本發(fā)明涉及藥物評價
技術領域：
，更具體地，涉及中藥組合物中活性成分對阿奇霉素作用基線提升水平的評價方法，尤其是中藥組合物婦科千金方中活性成分對阿奇霉素作用基線提升水平的評價方法。技術背景根據(jù)文獻報道，中醫(yī)學認為慢性盆腔炎(chronicpelvicinflammatorydisease，cpid)主要機理是婦人經(jīng)期、產(chǎn)后血室正開，余血未盡，易為六淫、七情、飲食、勞倦及房勞所傷，影響沖任氣血以成瘀為患。近年來，隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化進程加速，中西藥聯(lián)合應用日趨廣泛。臨床對慢性盆腔炎的治療亦常采用中西醫(yī)結合療法或中藥與抗生素聯(lián)合應用。目前，大量研究報道婦科千金片與抗生素聯(lián)合應用治療慢性盆腔炎療效顯著提高，且不良反應發(fā)生率明顯降低。婦科千金片聯(lián)合阿奇霉素對慢性婦科炎癥的療效優(yōu)于單用阿奇霉素，臨床上常將兩者合用治療慢性婦科炎癥疾病。實踐中，治療慢性盆腔炎，中醫(yī)應用活血化瘀法可明顯改善臨床癥狀，西醫(yī)學則認為其為急性盆腔炎后的無菌性炎癥，表現(xiàn)為血液流變學、免疫學、病理學等異常改變。因此，治療采用抗感染、抗炎和宮腔內(nèi)藥物局部作用為基本治則，也有臨床文獻認為促使子宮收縮使感染性宮腔分泌物排出或應用大量抗生素的情況下清理宮腔具有較顯著療效。這一治療思想同當歸“引藥內(nèi)消”的本草認識具有思路上的相似處。量化中藥組合物中不同藥物群對復方以及復方聯(lián)合阿奇霉素應用的總體功效的貢獻率方面進行深入研究，對探究中藥組合物中發(fā)揮抗炎和活血作用的主要藥物組、全面提高中藥組合物的產(chǎn)品質量，確保臨床用藥質量可控、均一、安全提供理論依據(jù)、指導臨床合理用藥具有重要的意義。婦科千金片(膠囊)是一種應用良好的典型中藥組合物，其由千斤拔、單面針、金櫻根、穿心蓮、功勞木、黨參、當歸、雞血藤八味活性成分組成，清熱除濕，益氣化瘀。主要用于濕熱瘀阻所致的帶下病、腹痛，癥見帶下量多、色黃質稠、臭穢，小腹疼痛，腰骶酸痛，神疲乏力；慢性盆腔炎、子宮內(nèi)膜炎、慢性宮頸炎見上述證候者。在治療慢性盆腔炎方面取得顯著的效果。同時，其中一味中藥的活性成分當歸是“能引諸血各歸其所當歸之經(jīng)，故名當歸”；“婦人以血為本”，當歸乃血家要藥。主要有補血活血，調經(jīng)止痛，潤腸通便之功，在婦科疾病中應用極廣?！侗静菪戮帯吩啤坝卯敋w于敗毒化毒藥中，正取其性動，則引藥內(nèi)消，直趨大便而出，奏功實神。故已潰者斷宜大用，使之活血以生肌，即未潰者尤宜急用，使之去毒而逐穢也?！钡牵趮D科千金片與抗生素聯(lián)合應用治療慢性盆腔炎的研究中，鮮見針對婦科千金方中當歸“引藥內(nèi)消”作用是否存在及內(nèi)在作用機制與效果的研究，也未見當歸引藥作用是用其于敗毒化毒之何種活性成分組的效果基礎之上，婦科千金片中活性成分以及活性成分組如何提升對阿奇霉素的作用基線水平的機制也缺乏相關研究和指引。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術問題是填補現(xiàn)有中藥組合物聯(lián)合阿奇霉素治療慢性盆腔炎的效果評價技術不足，提供一種中藥組合物中活性成分對阿奇霉素作用基線提升水平的量化評價方法。本發(fā)明的目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)：提供一種中藥成份對阿奇霉素作用基線提升評價方法，是采用基線等加法，首先測定已證實明確有效的治療藥物阿奇霉素的作用水平，將阿奇霉素與供試中藥組合物并行給予實驗模型，測定合并用藥的基線水平和合并用藥的療效趨勢，通過群體藥動學-群體藥效學聯(lián)合模型進行驗證。本發(fā)明科學設計技術路線，提供的所述中藥成份對阿奇霉素作用基線提升評價方法，具體包括以下步驟：s1.以慢性盆腔炎大鼠為實驗模型；s2.測定阿奇霉素的作用水平；s3.構建中藥組合物ppk-ppd聯(lián)結模型；引入中藥組合物中各組成部分為協(xié)變量，量化評價阿奇霉素作用基線提升水平。其中，步驟s1所述實驗模型可以采用慢性盆腔炎大鼠模型，優(yōu)選的制備模型的方法是采用混合菌液機械注入大鼠宮腔并輕度機械損傷法完成。所述混合菌液是以金色葡萄球菌和大腸埃希菌為受試菌。優(yōu)選地，混合菌液中受試菌的最佳培養(yǎng)方式為：分別挑3～4個單菌落于40毫升的m-h(b)培養(yǎng)基中，隔夜增菌培養(yǎng)16小時后取出原菌液用全波長多功能讀數(shù)議測od值(細菌生長飽和期)；取20ml，分裝于離心管中，每管2ml，離心10000～15000rpm/min，10分鐘，棄取上清液之中的m-h(b)，用2ml生理鹽水混勻后，再離心15000rpm/min，10分鐘，棄取上清液中的生理鹽水，收集細菌細胞菌體2ml。將相同方法培養(yǎng)的金色葡萄球菌和大腸埃希菌按1：1混合即獲得4ml混合菌液。將該菌液為100菌液濃度，用生理鹽水進行10倍稀釋，稀釋至0.1×100，0.01×100，備用(共3個劑量)。進一步優(yōu)選地，以0.01×100為最佳感染菌量。步驟s3是經(jīng)過不斷地分析和設計，預試采用包括hplc-uv或ec(電化學檢測)法在內(nèi)的多種檢測方法進行，完成模型大鼠血液及子宮組織兩種生物基質內(nèi)選擇性、工作曲線、穩(wěn)定性試驗，最終確定優(yōu)選地兩種生物基質中阿奇霉素的濃度測定方法。所述測定阿奇霉素的作用水平的方法是：hplc-ecd方法或者hplc-esi-ms方法。所述hplc-ecd方法或者hplc-esi-ms方法的樣品前處理方法是取血漿50μl，加入10mnh4oh溶液和內(nèi)標羅紅霉素甲醇溶液(160ng/ml)；加入二乙醚，渦旋后靜置，離心后吸取上層有機相，空氣流下吹干，殘留物加入流動相溶解，渦旋，離心，取上清液進行分析。所述hplc-ecd方法的色譜條件為：色譜柱aglientporoshell120ec-c18(2.7μm×4.6×100mm)695975-902，在線濾器：ssi35-0149；流動相：乙腈-ph7.0磷酸緩沖溶液(45：55，v/v)；流速0.8ml/min；柱溫30℃。