19中所示的將質(zhì)譜線分解為分析物特定群集的步驟a800利用了上述推理。步驟a800考慮已經(jīng)對其做出電荷指派的質(zhì)心，如先前描述。步驟a805以具有最大以實驗方式觀測的強度的經(jīng)電荷指派質(zhì)心開始。如此選定的質(zhì)心隨后用作第一群集的“種子”。隨后，按逐漸減小的強度次序進行(步驟a810到a830)，做出檢查以確定列表中的下一質(zhì)心是否以此群集的種子質(zhì)心而群集。此檢查是通過首先分別使用等式10和等式11計算δn^c13及其誤差δ而執(zhí)行(步驟a815)。如果在決策步驟a820中注意到δn^c13的當(dāng)前計算值是計算誤差內(nèi)的整數(shù)，那么執(zhí)行沿著“是”分支跟隨到步驟a825，其中將考慮中的質(zhì)心連同種子質(zhì)心一起分組為屬于單個群集。如果不是，那么跟隨“否”分支以使得在步驟a830中，如果存在剩余的非種子質(zhì)心，那么執(zhí)行返回到步驟a810，其中選擇下一密集非種子質(zhì)心用于群集檢查。如果在步驟a830，非種子質(zhì)心的列表耗盡(即，不存在具有小于當(dāng)前考慮質(zhì)心的強度的剩余非種子質(zhì)心)但存在剩余非群集質(zhì)心(在步驟a835中確定)，那么執(zhí)行返回到步驟a805，其中使用最密集非種子質(zhì)心作為新種子而開始新群集。后續(xù)迭代針對產(chǎn)生的所有群集種子進行檢查，且在新質(zhì)心不以任何先前群集而群集的情況下產(chǎn)生新群集。

最后，在步驟a840中，使用簡單試探法來確定由群集算法產(chǎn)生的任何群集是否是“健康的”。在我們的初始實施方案中，我們使用“健康的”群集必須具有至少四個相異電荷態(tài)或至少n個(用戶可設(shè)定，但默認(rèn)為15)成員質(zhì)心的簡單規(guī)則。我們根據(jù)這些準(zhǔn)則濾出不“健康”的群集。在“不健康”群集的移除之后，剩余是最終分析物特定群集，各自表示不同生物聚合物或其它高質(zhì)量化合物。

2.4.蛋白質(zhì)分子量計算

從實驗高分辨率譜計算蛋白質(zhì)的單同位素分子量mmono的更常見方式中的一者是使用所謂的“averagine”方法(senko，m.w,beu，s.c.和mclafferty，f.w.，1995，《從解析的同位素分布確定大生物分子的單同位素質(zhì)量和離子群體(determinationofmonoisotopicmassesandionpopulationsforlargebiomoleculesfromresolvedisotopicdistributions)》，《美國質(zhì)譜學(xué)會期刊(j.am.soc.massspectrom.)》，6：229-233)，其自身是用于低分辨率數(shù)據(jù)的更早方法的擴展(zubarev，r.a.和bonddarenko，p.v.，1991，《肽和寡核苷酸的平均與單同位素質(zhì)量之間的先驗關(guān)系(ana-priorirelationshipbetweentheaverageandmonoisotopicmassesofpeptidesandoligonucleotides)》，《質(zhì)譜快訊(rapidcommun.massspectrom.)》，5：276-277)。簡要地，averagine方法首先通過假設(shè)模型分子“averagine”分子對實驗同位素群集進行建模。通過優(yōu)化實驗與理論同位素分布之間的配合，可得到所需單同位素質(zhì)量的估計。

averagine技術(shù)在可購自美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆市的thermofisherscientific的各種質(zhì)譜法峰分解和分析算法內(nèi)使用。雖然averagine方法已高度成功，但本發(fā)明人受激發(fā)而基于以下考慮開發(fā)不同方法：(1)計算速度。averagine擬合可為耗時的，這對于實時應(yīng)用并非無關(guān)緊要的考慮，例如本文所描述的其中實時自動做出關(guān)于若干觀測離子中的哪些將片段的決策的那些應(yīng)用。然而，應(yīng)注意在其中不需要大量譜擬合的情形中，計算速度可不存在任何問題；以及(2)質(zhì)量準(zhǔn)確性。對于其特征在擁擠的譜中出現(xiàn)的較大分子量蛋白質(zhì)，對應(yīng)同位素群集趨向于為有噪聲的且不完整的(遺失同位素，尤其是邊緣，遺失電荷態(tài)等)。在此類情況下averagine擬合的使用可能不是適當(dāng)?shù)摹?/p>

