本發(fā)明屬于體外遺傳毒性測定技術(shù)領(lǐng)域，更具體而言，本發(fā)明涉及一氧化碳的遺傳毒性測定方法。

背景技術(shù)：

空氣中的一氧化碳主要是由有機物不完全燃燒產(chǎn)生的，汽車尾氣、煤炭燃燒等是其主要來源。一氧化碳可以與氧氣共同競爭與血紅蛋白的結(jié)合，導(dǎo)致組織缺氧從而產(chǎn)生毒性。但關(guān)于一氧化碳的遺傳毒性目前鮮有研究，動物實驗表明一氧化碳暴露的大鼠尿液無突變性。但是，一氧化碳可能參與氧化應(yīng)激和dna損傷修復(fù)過程。目前世界衛(wèi)生組織煙草控制框架公約(fctc)將一氧化碳列為煙氣優(yōu)先級管制污染物之一。一氧化碳遺傳毒性研究較少的原因主要有其神經(jīng)毒性和急性毒性較大，因此遺傳毒性往往受到忽視；并且一氧化碳體外暴露的技術(shù)不成熟，難以進行有效的研究。

作為dna雙鏈斷裂的一種生物標(biāo)志物，磷酸化組蛋白γh2ax已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于臨床醫(yī)藥學(xué)、放射學(xué)及毒理學(xué)等研究方面。包括很多單體化合物和混合物通過γh2ax實驗對其遺傳毒性進行了測定和評價。例如，tanaka等利用γh2ax實驗對卷煙煙氣冷凝物的遺傳毒性進行了檢測和評價；smart等采用γh2ax實驗對依托泊苷、米托蒽醌及甲基亞硝脲的dna雙鏈斷裂的劑量-效應(yīng)關(guān)系進行了研究，并且通過已知的不同類型遺傳毒性化合物對該實驗進行了評價。該實驗因其靈敏性高、結(jié)合其他儀器檢測技術(shù)可以進行大規(guī)模分析檢測，擁有其他遺傳毒性檢測技術(shù)并不具備的多種優(yōu)點，目前已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于化合物和有毒物質(zhì)的遺傳毒性篩選和評價。

目前對γh2ax進行分析檢測的主要方法有流式細胞儀、elisa(酶聯(lián)免疫吸附試驗)、westernblot(蛋白質(zhì)印跡)、顯微鏡技術(shù)等。流式細胞儀和westernblot操作繁瑣，檢測前需要將貼壁細胞酶解成單細胞懸液，破壞了細胞的結(jié)構(gòu)和功能完整性，且檢測通量較低。elisa不能提供細胞內(nèi)熒光焦點的分布情況且需要額外添加其他檢測蛋白對結(jié)果進行校正，而顯微鏡技術(shù)的檢測通量低，且人為計數(shù)的誤差較大。

由于技術(shù)和條件的限制，傳統(tǒng)上對于氣態(tài)類物質(zhì)的暴露和毒性檢測通常將氣態(tài)物質(zhì)溶解于液體中，從而實現(xiàn)細胞和氣體的接觸暴露，即氣-液混合暴露方式。這種暴露方式雖然對于很多物質(zhì)有用，但并不是經(jīng)常有效。這是因為有些氣體溶解于液體(通常是水)中的溶解度有限，從而限制了暴露濃度的上限；第二，有些氣態(tài)物質(zhì)能和水發(fā)生反應(yīng)，從而間接改變了檢測目的；第三，氣-液混合暴露雖然對于懸浮細胞來說能使溶解于液體基質(zhì)中的氣體與細胞充分接觸，但是對于貼壁培養(yǎng)的細胞很難實現(xiàn)充分接觸。