玻碳工作電極電位+1.2v，參比電極ag/agcl。所述hplc-esi-ms方法的色譜條件為：色譜柱aglientporoshell120ec-c18(2.7um×4.6×100mm)695975-902，在線濾器：ssi35-0149；流動相：乙腈-10mmph5.2醋酸銨(65:35)，流速為0.2ml/min，進樣量5μl；質譜檢測條件為：電噴霧電離源(esi)，選擇性正離子檢測(sim)，阿奇霉素m/z749.5[m+h]+和內(nèi)標羅紅霉素m/z837.5[m+h]+，電離源電壓4.5kv，噴霧氣(n2)的流速為1.5l/min，脫溶劑溫度為250℃，檢測器電壓1.5kv。步驟s3是以分組模式為關鍵協(xié)變量，量化婦科千金方組合物以及方中各活性成分組對阿奇霉素作用的pk及pd參數(shù)的群體模型參數(shù)的影響方式及相關系數(shù)?；就緩桨ㄒ韵虏襟E：s31.建立azm的ppk模型；s32.確定綜合表達總體藥效的線性空間或在各個藥效指標中選擇一個各組方協(xié)同作用較明顯的指標作為pd輸出值；s33.確定合適的pd指標量化模型，建立截斷數(shù)據(jù)的ppd模型；s34.分析組織分布、抗菌類型、感染與炎癥關系的量化因素，確定合適的ppk-ppd聯(lián)接方式；s35.建立基于作用機制的中藥組合物以及組合物中各活性成分組對阿奇霉素協(xié)同作用的合并用藥ppk-ppd綜合模型，計算相應模型參數(shù)；s36.對得到的模型參數(shù)進行相關假設檢驗及區(qū)間估計，完成評價。其中，步驟s35所述建立ppk-ppd綜合模型和計算相應模型參數(shù)的方法是：參照kinettica及monolix軟件進行整體模型的建立。各節(jié)點調整相應參數(shù)后，對前后計算結果進行aic和loglikelihood值比對，設置相應適當?shù)挠嬎銋?shù)。使用非線性混合效應模型分析全體藥物動力學過程，可估計動力學參數(shù)的群體分布及由于生理和病理(固定效應和協(xié)變量)對個體間變異的貢獻。分析算法主要為em法，e為條件期望貝葉斯估計，m為最大似然估計。條件期望貝葉斯估計時假設群體中藥物動力學參數(shù)具有已知的先驗分布(均數(shù)±方差)，同時亦假設殘余誤差分布(均值±方差)已知，在所述條件下對個體藥物動力學參數(shù)進行估計；最大似然估計以條件期望貝葉斯估計的個體參數(shù)為初值，以最大似然估計法求算群體均值及方差。em算法迭代進行時以前后兩次模型修正的模型顯著性改變?yōu)樵u價標準，前后兩次計算模型參數(shù)改變無顯著性則運算終止。本發(fā)明所述評價方法可以很好地應用于評價中藥組合物與抗生素聯(lián)用安全性和有效性方面的應用。優(yōu)選地，本發(fā)明同時提供所述方法在婦科千金方組合物及其活性組分對阿奇霉素作用基線提升水平的評價方面的應用，尤其是評價其中當歸成分引藥內(nèi)消作用方面的應用。本申請人結合婦科千金方的處方組成，可認為當歸引藥作用正是用其于敗毒化毒之千斤拔、金櫻根、穿心蓮、功勞木、單面針中，而收“去毒而逐穢”的引藥之功；婦科千金方中千斤拔、金櫻根、穿心蓮、功勞木、單面針清熱除濕成分極可能發(fā)揮抗感染抗炎的解外邪功效，作用類似現(xiàn)代抗微生物藥，而當歸、雞血藤、黨參的重疊作用類似于“宮腔分泌物排出”有相似之處。據(jù)此建立本發(fā)明評價方法并通過群體藥動學-群體藥效學聯(lián)合模型科學驗證。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明針對慢性盆腔炎疾病，使用ppk-ppd模型擬合技術，實現(xiàn)定量測算受試中藥組合物以及方中各活性成分組對證實明確有效的治療藥物阿奇霉素作用基線的提升水平。本發(fā)明對相應病理狀態(tài)下體液腸道內(nèi)毒素遷移測定為“引毒內(nèi)消”關鍵指標，“活血以生肌，即未潰者尤宜急用，使之去毒而逐穢也”以子宮病理分級評分、組織炎癥因子測定、凝血相關因子為關鍵指標，建立了慢性盆腔炎治療評價的關鍵指標體系和評價支撐點，并經(jīng)過群體藥動學-群體藥效學聯(lián)合模型驗證指標體系的科學準確性。本發(fā)明驗證模型中，ppk采用通過大樣本全療程的方法，以全療程中指標成分在體液及靶部位的暴露量為建模關鍵數(shù)據(jù)，綜合考慮了樣本個體差異的統(tǒng)計學分布，科學設計了能定量評價引藥參與的動力學-藥效學系統(tǒng)變異動力學系統(tǒng)，變異弱效能藥物療效指標點法測定均值比較的研究方法的弊端。本發(fā)明明確了婦科千金方組合物對阿奇霉素各藥動學參數(shù)的增效影響，為臨床合理用藥提供指導；通過ppk-ppd模型，總結得到婦科千金方組合物中發(fā)揮抗炎和活血作用的主要藥物組，為全面提高婦科千金片的產(chǎn)品質量，確保臨床用藥質量可控、均一、安全提供理論依據(jù)；通過評價方法的建立和建立科學的ppk/ppd模型，量化了婦科千金方組合物中不同藥物群對復方總體功效的貢獻率，為婦科千金方組合物的二次開發(fā)以及產(chǎn)業(yè)提升提供有力的技術參考和依據(jù)。附圖說明圖1本發(fā)明方法技術路線設計示意圖。圖2空白基質sim總離子流圖。圖3標準物質+空白基質sim總離子流圖。圖4典型低濃度樣品sim總離子流圖。圖5藥物聯(lián)合治療前后全血低切還原粘度變化情況。圖6藥物聯(lián)合治療前后全血高切還原粘度變化情況。圖7藥物聯(lián)合治療前后高切相對指數(shù)變化情況。圖8藥物聯(lián)合治療前后低切相對指數(shù)變化情況。圖9藥物聯(lián)合治療前后壓積變化情況。圖10藥物聯(lián)合治療前后全血粘度變化情況。圖11藥物聯(lián)合治療前后紅細胞剛性指數(shù)變化情況。圖12藥物聯(lián)合治療前后紅細胞聚集指數(shù)變化情況。圖13藥物聯(lián)合治療前后紅細胞變形指數(shù)變化情況。圖14藥物聯(lián)合治療前后紅細胞計數(shù)變化情況。圖15藥物聯(lián)合治療前后紅細胞比積計數(shù)變化情況。圖16藥物聯(lián)合治療前后血紅蛋白計數(shù)變化情況。圖17藥物聯(lián)合治療前后平均紅細胞體積變化情況。圖18藥物聯(lián)合治療前后平均血紅蛋白含量變化情況。