本發(fā)明人因此在此教示一種方法，所述方法有望產(chǎn)生單同位素質(zhì)量的穩(wěn)健估計，其極容易計算且更抗噪聲和假象。接受估計可能偏置的影響下，主要目標(biāo)是穩(wěn)健性和精度。簡單地說，所述估計可能不是“真實”單同位素質(zhì)量(但是與其極接近)，但在面對實驗缺陷時將是穩(wěn)健/穩(wěn)定的。在將質(zhì)量準(zhǔn)確性納入考慮之后，誤差應(yīng)當(dāng)從真實單同位素質(zhì)量精確偏離0或+/-1道爾頓(1da)。本發(fā)明人此處指出在許多情況下穩(wěn)健性比準(zhǔn)確性更重要。舉例來說，如果將基于實驗數(shù)據(jù)建置分子量數(shù)據(jù)庫，那么一般需要在建置數(shù)據(jù)庫的同時以及在通過新數(shù)據(jù)測試數(shù)據(jù)庫的同時產(chǎn)生相同答案的能力，即使所述估計從真實分子量潛在地偏離1da但是在實驗之間是相同的。

所述方法以三個簡單觀測開始：(1)大多數(shù)蛋白質(zhì)的同位素模式是由于c¹²/c¹³二項分布且所有其它同位素具有過低豐度而無法保證考慮；(2)二項分布的模式(即，具有最大強度的峰)是與分布的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差或確切邊界相比的所述二項分布的極穩(wěn)健特征，且(3)對于二項分布，所述模式位于平均值左邊少于1da(參見圖20a到20d中呈現(xiàn)的表a1)。這意味著所述模式是用于平均值的極可用替換，所述平均值自身對于較多噪聲的數(shù)據(jù)是較難以估計的。舉例來說，在邊緣處截斷的分布將引起不可靠的平均估計，而所述模式除非分布高度失真，否則都對此截斷極穩(wěn)定。

所述計算的起始點由界定，其為同位素群集的觀測模式。隨后采用計算單同位素質(zhì)量的第一近似的zubarev方法，其中：

單同位素質(zhì)量的第二近似隨后如下界定：

其中n是最小整數(shù)以使得m2≥m1。最后，在單同位素質(zhì)量mmono的計算中，如果存在1道爾頓內(nèi)的群集的大于m2的實驗峰，那么：

mmono＝m2+1.003等式(14a)

否則，

mmono＝m2等式(14b)

計算單同位素質(zhì)量的此方法已并入在本文所說明的結(jié)果中。發(fā)明人的結(jié)果展示所述預(yù)測與由averagine方法預(yù)測的那些結(jié)果相比極有利。對于大蛋白質(zhì)，對標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的測試指示單同位素質(zhì)量估計是穩(wěn)定的。另外，還針對接近地相關(guān)的峰或蛋白質(zhì)變體計算群集分子量。我們將此計算的結(jié)果稱為“群集分子量”。在已經(jīng)成批發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)變體之后，使用更有辨識力的誤差函數(shù)執(zhí)行所有蛋白質(zhì)變體的群集分析：

誤差＝min|w1-w2-n×1.003|等式(15)

其中-3≤n≤3。如果誤差＜0.5(w1+w2)×10ppm，那么w1和w2應(yīng)當(dāng)被視為相等的。每一蛋白質(zhì)變體隨后將映射到由共識單同位素質(zhì)量表示的相等蛋白質(zhì)變體的群集中。此質(zhì)量被稱為且存儲為“共識mw”。