氣-液界面暴露系統(tǒng)的發(fā)展極大地避免了傳統(tǒng)的氣-液混合暴露方式存在的問題，極大地提高了貼壁細胞體外暴露的有效性。因此，氣-液界面系統(tǒng)目前已經(jīng)被廣泛用來研究揮發(fā)性物質(zhì)或者氣溶膠類物質(zhì)的暴露。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種無需破壞細胞、簡單、有效且靈敏度高的一氧化碳dna損傷的定量檢測方法，該方法可以采用直接的氣體暴露方式進行，檢測結(jié)果準(zhǔn)確并且可視化，以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，從而提供一氧化碳遺傳毒性的有效檢測手段。

本發(fā)明的目的通過將氣-液界面暴露技術(shù)和高內(nèi)涵檢測γh2ax技術(shù)相結(jié)合而實現(xiàn)。具體而言，本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

一種氣-液界面暴露系統(tǒng)聯(lián)合高內(nèi)涵技術(shù)定量檢測一氧化碳致細胞dna損傷的方法，所述方法包括以下步驟：

1)細胞培養(yǎng)：將細胞接種在底部為滲透性濾膜的裝置中，然后將所述裝置在細胞培養(yǎng)液中進行細胞培養(yǎng)，使細胞在滲透性濾膜上單層生長；

2)細胞染毒：移除所述裝置中的細胞培養(yǎng)液，取出裝置并置于包含細胞染毒液和毒性氣體的染毒倉中，使得裝置中的滲透性濾膜底部與細胞染毒液接觸，同時滲透性濾膜上的細胞表面暴露于毒性氣體，其中所述毒性氣體包含一氧化碳和空氣；

3)免疫熒光標(biāo)記：從染毒倉中取出所述裝置，進行細胞中γh2ax的免疫熒光標(biāo)記與細胞核的dapi染色；

4)高內(nèi)涵技術(shù)定量檢測：分別進行所述細胞的細胞核和γh2ax的熒光測定，以所識別的有效細胞的有效細胞核內(nèi)檢測到的平均熒光強度來表征γh2ax的含量。

優(yōu)選地，所述步驟1)中，所述細胞為貼壁生長細胞；更優(yōu)選地，接種時，所述細胞處于對數(shù)生長期，以單細胞懸液接種于所述裝置中；

更優(yōu)選地，所述細胞以單細胞懸液接種于底部為滲透性濾膜的裝置中，然后在細胞培養(yǎng)液中于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)24h；

優(yōu)選地，關(guān)于本發(fā)明采用的底部為滲透性濾膜的裝置，所述滲透性濾膜為滌綸膜，膜上小孔的孔徑為0.4μm。因此，將所述裝置在細胞培養(yǎng)液中進行細胞培養(yǎng)時，細胞培養(yǎng)液可以通過滲透性濾膜浸沒接種其上的細胞；

優(yōu)選地，在細胞接種之前，用細胞培養(yǎng)液或pbs將所述裝置在37℃下平衡1-2h。

優(yōu)選地，所述步驟2)中，所述染毒倉中的細胞染毒液包含步驟1)中的細胞培養(yǎng)液，優(yōu)選與步驟1)中的細胞培養(yǎng)液相同；

優(yōu)選地，所述毒性氣體由空氣與一氧化碳組成；

更優(yōu)選地，所述毒性氣體中一氧化碳的濃度為0-44.64mmol/l、優(yōu)選>0且≤44.64mmol/l，更優(yōu)選8.93-44.64mmol/l；

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，所述毒性氣體中一氧化碳的濃度可以是0、8.93、17.86、26.78、35.71或44.64mmol/l。

優(yōu)選地，所述毒性氣體的流量為10-50ml/min，優(yōu)選20ml/min，優(yōu)選與毒性氣體接觸≤2h，優(yōu)選1h。染毒倉中含有細胞染毒液，但是滲透性濾膜上的細胞部分暴露于細胞染毒液的氣液界面上，從而實現(xiàn)該暴露部分與染毒倉中的毒性氣體接觸。