圖19藥物聯(lián)合治療前后平均蛋白濃度變化情況。圖20藥物聯(lián)合治療前后紅細胞寬度變異系數(shù)變化情況。圖21藥物聯(lián)合治療前后紅細胞寬度標準差變化情況。圖22藥物聯(lián)合治療前后血小板數(shù)變化情況。圖23藥物聯(lián)合治療前后平均血小板體積變化情況。圖24藥物聯(lián)合治療前后白細胞數(shù)變化情況。圖25藥物聯(lián)合治療前后淋巴細胞百分比變化情況。圖26藥物聯(lián)合治療前后中間細胞百分比變化情況。圖27藥物聯(lián)合治療前后粒細胞百分比變化情況。圖28藥物聯(lián)合治療前后血小板體積變化情況。圖29藥物聯(lián)合治療前后血小板分布寬度變化情況。圖30藥物聯(lián)合治療后動物子宮病理切片圖。其中，從左至右分別為azm、azmqr、azmdg、azmff治療組動物子宮病理切片圖。圖31藥物聯(lián)合治療前后子宮臟器系數(shù)變化情況。圖32藥物聯(lián)合治療前后卵巢臟器系數(shù)變化情況。圖33藥物聯(lián)合治療前后脾臟臟器系數(shù)變化情況。圖34藥物聯(lián)合治療前后胸腺臟器系數(shù)變化情況。圖35藥物聯(lián)合治療前后血漿內(nèi)毒素變化情況。圖36藥物聯(lián)合治療前后血漿一氧化氮變化情況。圖37藥物聯(lián)合治療前后血漿腫瘤壞死因子變化情況。圖38藥代動力學pk趨勢圖。圖39藥代動力學所有個體pk集中圖。圖40計算方法第一示意圖。圖41計算方法第二示意圖。圖42計算方法第三示意圖。圖43藥效空間的維數(shù)選擇圖。圖44藥效空間的重組和各樣本投影值在取樣時間軸上的分布圖。圖45原始藥效指標在藥效空間1、2主成分上的權重分布圖。圖46總體結構模型結構示意圖。圖47各組平均值對全模型的擬合結果。圖48各組平均濃度擬合曲線。圖49各組平均濃度擬合值-實測值散點圖(左：群體參數(shù)擬合對照；右：個體參數(shù)擬合對照)。圖50用于計算的各組平均效應值。圖51全模型擬合后的各組平均效應曲線。圖52各組平均效應擬合值-實測值散點圖(左：群體參數(shù)擬合對照；右：個體參數(shù)擬合對照)。圖53用于計算的全體樣本濃度值。圖54全模型前12個個體濃度擬合曲線。圖55濃度擬合值-實測值散點圖(左：群體參數(shù)擬合對照；右：個體參數(shù)擬合對照)。圖56濃度實測值與擬合值累加概率置信區(qū)間。圖57濃度實測值變異區(qū)間與擬合值累加概率分布區(qū)間。圖58濃度實測值變異區(qū)間與擬合值累加概率分布區(qū)間。圖59用于計算的全體樣本效應值。圖60全模型前12個個體效應擬合曲線。圖61效應擬合值-實測值散點圖(左：群體參數(shù)擬合對照；右：個體參數(shù)擬合對照)。圖62效應實測值與擬合值累加概率置信區(qū)間。圖63效應實測值變異區(qū)間與擬合值累加概率分布區(qū)間。圖64效應實測值變異區(qū)間與擬合值累加概率分布區(qū)間。圖65各協(xié)變量與模型參數(shù)的盒式分布圖。圖66模型參數(shù)群體參數(shù)誤差分布的的盒式圖。圖67樣本在藥效空間重投影距離的動力學分布。圖68檢測no用的nano2標準液的稀釋步驟示意圖。具體實施方式下面結合具體實施例進一步說明本發(fā)明。下述實施例僅用于示例性說明，不能理解為對本發(fā)明的限制。除非特別說明，下述實施例中使用的原料為常規(guī)市購或商業(yè)途徑獲得的原料，除非特別說明，下述實施例中使用的方法和設備為本領域常規(guī)使用的方法和設備。實施例1一、本實施例實驗方法建立的原理分析概述1.處方分析：處方組成：千斤拔、金櫻根、穿心蓮、功勞木、單面針、當歸、雞血藤、黨參組成。功能主治：清熱除濕，益氣化瘀。主要用于濕熱瘀阻所致的帶下病、腹痛，癥見帶下量多、色黃質稠、臭穢，小腹疼痛，腰骶酸痛，神疲乏力；慢性盆腔炎、子宮內(nèi)膜炎、慢性宮頸炎見上述證候者。處方分析：從處方組成而言，從表1可見，藥物的性味、植物來源、化學成分，可將組方藥效方向可劃分為兩個功效群。其一為清熱除濕組，含千斤拔、金櫻根、穿心蓮、功勞木、單面針，其科屬來源及現(xiàn)有化學成分多具有抗菌抗炎鎮(zhèn)痛及免疫調節(jié)作用；其二為活血益氣組，含當歸、雞血藤、黨參，這三味藥作用相互疊加，現(xiàn)代藥理研究多具有改善血流變、調節(jié)平滑肌功能和血液生成等功能。表1處方組成及相關植物學和化學成分背景分析簡表2.致病機理及治療原則初步分析中醫(yī)學認為慢性盆腔炎(chronicpelvicinflammatorydisease，cpid)主要機理是婦人經(jīng)期、產(chǎn)后血室正開，余血未盡，易為六淫、七情、飲食、勞倦及房勞所傷，影響沖任氣血以成瘀為患。實踐中應用活血化瘀法可明顯改善臨床癥狀。西醫(yī)學則認為其為急性盆腔炎后的無菌性炎癥，表現(xiàn)為血液流變學、免疫學、病理學等異常改變。因此，治療采用抗感染、抗炎和宮腔內(nèi)藥物局部作用為基本治則，也有臨床文獻認為促使子宮收縮使感染性宮腔分泌物排出或應用大量抗生素的情況下清理宮腔具有較顯著療效。這一治療思想同當歸“引藥內(nèi)消”的本草認識具有思路上的相似處?！澳芤T血各歸其所當歸之經(jīng)，故名當歸”。“婦人以血為本”，當歸乃血家要藥，主要有補血活血，調經(jīng)止痛，潤腸通便之功，在婦科疾病中應用極廣?！侗静菪戮帯吩啤坝卯敋w于敗毒化毒藥中，正取其性動，則引藥內(nèi)消，直趨大便而出，奏功實神。故已潰者斷宜大用，使之活血以生肌，即未潰者尤宜急用，使之去毒而逐穢也。”結合婦科千金方的處方組成，可認為當歸引藥作用正是用其于敗毒化毒之千斤拔、金櫻根、穿心蓮、功勞木、單面針中，而收“去毒而逐穢”的引藥之功。綜上考慮，婦科千金方中清熱除濕組應為發(fā)揮抗感染抗炎的解外邪功效，作用類似現(xiàn)代抗微生物藥，而當歸、雞血藤、黨參的重疊作用類似于“宮腔分泌物排出”有相似之處。3.實驗原理通過長期研究分析并通過大量實驗，本申請人設計采用基線等加法，首先測定已證實明確有效的治療藥物阿奇霉素的作用水平，將阿奇霉素與供試藥物并行給予大鼠，測定合并用藥的基線水平和合并用藥的療效趨勢。總體實驗方案及流程見圖1所示。二、主要實驗過程1.