2.5.程序輸入和輸出

圖21a展示采用本文所描述的數(shù)據(jù)相依性方法的計算機程序的數(shù)據(jù)獲取后版本的起始頁(即，視覺顯示屏截圖)。在圖21a中說明的顯示器的左邊，“原始文件”方框充當(dāng)用于待處理的質(zhì)譜法數(shù)據(jù)文件的輸入線?？蓡⒂谩芭文Ｊ健睆?fù)選框，進而允許用戶處理多個數(shù)據(jù)文件，而“自動掃描遞增”復(fù)選框用以啟用連續(xù)譜的處理。通過用戶啟用“繪圖解卷積”復(fù)選框可在顯示器中標(biāo)繪來自所述程序的數(shù)據(jù)獲取后版本的結(jié)果。將處理的最小和最大譜(掃描)數(shù)目是由“掃描按鈕”設(shè)定，其直接默認(rèn)為文件長度(以掃描數(shù)計)或可由用戶設(shè)定。

如圖21a下部左側(cè)所見，可通過致使結(jié)果輸出到峰列表且通過用戶將輸出指定為ms1或ms2類型數(shù)據(jù)(以csv文件格式)來控制輸出。質(zhì)量容限(masstol)默認(rèn)為3；然而這也可由用戶設(shè)定。輸出也可以.puf文件格式產(chǎn)生以用于輸入到prosight^tmpc蛋白質(zhì)識別程序中。譜分解結(jié)果(在本文中也被稱作“解卷積”結(jié)果)的細(xì)節(jié)也可以.csv文件格式存儲以用于進一步數(shù)據(jù)分析?！敖Y(jié)果”標(biāo)簽中的解卷積概述列出了經(jīng)分析以產(chǎn)生報告的數(shù)據(jù)文件和掃描。沿標(biāo)簽向下是所檢測質(zhì)心的總數(shù)以及作為程序的部分經(jīng)過濾的數(shù)目。成功地接收電荷態(tài)指派的峰的百分比在“zscape”方框中找到，還有與所述領(lǐng)域的技術(shù)人員當(dāng)前使用的前導(dǎo)現(xiàn)有解卷積程序中的一者所計算的結(jié)果的比較?！皟烧呓?jīng)指派”和“一致”方框量度所述兩個程序之間的協(xié)定。移動到“結(jié)果”標(biāo)簽的底部，展示經(jīng)指派群集的百分比以及經(jīng)解卷積的唯一蛋白質(zhì)的總數(shù)。圖21d中展示此標(biāo)簽的放大圖。

圖21a中所示的位于顯示的右側(cè)的兩個標(biāo)簽提供挑選與解卷積過程相關(guān)聯(lián)的指派和群集參數(shù)。在圖21b中，“指派參數(shù)”標(biāo)簽包含以百萬分率(ppm)計的質(zhì)量準(zhǔn)確性、最小峰強度閾值、需要的最小信噪比(s/n)以及解卷積過程預(yù)期的最低和最高電荷態(tài)。這些參數(shù)進一步劃分成兩個列，各自用于ms¹和ms²分析。

圖21c中所示的“群集參數(shù)”標(biāo)簽也劃分成分別與ms¹和ms²分析相關(guān)的兩個列。提供鄰接電荷態(tài)和同位素的最小數(shù)目的用戶輸入以用于上述群集收斂計算。此輸入標(biāo)簽上還呈現(xiàn)“足夠鄰接電荷態(tài)”、“足夠鄰接同位素”和“質(zhì)量分離”參數(shù)輸入顯示。