優(yōu)選地，所述步驟3)包括：

3-1)從染毒倉中取出所述裝置，洗滌，然后置于托盤內(nèi)，向裝置內(nèi)的細胞中加入多聚甲醛進行細胞固定；

3-2)洗滌所述裝置和托盤，然后向裝置內(nèi)的細胞中加入triton-100x以使細胞通透；

3-3)洗滌所述裝置和托盤，然后向裝置內(nèi)的細胞中加入血清白蛋白封閉，之后加入一抗即抗γh2ax抗體進行孵育；

3-4)洗滌所述裝置和托盤，然后向裝置內(nèi)的細胞中加入免疫熒光標(biāo)記的二抗進行孵育；

3-5)洗滌所述裝置和托盤，然后向裝置內(nèi)的細胞中加入dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)進行染色；

3-6)洗滌所述裝置和托盤，保存。

優(yōu)選地，所述步驟4)中，所述細胞的細胞核和γh2ax的熒光測定分別在兩組不同的激發(fā)波長和發(fā)射波長下進行；

優(yōu)選地，所述步驟3-4)中，免疫熒光標(biāo)記的二抗為alexafluor488標(biāo)記的二抗，并且所述步驟4)中，在通道一中以激發(fā)波長358nm和發(fā)射波長461nm進行細胞核的熒光測定，在通道二中以激發(fā)波長495nm和發(fā)射波長519nm進行γh2ax的熒光測定，以獲得通道一所識別的有效細胞的有效細胞核內(nèi)通道二所檢測的平均熒光強度，由此表征γh2ax的含量；

更優(yōu)選地，在兩個通道中，測量倍數(shù)為100倍，每孔分析和測定9個視野。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，步驟4)采用高內(nèi)涵細胞分析系統(tǒng)進行，例如購自thermoscientific的型號為arrayscanvti600的高內(nèi)涵細胞分析系統(tǒng)。

任選地，本發(fā)明的方法還包括，設(shè)置在步驟3-3)中沒有加入一抗、僅在步驟3-4)中加入二抗的空白對照組，從而在步驟4)中得到由非特異吸附引起的空白信號，由此從檢測到的熒光測定信號中扣除空白信號。

本發(fā)明的方法還可包括劑量-效應(yīng)曲線的繪制。即，通過在步驟2)中設(shè)置多種包含不同濃度的一氧化碳的毒性氣體，進行所述方法，最后根據(jù)γh2ax的平均熒光強度和一氧化碳的濃度繪制劑量-效應(yīng)曲線。

或者，本發(fā)明的方法還可包括時間-效應(yīng)曲線的繪制。即，通過在步驟2)中使細胞在染毒倉中接觸包含相同濃度的一氧化碳的毒性氣體達不同時間，進行所述方法，最后根據(jù)γh2ax的平均熒光強度和接觸毒性氣體的時間繪制時間-效應(yīng)曲線。

優(yōu)選地，所述毒性氣體經(jīng)過0.2μm濾膜過濾后進入所述染毒倉內(nèi)。在排出時，所述毒性氣體仍可經(jīng)過0.2μm濾膜過濾后排出到排氣管道中。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，在本發(fā)明的方法中采用的底部為滲透性濾膜的裝置與托盤是可商購的transwell插件，例如購自corning的型號為3450的transwell插件，裝置為transwell插件頂部，托盤為transwell插件底部。當(dāng)細胞為人肺癌細胞株a549時，可以如下進行本發(fā)明的方法：

1)細胞培養(yǎng)：采用含10％fbs和2mmol/ll-谷氨酰胺的rpmi-1640培養(yǎng)液于37℃、5％co2條件下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人肺癌細胞株a549，當(dāng)細胞匯合率達到70-80％時，采用0.25％的胰蛋白酶進行消化后獲得單細胞懸液；