實驗菌種：金黃色葡萄球菌(atcc25923)，大腸埃希菌(atcc25922)購買于中國國家菌種庫。受試菌株凍干粉用無菌m-h(b)培養(yǎng)基混懸后均勻鋪于無菌m-h(a)平板表面，35℃孵育過夜復活，18h后平板表面生長出菌苔，選取其中長勢良好的單一菌團，重新涂抹于m-h(a)斜面，相同條件下孵育18h，密封，4℃條件下冷藏保存；試驗前一天取斜面菌涂抹于m-h(a)平板，35℃孵育過夜，即可使用。所有操作均在超凈工作臺完成。2.菌液制備方法方法一：(高濃度菌液制備)挑3～4個單菌落于40毫升的m-h(b)培養(yǎng)基中。受試菌隔夜增菌培養(yǎng)16小時(37℃，水浴搖床振搖16小時)，次日取出原菌液用全波長多功能讀數(shù)議測od值(細菌生長飽和期)；取20ml，分裝于離心管中，每管2ml，離心10000～15000rpm/min，10分鐘，棄取上清液之中的m-h(b)，用2ml生理鹽水混勻后，再離心15000rpm/min，10分鐘，棄取上清液中的生理鹽水，收集細菌細胞菌體2ml。將相同方法培養(yǎng)的金色葡萄球菌和大腸埃希菌按1：1混合即獲得4ml混合菌液。將該菌液為100菌液濃度，用生理鹽水進行10倍稀釋，稀釋至0.1×100，0.01×100，備用(共3個劑量)。方法二：(低濃度菌液制備)挑單一菌落(包括金色葡萄球菌和大腸埃希菌)于2毫升的生理鹽水中，分別配制成為0.5麥氏濃度(約1×108cfu·ml－1)細菌混懸液，將金色葡萄球菌和大腸埃希菌混懸液混合，即得到混合菌液4ml。將該菌液設置成為10a菌液濃度，用生理鹽水進行對倍稀釋，稀釋至0.5×10a，0.25×10a，備用(共3個劑量)。3.藥品與試劑：m-h(a)培養(yǎng)基(oxoid公司，生產(chǎn)批號：cm0337a)；m-h(b)培養(yǎng)基(oxoid公司，生產(chǎn)批號：cm0405b)；烏拉坦溶液(20％)；生理鹽水(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號：m12012004)；其他試劑和耗材均由成都雅榮生化設備經(jīng)營部購買提供。4.儀器：電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司，bph-9162)；優(yōu)普系列超純水機(成都超純科技有限公司，upk-1-10t)；微量加樣器(eppendorfresearch，10、100、100ul)；空氣浴振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)，hzq-c)；自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠，ldzx-40bi)；全波長多功能讀數(shù)議(美國thermo)；菌落計數(shù)儀。5.慢性盆腔炎模型制備大鼠稱重標記，腹部常規(guī)消毒，20％烏拉坦0.5ml/100g腹腔注射麻醉，用1ml注射器抽取預先制備的混合菌液，左手持鼠尾提起大鼠，用10ml注射器磨去針頭尖，于陰道底部的子宮頸分叉處小心進入一側宮腔內(nèi)，針頭在宮腔內(nèi)來回抽拉2次以機械性損傷子宮內(nèi)膜組織，然后朝卵巢方向推注菌液0.1ml，同樣操作步驟將0.1ml菌液注入另一側子宮，注射完畢后，倒置大鼠5min，以防菌液漏出。分別于24h，48h觀察記錄各組大鼠感染情況，以大鼠無死亡，于造模后24h、72h、96h后分別陰道刮片，進行菌落培養(yǎng)，選擇菌落計數(shù)≥30，≤100的感染菌量作為最佳感染菌量。將該菌量作為體內(nèi)感染的菌量。受試大鼠感染菌量為表2所示：表2動物組別(n＝4)感染菌量110020.1×10030.01×100410a50.5×10a60.25×10a所有實驗動物于造模后24h、72h和96h，麻醉，常規(guī)消毒腹部，用無菌棉簽伸入宮口，來回抽拉2次后，將棉簽放入含2ml生理鹽水的試管中，獲得含測試品混懸液，取出棉簽，再用新的無菌棉簽充分蘸取混合液均勻涂抹于無菌m-h(a)平板表面，35℃孵育過夜，18h后進行菌落計數(shù)。240h犧牲動物，觀察子宮感染情況。各組典型鼠感染菌落計數(shù)，結果如下表3：表3受試大鼠感染菌量動物組別(n＝4)感染菌量110020.1×10030.01×100410a50.5×10a60.25×10a所有實驗動物于造模后24h、72h和96h，麻醉，常規(guī)消毒腹部，用無菌落計數(shù)結果顯示，3組鼠所感染菌量符合實驗要求。同時，解剖后可見子宮等直觀可見炎性充血與炎性水腫。實驗確定，方法(一)為受試菌最佳培養(yǎng)方式；0.01×100，為最佳感染菌量；實驗方法可以復制大鼠盆腔細菌慢性感染模型。6.大鼠血漿中阿奇霉素測定方法的構建(1)hplc-ecd儀器：lc-30auplc(日本島津)，antecdecadeiii電化學檢測器(荷蘭安泰克)，色譜工作站(labsolution5.5)；ql-901渦旋混合儀(上海滬西分析儀器有限公司)；mtn-2800w型氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；超低溫冰箱(fis13-990-16thermoscientific)；h2050r臺式冷凍離心機(湘儀離心機儀器有限公司)；電子天平(北京賽多利斯有限公司)等。動物：spf級sd大鼠，220g±20g，由四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所購得，實驗動物生產(chǎn)許可證號：scxk(川)2008-24。藥品及試劑：希舒美阿奇霉素片(zithromax，輝瑞制藥有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純fisherscientific)；甲酸(色譜純成都市科龍化工試劑廠)；水為屈臣氏蒸餾水。阿奇霉素、羅紅霉素標準品均購自中國食品藥品生物制品檢定所。給藥及取樣：大鼠灌胃給予azmcmc-na混懸溶液(60mg/kg)，分別于給藥15min、30min、1h、1.5h、2h、4h、8h、12h、24h取血0.2ml于肝素化離心管中，37℃水浴10-20分鐘后，3500r/min離心10min，分離上清于-80℃保存。