2.6.實例

圖22a展示來自由細(xì)胞色素c、溶菌酶、肌血球素、胰蛋白酶抑制劑和碳酸酐酶組成的五組分蛋白質(zhì)混合物的解卷積結(jié)果。所述顯示的頂部顯示面板a1203展示從表示為質(zhì)心的質(zhì)譜法所獲取的數(shù)據(jù)。位于中央的主顯示面板a1201說明每一峰為相應(yīng)符號。用于頂部面板a1203和中央面板a1201的水平安置的質(zhì)荷比(m/z)尺度a1207展示于中央面板下方。計算機顯示還可包含(圖22a中未具體展示)用于質(zhì)量準(zhǔn)確性(以ppm表達)的設(shè)定、峰/同位素群集設(shè)定、最小強度閾值和信噪比設(shè)定，以及與計算相關(guān)聯(lián)的最小和最大電荷態(tài)。顯示的左側(cè)的面板a1205展示蛋白質(zhì)分子的以道爾頓計的所計算分子量。側(cè)面板a1205的分子量(mw)尺度垂直地定向于所述顯示上，其垂直于關(guān)于檢測到的離子的水平定向m/z尺度a1207。中央面板a1201中的每一水平線指示在此實例中具有對應(yīng)于離子電荷態(tài)的點線輪廓線的蛋白質(zhì)的檢測，其顯示為先前論述的變換計算的直接結(jié)果。在圖22b中展示關(guān)于同一數(shù)據(jù)集的顯示，其中分子量(mw)尺度相對于圖22a中所示的視圖極大地擴展。圖22b的擴展圖說明單個蛋白質(zhì)電荷態(tài)的良好解析同位素(左面板a1205的最下部部分)以及潛在加合物或雜質(zhì)峰(所述顯示中存在兩個)。這三個分子中最密集的是胰蛋白酶抑制劑蛋白質(zhì)。圖22c中的另一擴展圖展示胰蛋白酶抑制劑蛋白質(zhì)在同位素層級的確切細(xì)節(jié)。用以表示個別同位素的符號大小根據(jù)每一同位素峰的強度而按比例縮放。

圖23a展示來自細(xì)菌大腸桿菌的粗提取物的數(shù)據(jù)和解卷積結(jié)果。使用僅單級質(zhì)譜法將此樣本直接灌注到質(zhì)譜儀中。使用根據(jù)本發(fā)明教示的方法獲得的計算結(jié)果指示此樣本中58個唯一可辯別的蛋白質(zhì)的存在。在此實例中的許多所述蛋白質(zhì)具有重疊電荷態(tài)，其容易使用前述算法而群集。圖23b說明對應(yīng)于同一數(shù)據(jù)集的另一顯示，其展示m/z＝700da/e附近的m/z尺度的擴展圖(以及以道爾頓計的mw尺度的擴展圖)，其展示由頂部面板a1203中的不同圖案化質(zhì)心描繪的三個相異電荷態(tài)。所述顯示的頂部面板a1203中的質(zhì)心a1301對應(yīng)于具有質(zhì)量15,305.76da的蛋白質(zhì)的+22同位素解析電荷態(tài)。在此情況下，這是存在的僅有電荷態(tài)分布，但即使質(zhì)心條a1303和a1305在所討論電荷態(tài)的1da內(nèi)發(fā)生，所述算法也正確地識別群集。許多當(dāng)前可用的解卷積程序無法正確地指派電荷態(tài)到3da窗口內(nèi)的獨立分布(兩個不同蛋白質(zhì))。并且，質(zhì)心條a1305表示具有質(zhì)量16,017.57da的大腸桿菌的蛋白質(zhì)的+23電荷態(tài)。應(yīng)注意此蛋白質(zhì)的+23電荷態(tài)與具有質(zhì)量15327.47da的單獨+22電荷態(tài)蛋白質(zhì)的質(zhì)心條a1303直接重疊。典型解卷積程序不能夠正確地指派具有此種類小間距或重疊電荷態(tài)的譜中的峰，如通過與圖13c的比較可見，圖13c展示使用采用常規(guī)算法的程序所獲取且處理的同一質(zhì)譜。常規(guī)方法不能夠在譜的此區(qū)中做出任何電荷態(tài)指派，如由圖中所關(guān)注的峰上的“問題標(biāo)記”指示。圖13d已經(jīng)正確地標(biāo)記如由我們的采用本文教示的新穎方法的算法指派的用于上述兩個重疊電荷態(tài)的原始分布數(shù)據(jù)的電荷態(tài)。