接種前，在transwell插件頂部和底部分別加入0.5和2ml的pbs(磷酸鹽緩沖液，ph7.2～7.4；全文同)，于37℃的條件下平衡1-2h；吸棄transwell插件頂部和底部的pbs，于插件頂部加入0.5ml濃度為4×10⁵個細胞/ml的單細胞懸液，在插件底部加入2ml含有0.01mol/lhepes、2mmol/ll-谷氨酰胺和10％fbs的rpmi-1640培養(yǎng)液；將插件頂部放入底部中，并于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)24h。

2)細胞染毒：移除transwell插件頂部的培養(yǎng)液，取出transwell插件頂部放入體外暴露裝置的染毒倉內(nèi)，使得transwell插件中的滲透性濾膜與細胞染毒液接觸，滲透性濾膜上的細胞表面暴露于染毒倉中的毒性氣體1h；所述毒性氣體通過采用空氣將一氧化碳分別稀釋成0、8.93、17.86、26.78、35.71及44.64mmol/l的濃度，流量為20ml/min。

3)免疫熒光標(biāo)記：

3-1)染毒結(jié)束后，從染毒倉取出transwell插件頂部，然后在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌兩次，每次至少5min；然后將transwell插件頂部放入底部中，向頂部中加入0.5ml4％的多聚甲醛溶液在室溫下固定15min；

3-2)在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌兩次，每次至少5min，然后向transwell插件頂部加入0.5ml0.5％的triton-100x溶液(在pbs中)，在室溫下通透15min；

3-3)在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌兩次，每次至少5min，然后向transwell插件頂部加入0.5ml的3％bsa溶液(在pbs中)，于37℃下封閉1h，然后向transwell插件頂部加入0.5ml含有小鼠抗人γh2ax抗體溶液(1:200，v/v)于37℃下恒溫孵育2h；

3-4)在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌三次，每次至少5min，然后向transwell插件頂部加入0.5mlalexafluor488標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體溶液(1:200，v/v)于37℃下避光孵育2h；

3-5)在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌三次，每次至少5min，然后向transwell插件頂部加入500μl1μg/ml的dapi溶液(在pbs中)在室溫下避光染核10min；

3-6)在transwell插件頂部和底部分別加入2mlpbs洗滌三次后，再分別加入0.5和2mlpbs，4℃避光保存，待測。

4)高內(nèi)涵技術(shù)定量檢測：通道一(細胞核熒光測定)設(shè)置激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為358nm和461nm，通道二(目標(biāo)物γh2ax的熒光測定)設(shè)置激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為495nm和519nm，測量倍數(shù)為100，每孔分析和測定9個視野，以通道一所識別的有效細胞的有效細胞核內(nèi)通道二所檢測的平均熒光強度表征γh2ax的含量。

5)數(shù)據(jù)處理：設(shè)置在步驟3-3)中沒有加入一抗、僅在步驟3-4)中加入二抗的空白對照組，在步驟4)中所檢測信號即為由非特異吸附引起的空白信號，從所有樣品測試孔的檢測信號中扣除空白信號；最后根據(jù)目標(biāo)物γh2ax的熒光強度和一氧化碳的濃度繪制劑量-效應(yīng)曲線。

參見圖1，本發(fā)明提供了一種基于氣-液界面暴露系統(tǒng)和高內(nèi)涵技術(shù)來定量檢測一氧化碳致細胞dna損傷的方法，克服了現(xiàn)有一氧化碳氣體體外染毒和dna損傷檢測方法的不足。具體而言，本發(fā)明提供了一種評估染毒毒物為一氧化碳氣體時所導(dǎo)致的dna雙鏈斷裂情況的方法，其中磷酸化組蛋白γh2ax作為一氧化碳誘導(dǎo)的dna雙鏈斷裂的生物標(biāo)志物，并且采用體外氣-液界面暴露方式實現(xiàn)了氣態(tài)一氧化碳使細胞體外染毒的高效和準(zhǔn)確控制，采用高內(nèi)涵技術(shù)對γh2ax進行檢測，提高了檢測效率和靈敏度。在本發(fā)明的方法中，生長于滲透性濾膜上的貼壁細胞在氣-液界面暴露系統(tǒng)中暴露一氧化碳后，通過細胞免疫熒光染色γh2ax和高內(nèi)涵自動成像與分析實現(xiàn)了細胞樣本的直接、高通量檢測。

