本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域，更具體地，涉及一種免疫印跡薄膜及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

免疫印跡(westernblot)技術(shù)是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進行檢測的技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測，可以同時比較多個樣品同種蛋白的表達量差異。由于免疫印跡具有sds-page的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。

免疫印跡技術(shù)所用的薄膜為硝酸纖維素膜、尼龍膜或聚偏氟乙烯膜，形狀為條狀(《抗體技術(shù)實驗指南》，科學(xué)出版社，2002.9)。該薄膜僅能進行單個待測樣本的單次檢測，若需進行多個待測樣本的平行檢測，則需將該多個蛋白樣本轉(zhuǎn)移到不同的薄膜上后，針對不同的薄膜單獨進行孵育，同時進行振蕩以加快反應(yīng)速度。因此使用該薄膜具有以下缺點：一、在進行平行檢測時，反應(yīng)效率低下；二、由于免疫印跡薄膜需要浸泡在待測樣本溶液中，所需的樣本量大，耗費試劑，且難以進行痕量檢測；三、薄膜需要進行干燥后顯色拍照，再進行分析，從而無法實現(xiàn)原位檢測；四、由于薄膜通常浸泡在不同窗口或反應(yīng)槽中，不同薄膜的反應(yīng)條件略有差異，從而影響免疫印跡的準(zhǔn)確性。以上缺點也間接導(dǎo)致了應(yīng)用該薄膜進行免疫印跡的自動檢測儀器的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，生產(chǎn)成本較高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進需求，本發(fā)明提供了一種免疫印跡薄膜及其制備方法，其目的在于將薄膜表面劃分為多個親水區(qū)域，從而實現(xiàn)多個蛋白樣本的平行檢測。

為實現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種免疫印跡薄膜，所述免疫印跡薄膜表面具有以疏水區(qū)域間隔的多個平行的條狀親水區(qū)域，所述條狀親水區(qū)域具有一個或多個結(jié)合區(qū)，所述結(jié)合區(qū)上具有目標(biāo)抗原，用于結(jié)合免疫印跡的目標(biāo)抗體。

優(yōu)選地，所述條狀親水區(qū)域具有多個結(jié)合區(qū)，所述多個結(jié)合區(qū)包括實驗區(qū)以及對照區(qū)。

作為進一步優(yōu)選地，所述對照區(qū)包括陽性對照區(qū)、陰性對照區(qū)或結(jié)合物對照區(qū)。

優(yōu)選地，所述條狀親水區(qū)域的材料為硝酸纖維素、尼龍或聚偏氟乙烯。

優(yōu)選地，所述疏水區(qū)域具有硅烷基。

作為進一步優(yōu)選地，所述疏水區(qū)域的材料為聚二甲基硅氧烷或其衍生物。

優(yōu)選地，所述條狀親水區(qū)域以及疏水區(qū)域的寬度為1mm～5mm。

優(yōu)選地，所述免疫印跡薄膜沿條狀親水區(qū)域的方向繞制為卷軸結(jié)構(gòu)。

作為進一步優(yōu)選地，所述卷軸結(jié)構(gòu)的直徑為2cm～6cm。

作為進一步優(yōu)選地，所述卷軸結(jié)構(gòu)繞制于支撐軸上。

作為更進一步優(yōu)選地，所述支撐軸為圓柱狀或圓筒狀。

按照本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述免疫印跡薄膜的制備方法，包括：

在襯底膜上結(jié)合目標(biāo)抗原，以形成與目標(biāo)抗原的數(shù)量相同的結(jié)合帶，所述襯底膜的材料為硝酸纖維素、尼龍或聚偏氟乙烯；

用疏水涂料在襯底膜上形成疏水區(qū)域，以將襯底膜分隔為多個條狀親水區(qū)域，同時將結(jié)合帶分隔為結(jié)合區(qū)，使得每個條狀親水區(qū)域都具有與目標(biāo)抗原的數(shù)量相同的結(jié)合區(qū)。

按照本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述免疫印跡薄膜的制備方法，包括：

將多個條狀親水薄膜平行貼制于疏水薄膜上，使得所述疏水薄膜上具有與多個條狀親水薄膜形成的多個平行的條狀親水區(qū)域，所述條狀親水區(qū)域以疏水區(qū)域相間隔。

優(yōu)選地，所述疏水薄膜表面具有與條狀親水薄膜相配合的凹槽，所述凹槽用于固定條狀親水薄膜。

總體而言，通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，由于通過疏水區(qū)域，將免疫印跡薄膜分隔為多個平行的條狀親水區(qū)域，能夠取得下列有益效果：

1、在同一張免疫印跡薄膜上，可以檢測多個目標(biāo)抗體的樣本，從而提高了平行檢測的反應(yīng)效率；

2、免疫印跡薄膜具有以疏水區(qū)域間隔的多個平行的條狀親水區(qū)域，通過親水區(qū)域的吸附力與目標(biāo)抗體結(jié)合，從而更加節(jié)省試劑，同時適用于痕量檢測；