液液萃取：取血漿50μl，加入10mnh4oh溶液10μl，加入內(nèi)標羅紅霉素甲醇溶液(160ng/ml)10μl。加入2ml二乙醚，渦旋1min，靜置3min，13300r/min離心5min，吸取上層有機相，30℃空氣流下吹干，殘留物加入150μl流動相溶解，渦旋1min，14000r/min離心3min，取30μl進行分析。色譜條件：色譜柱aglientporoshell120ec-c18(2.7μm×4.6×100mm)695975-902，在線濾器：ssi35-0149；流動相：乙腈-ph7.0磷酸緩沖溶液(45∶55，v/v)；流速0.8ml/min；柱溫30℃。玻碳工作電極電位+1.2v，參比電極ag/agcl。(2)hplc-esi-ms儀器：島津hplc-ms2020，包括在線真空脫氣機、二元泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器、esi、色譜工作站(labsolution5.5)；其余同hplc-ecd方法下儀器。色譜條件：色譜柱aglientporoshell120ec-c18(2.7um×4.6×100mm)695975-902，在線濾器：ssi35-0149；流動相：乙腈-10mmph5.2醋酸銨(65:35)，流速為0.2ml/min，進樣量5μl。質譜檢測條件：電噴霧電離源(esi)，選擇性正離子檢測(sim)，阿奇霉素m/z749.5[m+h]+和內(nèi)標羅紅霉素m/z837.5[m+h]+，電離源電壓4.5kv，噴霧氣(n2)的流速為1.5l/min，脫溶劑溫度為250℃，檢測器電壓1.5kv。典型離子流圖：azm約6min，is約8.4min。圖2所示為空白基質sim總離子流圖，圖3所示為標準物質+空白基質sim總離子流圖。圖4所示為典型低濃度樣品sim總離子流圖。實驗發(fā)現(xiàn)，兩種方法以esi檢測較為靈敏，定量限可達15ng/ml，并可通過提高流速，以實現(xiàn)分析時間的縮短。同時考慮ppk擬以穩(wěn)態(tài)藥濃為主要檢測對象，ecd應可基本滿足定量需求。7.il-1β、lps、tnf-α、no檢測方法參照試劑盒使用說明書，進行相關檢測。(1)il-1β1、加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。設標準孔7孔，依次加入100μl不同濃度的標準品(參照試劑盒使用說明書試劑準備)?？瞻卓准?00μl(參照試劑盒使用說明書)，余孔加待測樣品100μl，酶標板加上覆膜，37℃溫育2小時。2、棄去液體，甩干，不用洗滌。3、每孔加檢測溶液a工作液100μl(臨用前配制)，酶標板加上覆膜，37℃溫育1小時。4、棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μl的洗滌液洗滌，浸泡1～2分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)，重復洗板3次。最后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液完全甩干。自動洗板機亦可。5、每孔加檢測溶液b工作液(臨用前配制)100μl，加上覆膜，37℃溫育30分鐘。6、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟4。7、每孔加底物溶液90μl，酶標板加上覆膜，37℃避光顯色(反應時間控制在15～25分鐘，不要超過30分鐘。當標準孔的前3～4孔有明顯的梯度藍色，后3～4孔梯度不明顯時，即可終止)。8、每孔加終止溶液50μl，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。9、在確保酶標板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(o.d.值)。(2)lps1、加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。設標準孔5孔，依次加入50μl不同濃度的標準品(參照試劑盒使用說明書)?？瞻卓准?0μl(參照試劑盒使用說明書)，余孔加待測樣品50μl，然后立即每孔加檢測溶液a工作液50μl，輕輕振動，混勻，注意不要有氣泡，酶標板加上覆膜，37℃溫育1小時。2、棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μl的洗滌液洗滌，浸泡1～2分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)，重復洗板3次。最后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液完全甩干。自動洗板機亦可。3、每孔加檢測溶液b工作液(臨用前配制)100μl，加上覆膜，37℃溫育30分鐘。4、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟2。5、每孔加底物溶液90μl，酶標板加上覆膜，37℃避光顯色(反應時間控制在15～25分鐘，不要超過30分鐘。當標準孔的后面3孔有明顯的梯度藍色，前3孔梯度不明顯時，即可終止)。6、每孔加終止溶液50μl，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。7、在確保酶標板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(o.d.值)。(3)tnf-α1、加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。設標準孔7孔，依次加入100μl不同濃度的標準品(參照試劑盒使用說明書)。空白孔加100μl(見試劑準備第二步最后一管)，余孔加待測樣品100μl，酶標板加上覆膜，37℃溫育2小時。2、棄去液體，甩干，不用洗滌。3、每孔加檢測溶液a工作液100μl(臨用前配制)，酶標板加上覆膜，37℃溫育1小時。4、棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μl的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)，重復洗板3次。