本發(fā)明的方法具有以下技術(shù)特點：

首先，本發(fā)明的方法確定了指數(shù)期細胞在滲透性濾膜上單層生長，從而在與毒性氣體的染毒過程中，確保了氣體與細胞能充分接觸，特別是相對于傳統(tǒng)的氣液混合染毒方式而言，顯著提高了貼壁細胞的染毒效率；

第二，為減少氣體沖擊對細胞活性的影響，本發(fā)明對不同氣體流量對細胞活性的影響進行了優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，不同氣體流量10-50ml/min形成的沖擊對細胞的存活率均無明顯的影響(p>0.05)，如圖2所示，確保了在這一流量范圍內(nèi)細胞能有效存活，進而保證染毒效果。結(jié)合暴露倉體積及染毒氣體對環(huán)境的影響，本發(fā)明優(yōu)選采用20ml/min的氣體流量作為最終的染毒流量。并且，本發(fā)明還對一氧化碳的使用濃度與染毒時間等條件進行了優(yōu)化。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法還具有如下優(yōu)良效果：

1)用氣-液界面暴露方式替代了傳統(tǒng)的氣-液混合暴露方式，由此提高了貼壁細胞與一氧化碳的接觸效率，進而提升了染毒的有效性和準(zhǔn)確性；

2)檢測前無需破壞細胞，也無需酶解制備單細胞懸液或提取蛋白，所以樣本處理更為簡單和快捷；

3)高內(nèi)涵技術(shù)具有高分辨率的成像獲取功能，因此γh2ax在細胞核內(nèi)的分布可直接觀測，且圖像資料也便于存儲以備再分析；

4)通過細胞核識別，可對每個細胞核內(nèi)熒光標(biāo)記的γh2ax進行定量分析，所以檢測結(jié)果更為靈敏和準(zhǔn)確。

附圖說明

以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中：

圖1示出了本發(fā)明方法的流程圖。

圖2示出了不同氣體流量對細胞存活率的影響。

圖3示出了一氧化碳誘導(dǎo)a549細胞產(chǎn)生γh2ax的劑量-效應(yīng)曲線。

圖4示出了一氧化碳誘導(dǎo)a549細胞產(chǎn)生γh2ax的時間-效應(yīng)曲線。

具體實施方式

以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的藥品原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產(chǎn)品。

一抗：小鼠抗人γh2ax抗體，購自biolegend，貨號613402；

使用時配制成溶液：取100μl小鼠抗人γh2ax抗體加入1％的bsa溶液中，1:200(v/v)稀釋，充分混勻。

二抗：alexafluro488標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體，購自武漢珈源量子點公司，貨號ym002；

使用時配制成溶液：取100μlalexafluro488標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體加入pbs溶液中，1:200(v/v)稀釋，充分混勻。

transwell插件：購自corning，型號3450。

高內(nèi)涵細胞分析系統(tǒng)，購自thermoscientific，型號arrayscanvti600。

細胞暴露系統(tǒng)，購自北京慧榮和，型號hrh-ces3969。

實施例1

測定一氧化碳暴露1h后誘導(dǎo)的γh2ax。

在transwell插件頂部和底部分別加入0.5和2ml的pbs，于37℃的條件下平衡1-2h。吸棄transwell插件頂部和底部的pbs，于插件頂部加入0.5ml濃度為4×10⁵個細胞/ml對數(shù)生長期的a549細胞的單細胞懸液，在插件底部加入2ml含有0.01mol/lhepes、2mmol/ll-谷氨酰胺和10％fbs的rpmi-1640培養(yǎng)液，并于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)24h。