3、免疫印跡薄膜由于通過親水區(qū)域的吸附力與目標(biāo)抗體結(jié)合，從而使得所需的溶液量較少，簡化了檢測步驟，更適用于原位檢測；

4、多個目標(biāo)抗體的樣本結(jié)合于同一張免疫印跡薄膜上，從而更適于在完全相同的條件下進行反應(yīng)，更容易進行平行對照，提高了檢測的準(zhǔn)確率。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1俯視圖；

圖2為本發(fā)明實施例1制作過程示意圖；

圖3為本發(fā)明實施例2制作過程示意圖；

圖4為本發(fā)明實施例3制作過程示意圖；

圖5為本發(fā)明實施例4結(jié)構(gòu)示意圖；

在所有附圖中，相同的附圖標(biāo)記用來表示相同的元件或結(jié)構(gòu)，其中：1-免疫印跡薄膜，11-疏水區(qū)域，12-親水區(qū)域，13-結(jié)合區(qū)，2-支撐軸。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。

本發(fā)明提供了一種免疫印跡薄膜1，所述免疫印跡薄膜1表面具有以疏水區(qū)域11間隔的多個條狀親水區(qū)域12，所述條狀親水區(qū)域12的材料為硝酸纖維素、尼龍或聚偏氟乙烯，以便結(jié)合目標(biāo)抗原，所述疏水區(qū)域11通常為具有硅烷基的有機疏水聚合物，同時還可能攜帶有硅氧基或硅羥基，如聚二甲基硅氧烷或其衍生物；

所述條狀親水區(qū)域12沿其長度方向具有一個或多個結(jié)合區(qū)13，所述結(jié)合區(qū)13上具有目標(biāo)抗原，所述目標(biāo)抗原用于與免疫印跡的目標(biāo)蛋白結(jié)合；當(dāng)所述條狀親水區(qū)域12包括多個結(jié)合區(qū)13時，結(jié)合區(qū)13可分為實驗區(qū)以及對照區(qū)，實驗區(qū)用于與目標(biāo)蛋白結(jié)合，而對照區(qū)根據(jù)其功能，可分為陽性對照區(qū)、陰性對照區(qū)或結(jié)合物對照區(qū)；其中，陽性對照區(qū)通常含有能與待測溶液中除目標(biāo)抗體以外的其它成分結(jié)合的抗原，例如，當(dāng)以血液為待測溶液時，陽性對照區(qū)的目標(biāo)抗原則可采用血清抗體，陽性對照區(qū)顯色證明免疫印跡薄膜1未變質(zhì)，且待測溶液種類無誤；而陰性對照區(qū)可涂覆有未標(biāo)記的二抗，使得在標(biāo)準(zhǔn)條件下陰性對照區(qū)無法顯色，若其顯色，證實可能有免疫印跡薄膜1變質(zhì)等異常情況，應(yīng)該更換免疫印跡薄膜1而重新測定；而結(jié)合物對照區(qū)的目標(biāo)抗原為igg結(jié)合物、igm結(jié)合物或iga結(jié)合物，由于igg、igm和iga為常見的免疫球蛋白，結(jié)合物對照區(qū)的存在可指示目標(biāo)抗體是否已經(jīng)成功結(jié)合。

所述條狀親水區(qū)域12以及疏水區(qū)域11的寬度通常為1mm～5mm，在便于做免疫印跡測試的同時，可保證各條狀親水區(qū)域12完全間隔，同時有效利用免疫印跡薄膜1的空間。

為了便于儲存和使用，所述免疫印跡薄膜1可沿條狀親水區(qū)域的方向圍繞圓柱狀或圓筒狀的支撐軸2繞制為直徑為2cm～6cm的卷軸結(jié)構(gòu)，如圖5所示。

該免疫印跡薄膜1的制備方法大致分為兩種：

第一種：在襯底膜上結(jié)合目標(biāo)抗原，以形成與目標(biāo)抗原的數(shù)量相同的結(jié)合帶，所述襯底膜的材料為硝酸纖維素、尼龍或聚偏氟乙烯；用疏水涂料在襯底膜上形成疏水區(qū)域11，以將襯底膜分隔為多個條狀親水區(qū)域12，同時將結(jié)合帶與結(jié)合帶對應(yīng)的結(jié)合區(qū)13，使得每個條狀親水區(qū)域12都具有與目標(biāo)抗原的數(shù)量相同的結(jié)合區(qū)13；該疏水涂料需要無毒，且在37度以下即可干燥，以免影響目標(biāo)抗原的活性，如專利文件cn201380057250中的疏水涂層。

第二種：將多個條狀親水薄膜平行貼制于疏水薄膜上，使得所述疏水薄膜上具有與多個條狀親水薄膜形成的條狀親水區(qū)域12，所述條狀親水區(qū)域12以疏水區(qū)域11相間隔；所述疏水薄膜表面可以設(shè)置有與條狀親水薄膜相配合的凹槽，以于與條狀親水薄膜結(jié)合并固定，使得條狀親水區(qū)域12所在的表面低于疏水所在的表面，這樣可進一步保證條狀親水區(qū)域12之間的反應(yīng)液不會互相影響混合。