采用根據(jù)本發(fā)明教示的方法的程序也可確定并不含有個別地解析的同位素的那些峰的電荷態(tài)。在圖24a中說明的另一實例中，以變化程度的糖基化展示完整抗體的質(zhì)譜。圖24a的插圖中顯示抗體的不同糖型的實例。圖24b說明范圍從148378da到148763da的四個解卷積糖型的解卷積分子量。

根據(jù)本發(fā)明教示的方法也具有用于解卷積串連質(zhì)譜法數(shù)據(jù)的實用性。在如圖25a和25b中說明的另一實例中，針對碰撞激活解離而選擇來自蛋白質(zhì)碳酸酐酶ii的兩個電荷態(tài)。在圖25a中展示碳酸酐酶ii的+26電荷態(tài)的ms/ms譜和對應(yīng)解卷積。與使用常規(guī)算法的僅9％相比，此處正確地識別64％的質(zhì)心。甚至在許多ms/ms片段并不產(chǎn)生同一片段的多個電荷態(tài)的情況下也群集確切50％的質(zhì)心。經(jīng)正確識別的片段離子的總數(shù)是35。圖25b展示在m/z1001處的碳酸酐酶ii的+21電荷態(tài)的ms/ms分段和解卷積。此處正確地群集74％的質(zhì)心且指派78％的電荷態(tài)。使用所述程序識別總共49個片段離子。

2.7.引導(dǎo)數(shù)據(jù)相依性獲取以避免冗余測量

在建立動態(tài)排除列表的傳統(tǒng)方法中，m/z值在指定時間周期中放置在列表上，所述時間周期近似為給定化合物/化合物類型的平均峰寬度。當(dāng)對于小分子或肽(即通常具有相同生理化學(xué)性質(zhì)的胰蛋白酶肽)使用此方法時，其良好起作用而增加與化合物識別過程相關(guān)聯(lián)的動態(tài)范圍。與其相反，完整蛋白質(zhì)(如在從上到下蛋白質(zhì)組研究中測得)在大小、胺基酸組合物、生理化學(xué)性質(zhì)和3-d結(jié)構(gòu)方面廣泛變化。此變化率通常導(dǎo)致蛋白質(zhì)上的更多位點(與較小分子分析物的情況相比)與層析柱的固定相交互。結(jié)果是一些峰可能為僅幾秒寬，而其它峰可持續(xù)約數(shù)分鐘。圖13中說明可預(yù)期的變化率的典型實例，其展示從單個層析運行獲得的變化峰分布。因此，動態(tài)排除的標(biāo)準(zhǔn)方法不是用于從上到下分析的理想擬合。為了矯正此問題，本發(fā)明方法采用信號強度分級系統(tǒng)以確定與給定蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)的電荷態(tài)應(yīng)當(dāng)放置在動態(tài)排除列表上多長時間。在此新方法中，每一群集的種子質(zhì)心放在排除列表上。當(dāng)后續(xù)ms¹掃描中提出新種子質(zhì)心時，首先在步驟a510中進行檢查以確定所述新質(zhì)心是否以當(dāng)前在選擇列表上的種子質(zhì)心中的任一者而群集(圖14)。如果是這樣，那么進行檢查以確定新質(zhì)心的強度是否已經(jīng)下降到低于閾值(如原始種子質(zhì)心的強度的分?jǐn)?shù))。僅當(dāng)強度確實下降到低于閾值時，才將原始種子質(zhì)心從排除列表去掉(步驟a515)。

替代地，來自給定蛋白質(zhì)的所有電荷態(tài)可放置在排除列表上，因此避免從用于串連ms分析的同一蛋白質(zhì)選擇不同電荷態(tài)。雖然這些電荷態(tài)在動態(tài)排除列表上，但監(jiān)視構(gòu)成所述列表的峰的信號強度直到它們低于經(jīng)界定最小強度或者存在從在經(jīng)界定質(zhì)量差(ppm)的電荷態(tài)中的一者的信號增加，其指示具有不同質(zhì)量和電荷但相同m/z值的兩個組分的存在。