最后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液完全甩干。自動洗板機亦可。5、每孔加檢測溶液b工作液(臨用前配制)100μl，加上覆膜，37℃溫育30分鐘。6、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟4。7、每孔加底物溶液90μl，酶標板加上覆膜，37℃避光顯色(反應時間控制在15～25分鐘，不要超過30分鐘。當標準孔的前3～4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止)。8、每孔加終止溶液50μl，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。9、在確保酶標板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(o.d.值)。(4)no檢測1、nano2標準液的稀釋：取試管7支，依次標號1～7。用滴定管1號依次向2～7號試管加入雙蒸水1ml，用滴定管2號向1號試管加入nano2標準液2ml，再用滴定管2號從1號試管吸出1ml液體加入2號試管，混勻，再吸出1ml液體加入3號試管，混勻。重復此步驟。當從6號試管吸出1ml液體時棄去。稀釋步驟見圖68。2、用滴定管3號依次向1～7號試管加入1％磺胺0.5ml。3、用滴定管4號依次向1～7號試管加入0.1％n-1-萘基乙二胺鹽酸0.5ml。4、依次混勻1～7號試管內(nèi)液體，于常溫下孵育20分鐘。5、用7號試管內(nèi)液體作為對照組，用分光光度計分別測定1～6號試管內(nèi)液體的吸光度值并記錄。6、用滴定管滴加液體時應注意每一只滴定管只能用于每一種試劑，切忌混用。8.試驗方法模型及分組150只大鼠(雌性spf級sd大鼠，220g±20g，由四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所購得，實驗動物生產(chǎn)許可證號：scxk(川)2008-24)。16只用于空白，另行飼養(yǎng)。其余均采用造模方法麻醉后注射混合菌液。觀察5日，每日均隨機抽取6只及空白組2只麻醉后采集陰道分泌物用于細菌涂片。5日后存活大鼠隨機分為5組，即model、azm、azmqr、azmdg、azmff(分別表示不予治療的模型組、單獨使用阿奇霉素組、阿奇霉素清熱合并組、阿奇霉素缺當歸合并組、阿奇霉素全方合并組)。model：不予治療的模型組；azm：阿奇霉素治療模型組。azmqr：阿奇霉素+以千斤拔、穿心蓮、金櫻根、功勞木、單面針按照婦科千金片配方中的比例和方法制得組合物聯(lián)合治療模型組。azmdg：阿奇霉素+以千斤拔、穿心蓮、金櫻根、功勞木、單面針、雞血藤、黨參按照婦科千金片配方中的比例和方法制得制得組合物聯(lián)合治療模型組。azmff：阿奇霉素+婦科千金片(包括千斤拔、穿心蓮、金櫻根、功勞木、單面針、當歸、雞血藤、黨參成分，株洲千金藥業(yè)股份有限公司出品)聯(lián)合治療模型組。1.受試劑量(1)azm劑量：本實施例對阿奇霉素(azm)的可選受試劑量進行了分析和確定，目的為選擇一個試用后作用強度適中、時長適中的受試劑量，同時明確同中藥合并用藥時的時程長度。預試60、30、20、10mg/kg.d三天，發(fā)現(xiàn)原設定劑量過高，最終采用10mg/kg.d。(2)受試藥物劑量：原設定婦科千金方全方(azmff)為2.058g/kg.d，但預試發(fā)現(xiàn)，此劑量采用最大給容積配制的給藥液為稀漿狀，無法通過灌胃針頭。隨調整最終全方azmff給藥劑量為最大給藥量1.66g/kg.d，調整缺當歸組劑量dg為1.41g/kg.d、清熱組劑量qr為1.16g/kg.d。2.給藥時間除空白和模型外，造模后第六日開始給予相應藥物。azm與各中藥分別給予，相差時間約2小時。所有給藥組在8點左右均先給予相應劑量的azm，兩個小時后開始給予相應的中藥生理鹽水水混物。3.樣本收集第1日給予azm兩小時后，經(jīng)尾靜脈采集各組大鼠末梢靜脈血。從第二日始各給藥組大鼠每日兩次采血，于給予阿奇前和給予中藥前各經(jīng)尾靜脈采集一次，每次采集血量約0.3ml，取樣時間誤差約30min。于給藥第2、4、6、8日給予azm兩小時后，各組麻醉后犧牲約2～4只大鼠，采集下腔動脈抗凝全血，并同時收集犧牲大鼠的靶器官(子宮、孵巢、胸腺、脾臟)。4.送樣測試所有時間點0.3ml及末次全血，分取約0.2ml血漿用于uplc-ms檢測azm濃度。末次抗凝全血送檢血細胞計數(shù)、血流變。末次血漿用于檢測lps、tnf-α、no。子宮、孵巢、胸腺、脾臟稱重并計算臟器系數(shù)。子宮從子宮體中部切分，取1/2福爾馬林固定后用于病理送檢。實驗結果：圖5至圖13所示結果表明，實驗動物造模后，全血低切還原粘度、全血粘度和紅細胞聚集指數(shù)，與正常組比較均升高，給予不同的藥物組合治療后，各指數(shù)都降低，趨向于回復正常水平。各治療組之間的治療效果比較，全血低切還原粘度：azmff>azm>azmdg>azmqr；全血粘度：azmff>azmdg>azmqr>azm；紅細胞聚集指數(shù)：azmdg>azm>azmff>azmqr。以上結果表明，表明活血化瘀藥在血液流變狀態(tài)改變中起主要作用，可以改善“血瘀”這一病理狀態(tài)。血細胞計數(shù)及分類實驗結果見圖14至圖29所示。臟器系數(shù)又稱臟體比，是實驗動物某臟器的重量與其體重之比值。正常時各臟器與體重的比值比較恒定。動物染毒后，受損臟器重量可以發(fā)生改變，故臟器系數(shù)也隨之而改變。臟器系數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等；臟器系數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變。圖30至圖34所示結果表明，實驗動物造模后，4種臟器的臟器系數(shù)與正常組比較均升高，給予不同的藥物組合治療后，各系數(shù)都降低，趨向于回復正常水平。各治療組之間的治療效果比較，子宮臟器系數(shù)：azmdg>azmqr>azmff>azm；卵巢臟器系數(shù)：azm優(yōu)于其他，脾臟臟器系數(shù)：難以比較，胸腺臟器系數(shù)：azmff>azmdg>azm>azmqr。