移除transwell插件頂部的培養(yǎng)液，取出transwell插件頂部放入細胞暴露系統(tǒng)的染毒倉內(nèi)，使得transwell插件中的滲透性濾膜與細胞染毒液(同樣為含有0.01mol/lhepes、2mmol/ll-谷氨酰胺和10％fbs的rpmi-1640培養(yǎng)液)接觸，滲透性濾膜上的細胞表面暴露于染毒倉中的毒性氣體，其中毒性氣體由一氧化碳與空氣組成，一氧化碳的濃度分別為0、8.93、17.86、26.78、35.71及44.64mmol/l，于37℃的條件下染毒1h，氣體流量為20ml/min。

染毒結(jié)束后，從染毒倉取出transwell插件頂部，在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌兩次，每次至少5min；然后將transwell插件頂部放入底部中，頂部加入0.5ml4％的多聚甲醛溶液在室溫下固定15min；在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌兩次，每次至少5min，然后向transwell插件頂部加入0.5ml0.5％的triton-100x溶液(在pbs中)，在室溫下通透15min；在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌兩次，每次至少5min，然后向transwell插件頂部加入0.5ml的3％bsa溶液(在pbs中)，于37℃下封閉1h，然后向transwell插件頂部加入0.5ml含有小鼠抗人γh2ax抗體溶液(1:200，v/v)于37℃下恒溫孵育2h；在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌三次，每次至少5min，然后向transwell插件頂部加入0.5mlalexafluor488標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體溶液(1:200，v/v)于37℃下避光孵育2h；在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌三次，每次至少5min，然后向transwell插件頂部加入0.5ml1μg/ml的dapi溶液(在pbs中)在室溫下避光染核10min；在transwell插件頂部和底部分別加入2mlpbs洗滌三次后，于頂部和底部分別加入0.5和2mlpbs，4℃避光保存，待測。

設(shè)置高內(nèi)涵細胞分析系統(tǒng)的通道一(細胞核熒光測定)的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為358nm和461nm，設(shè)置通道二(目標(biāo)物γh2ax的熒光測定)的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為495nm和519nm，測量倍數(shù)為100倍，每孔分析和測定9個視野，γh2ax的含量以通道一所識別的有效細胞的有效細胞核內(nèi)通道二所檢測的平均熒光強度進行表征。

試驗中設(shè)置空白對照組，即沒有加入一抗，僅加入熒光標(biāo)記的二抗抗體，所檢測信號即為由非特異吸附引起的空白信號；所有樣品測試孔的檢測信號應(yīng)扣除空白信號；最后根據(jù)目標(biāo)物γh2ax的熒光強度和一氧化碳的濃度繪制劑量-效應(yīng)曲線。

圖3所示為不同濃度的一氧化碳在染毒1h后誘導(dǎo)a549細胞產(chǎn)生的γh2ax的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線。由圖可知，隨著一氧化碳的濃度增大，a549細胞產(chǎn)生的γh2ax比正常組(即一氧化碳濃度為0時)低，除正常組外，各處理組之間無顯著差異(p>0.05)。

實施例2

測定44.64mmol/l一氧化碳分別暴露15、30、45、60和90min后誘導(dǎo)的γh2ax。

實驗過程按照實施例1所述進行，唯一的區(qū)別是，一氧化碳的染毒濃度固定在44.64mmol/l，染毒時間分別為0、15、30、45、60和90min。

圖4所示為44.64mmol/l的一氧化碳在染毒0、15、30、45、60和90min后誘導(dǎo)a549細胞產(chǎn)生的γh2ax的時間-效應(yīng)關(guān)系曲線。由圖可知，隨著染毒時間增加，a549細胞產(chǎn)生的γh2ax和正常組相比均降低，且各時間點暴露誘導(dǎo)的γh2ax均無顯著差異(p>0.05)。

以上對本發(fā)明具體實施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。