上述免疫印跡薄膜1可應(yīng)用于免疫印跡檢測，以間接法進行化學(xué)發(fā)光檢測為例，具體包括以下步驟：

s1.在距條狀親水區(qū)域12上方0.1mm～2mm處設(shè)置與條狀親水區(qū)域12數(shù)量對應(yīng)的加液管，將多種待測溶液通過加液管以添加于不同的條狀親水區(qū)域12表面，使待測溶液中的目標(biāo)抗體與結(jié)合帶上的目標(biāo)抗原完全結(jié)合；同時，使得加液管的條狀親水區(qū)域12以1cm/s～15cm/s的速度相對往復(fù)運動，運動的同時，仍可以將待測溶液通過加液管緩慢添加于條狀親水區(qū)域12表面，以防液體蒸發(fā)，以保持條狀親水區(qū)域12上的液面高度為0.1mm～1mm；在此情況下，經(jīng)計算，即使將加液管中殘留的待測溶液計算在內(nèi)，所需的待測溶液的體積也僅需數(shù)十微升至毫升級；

s2.在各條狀親水區(qū)域12的一端可設(shè)置集液管，集液管的一端距條狀親水區(qū)域12上方0.1mm～2mm，另一端連接真空泵，在反應(yīng)完成后，真空泵通過集液管抽吸條狀親水區(qū)域12上多余的待測溶液；

s3.以s1-s2.中同樣的方式，以緩沖液替代原加液管中的待測溶液，將免疫印跡薄膜1表面的待測溶液沖洗干凈；由于緩沖液通常為pbs等成本較低的溶液，相對于待測溶液，可以添加較多體積；

s4.以s1-s2.中同樣的方式，以二抗溶液替代原加液管中的緩沖液，使得二抗完全與目標(biāo)抗體結(jié)合；

s5.以s3.中同樣的方式，以緩沖液替代原加液管中的二抗溶液，將免疫印跡薄膜1表面的二抗溶液沖洗干凈；

s6.以s1-s2.中同樣的方式，以化學(xué)發(fā)光劑溶液替代原加液管中的緩沖液，使得標(biāo)記過的二抗發(fā)光；

s7.以s3.中同樣的方式，以緩沖液替代原加液管中的化學(xué)發(fā)光劑溶液，將免疫印跡薄膜1表面的化學(xué)發(fā)光劑溶液沖洗干凈；

s8.獲得免疫印跡檢測結(jié)果。

實施例1

圖1為本發(fā)明實施例1的免疫印跡薄膜1，其材料為尼龍膜；該免疫印跡薄膜1表面具有以疏水區(qū)域11間隔的多個條狀親水區(qū)域12，所述條狀親水區(qū)域12以及疏水區(qū)域11的寬度均為1mm，所述條狀親水區(qū)域12具有一個或多個結(jié)合區(qū)13，所述結(jié)合區(qū)13上具有目標(biāo)抗原；

該免疫印跡薄膜1的制備方法如圖2所示，首先在尼龍的襯底膜上結(jié)合四種目標(biāo)抗原，以形成四條結(jié)合帶，如圖2a-b所示；然后用疏水涂料在襯底膜上形成疏水區(qū)域11，以將襯底膜分隔為多個條狀親水區(qū)域12，同時將結(jié)合帶分隔為與結(jié)合帶數(shù)量相同的結(jié)合區(qū)13，使得每個條狀親水區(qū)域12都具有與目標(biāo)抗原的數(shù)量相同的結(jié)合區(qū)13，如圖2c所示，即獲得圖1所示的免疫印跡薄膜1。疏水涂料的成分為1.448wt％的原硅酸四乙酯，0.1588wt％的十二烷基三甲氧基硅烷，0.0698wt％的氫氧化銨，0.1938wt％的hcl，208wt％的乙醇以及78.1198wt％的軟化水。

實施例2

圖3為本發(fā)明實施例2免疫印跡薄膜1的制作過程示意圖，先放置聚二甲基硅氧烷(pdms)的襯底，然后將具有多個結(jié)合區(qū)13的，寬度為3mm的硝酸纖維素薄膜以3mm的間隔粘制于襯底上。

實施例3

圖4為本發(fā)明實施例3免疫印跡薄膜1的制作過程示意圖，與實施例2的區(qū)別在于，在該pdms襯底上，每間隔5mm，有一條5mm寬的凹槽，寬度為5mm的聚偏氟乙烯薄膜可以剛好粘制于該凹槽內(nèi)。

實施例4

圖5為本發(fā)明實施例4免疫印跡薄膜1結(jié)構(gòu)示意圖，與實施例1的區(qū)別在于，長度為10cm的免疫印跡薄膜1繞制于直徑約為3.2cm的支撐軸2上。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。