以上結果表明，表明慢性盆腔炎模型大鼠子宮、卵巢、脾臟和胸腺四種臟器由于炎癥反應，導致臟器充血、水腫，臟器系數(shù)增加；在給予抗菌消炎藥后，臟器系數(shù)均趨于恢復正常水平，但四種藥物之間的作用強度難以比較。圖35至圖37所示結果表明，實驗動物造模后，3種炎癥因子水平與正常組比較均明顯升高，給予不同的藥物組合治療后，各系數(shù)都降低，趨向于回復正常水平。各治療組之間的治療效果比較，血漿內(nèi)毒素：azmqr>azmdg>azm>azmff；血漿一氧化氮：azmdg、azmqr>azmff>azm，血漿腫瘤壞死因子：azmff>azm>azmdg>azmqr。以上結果表明，表明慢性盆腔炎模型大鼠血漿內(nèi)毒素、血漿一氧化氮、血漿腫瘤壞死因子由于感染和炎癥的發(fā)生，導致這三種炎癥因子大量產(chǎn)生，使其水平高于正常值；在給予藥物治療后，炎癥因子水平均趨于恢復正常水平，四種藥物之間的作于強度大致為：azmqr>azmdg>azmff>azm。9.藥代動力學實驗采用kinetica5計算了相關雙次給藥的藥時曲線及分布域，實驗結果見圖38和圖39。結果表明，每日給予azm兩小時后再給予中藥各組基本不影響相關生物利用度。清熱組后期略有降低其生物利用度趨勢，但這一作用可被復方中的活血組藥物引入而抵消，表明復方配伍可能有未知的一些體內(nèi)影響。10.群體藥動學-群體藥效學聯(lián)合模型的建模1.基本途徑包括以下步驟：s31.建立azm的ppk模型；s32.確定綜合表達總體藥效的線性空間或在各個藥效指標中選擇一個各組方協(xié)同作用較明顯的指標作為pd輸出值；s33.確定合適的pd指標量化模型，建立截斷數(shù)據(jù)的ppd模型；s34.分析阿奇霉素組織分布、抗菌類型、感染與炎癥關系的量化因素，確定合適的ppk-ppd聯(lián)接方式；s35.建立基于作用機制的婦科千金方組合物以及方中各活性成分組對阿奇霉素協(xié)同作用的合并用藥ppk-ppd綜合模型，計算相應模型參數(shù)；s36.對得到的模型參數(shù)進行相關假設檢驗及區(qū)間估計，完成評價。其中，步驟s35所述建立ppk-ppd綜合模型和計算相應模型參數(shù)的方法是：參照kinettica及monolix軟件進行整體模型的建立。各節(jié)點調整相應參數(shù)后，對前后計算結果進行aic和loglikelihood值比對，設置相應適當?shù)挠嬎銋?shù)。使用非線性混合效應模型分析全體藥物動力學過程，可估計動力學參數(shù)的群體分布及由于生理和病理(固定效應和協(xié)變量)對個體間變異的貢獻。分析算法主要為em法，e為條件期望貝葉斯估計，m為最大似然估計。條件期望貝葉斯估計時假設群體中藥物動力學參數(shù)具有已知的先驗分布(均數(shù)±方差)，同時亦假設殘余誤差分布(均值±方差)已知，在所述條件下對個體藥物動力學參數(shù)進行估計；最大似然估計以條件期望貝葉斯估計的個體參數(shù)為初值，以最大似然估計法求算群體均值及方差。em算法迭代進行時以前后兩次模型修正的模型顯著性改變?yōu)樵u價標準，前后兩次計算模型參數(shù)改變無顯著性則運算終止。2.計算方法和過程見圖40至42所示。3.ppk/ppk模型的建立3.1總體藥效空間的投影設定藥物作用后用于評價的藥效指標繁多，如何進行綜合性評價及選擇何種藥效指標進行量化評價具有天然的困難性和偏頗性。因此，為實現(xiàn)無人為主觀選擇及偏好的綜合評價，本發(fā)明采用pca-da、pls-da和opls-da將進行藥效評價的所有時間段中的樣本進行基于所有測定的生理及藥理指標的多變量分類識別，并將所有樣本的所有藥效按照非監(jiān)督的分類空間進行二次投影，以形成能反映綜合藥效的可用于ppd的樣本空間，并對組成樣本空間的高權重分類標志進行區(qū)分。分析方法：數(shù)據(jù)分析參照rversion3.1.2(rcoreteam；2014r:alanguageandenvironmentforstatisticalcomputing；rfoundationforstatisticalcomputing,vienna,austria；url:https://www.r-project.org),pca-da,pls-da,andopls-dainpackagemuma(metabolomicsunivariateandmultivariateanalysis,ver1.4；edoardog,francescac,dimitrioss,silviam,andreas,andmichelag,2012)，rpackageversion1.4.https://cran.r-project.org/web/packages/muma/index.html).(2)原始數(shù)據(jù)構成：分析矩陣每行為一樣本，列組成由各時間點體重、取樣進臟器重量、臟器系數(shù)、血細胞計數(shù)各值、血流變各值、炎癥指標各值組成，矩陣大小84*44。(3)分析結果：采用pca-da,pls-da,andopls-da分析表明，藥效指標可壓縮為4主成分(見圖43所示)，壓縮后能反映總體藥效指標的信息百分率約為80％，可反映絕大多數(shù)組間藥效作用變異。(4)藥效空間的重組和各樣本投影值的計算：將各樣本在以上四主成分空間各維度坐標值作為位置向量x＝(x1，x2，x3，x4)，以各維度反映原藥效空間的信息量作為權重向量w＝(w1，w2，w3，w4)，以空白對照組各樣本點x的平均為符號向量n，定義各樣本投影值為：sgn((x-n).w)*(x.w)(其中sgn為符號函數(shù))。繪制所得投影值在取樣時間軸上的動力學分布圖如圖44所示，結果表明藥效空間重組與各樣本重投影后所得距離值可反映整體藥效空間隨時間的動力學變化，具有明確的規(guī)律性。此投影距離可用于綜合反映藥效的藥效代表值。(5)高分辨率的藥效指標：對1，2主成分的構成比進行分析(如圖45所示)，明顯可見各組間藥效變異的主體指標為炎癥(右下角：lps，no，tnf)和血流變指標(右下角：全血低切還原粘度；左上角：全血高切相對粘度，紅細胞剛性指數(shù)，紅細胞變性指數(shù))。其它血細胞計數(shù)、體重、臟器指數(shù)在各組間變異極小，不構成反映最終療效的評價指標。(6)pd指標的確定:綜上所述，采用各樣本在以上四主成分空間的投影距離形成最終用于計算的各樣本pd指標(如下表4所示)。表4各樣本在線性變化的藥效空間的投影距離(信息量79.29％)3.2ppk/ppd模型的構建(1)數(shù)據(jù)分析的建模軟件：adapt5.1、kinetica5.5、monolix4.3.3withinmatlab2014a和rversion3.1.2withpackagesaemix1.2(cometse,lavenua,laviellem.saemix,anrversionofthesaemalgorithm.20thmeetingofthepopulationapproachgroupineurope,athens,greece(2011),abstr2173.http://www.page-meeting.org/default.asp？abstract＝2173)。(2)pk模型：匯總全樣本藥時曲線，分別進行一、二、三室房室模型和反向高斯模型擬合，按模型優(yōu)度和ppk-ppd模型參數(shù)擬合總體優(yōu)度進行ppk基礎模型的選擇。(3)pd模型：從樣本pd指標的動力學分布圖可見，空白組pd指標隨時間變異小，保持近擬線性常態(tài)穩(wěn)定，符合無造模攻擊等生理穩(wěn)態(tài)特點；模型組造模攻擊后有一定自發(fā)恢復現(xiàn)象，對其動力學進行多種曲線模式擬合，結果表明線性增長模型aic及bic值均較小，可用于描述相關動態(tài)過程。模型組pd指標的動力學變化可視為從病理改變度與生理正常值的改變度。各藥物干預組pd曲線是采用藥物干預模型組pd空間曲線的宏觀反應。模型化的描述這一現(xiàn)象即：模型組pd＝生理pd函數(shù)-病理pd函數(shù)；各治療組pd＝生理pd函數(shù)-病理pd函數(shù)+藥物作用函數(shù)。藥物作用函數(shù)考察微分和積分變化。(4)模型的聯(lián)結：azm屬于典型的時間依賴性抗生素，即殺菌活性與其同細菌接觸的持續(xù)時間成正比，即藥物的抗菌療效取決于藥物在組織中濃度維持在mic以上的持續(xù)時間。因此考察直接聯(lián)結和效應室聯(lián)結的作用部位累加模型，根據(jù)擬合優(yōu)度選擇聯(lián)結方式。(5)模型參數(shù)的概率分布：考察所有模型參數(shù)的正態(tài)、對數(shù)正態(tài)、logit的分布組合，選擇較優(yōu)的參數(shù)概率分布函數(shù)；(6)協(xié)變量模型：確定結構模型和模型參數(shù)的概率分布后，計算個體參數(shù)與體重、合并用藥組別分類的圖形分布，選擇多種協(xié)變量模型擬合，評價擬合優(yōu)度與假設檢驗結果，并結合協(xié)變量參數(shù)分布圖選擇較有意義的協(xié)變量模型。(7)誤差模型：確定結構模型和模型參數(shù)的概率分布后，濃度及藥效輸出的擬合結果對測量值進行誤差分布圖形檢查，選擇恰當?shù)哪Ｐ汀?8)模型參數(shù)的隨機效應誤差協(xié)方差模型：為簡化工作流程，固定協(xié)方差矩陣為對角矩陣，不進行選擇與優(yōu)化。3.3計算方法(1)數(shù)據(jù)：結構模型確定時僅使用給予azm的四組平均濃度-效應數(shù)據(jù)，可顯著降低機時；確定參數(shù)分布概率模型時，采用全體樣本，含空白及模型組；確定協(xié)變量模型和誤差模型時，采用給予azm的四組全體樣本。(2)初始值：程序迭代的收斂性顯著決定于初始值的設定，計算時模型各分塊分別計算平均組內(nèi)值，作為全模型的初始值。(3)迭代算法：same、ml并結合mcmc和bootstrap驗證(樣本數(shù)隨機重復抽樣，組成計算例500樣本)。3.4采用的總體模型(1)總體結構模型設定如圖46(結構模型框圖)所示。(2)結構模型：structuremode1pysocology(t)＝pysoa+pysob·thazards(t)＝hazaa+hazab·tdose(0)＝f·doseac(0)＝0ad(0)＝0effect＝physocology(t)-hazrads(t)+drug(t)output＝{cc，effect}(3)協(xié)變量模型：covariatemodel：(4)非協(xié)變量模型參數(shù)的概率分布：otherparametersdistribution：(5)誤差模型：residualerrormodel：y1＝ccy2＝effect(6)協(xié)方差模型：對角陣，即各模型參數(shù)隨機效應間無相關性，獨立分布。(7)生物學意義：藥動模型以inversegaussin模型擬合較好，但聯(lián)結pd后模型收斂性差，因此最終確定二房室模型。藥效如前所示分解為三部，分別反映生理狀態(tài)，病理狀態(tài)和藥物的累加改善。其中生理和病理函數(shù)選擇為線性模型，擬合結果較好的反映了空白對照組和模型對照組的時變規(guī)律，其后計算中其模型群體參數(shù)固定，設定其概率分布均為正態(tài)分布。根據(jù)azm特點和藥效空間投影的時間累加性，比較多種聯(lián)結模型后選擇直接聯(lián)結的藥效部位藥物累加量模型，即azm的藥效作用是藥效作用靶位的富積藥量值的函數(shù)，函數(shù)形式為emax模型?；貧w變量為時間t和靶位重量(uterus，以樣本取樣時子宮重量計)，體重為連續(xù)性協(xié)變量，組別為分類性協(xié)變量(其中azm組別編號為2，qr為3，dg為4，ff為5，空白為0，模型組為1)。組別協(xié)變量以組2為參比組，即群體值為azm組的代表值。3.5模型參數(shù)擬合和驗證(1)采用one-inandone-out雙向比較方法進行多次計算，并與協(xié)變量全作用與全不作用的模型擬合圖對照和比較相應參數(shù)(其余擬合圖見相應文件包，此正文中為減小篇輻不列出)，確定最終模型的中的協(xié)變量模型。各組平均值對全模型的擬合結果如圖47所示，可見模型對各樣本組平均濃度與效應值進行較為充分的結構及作用特點解釋。(2)以上文描述的模型對全體樣本進行參數(shù)擬合，并采用bootstrap法，進行模型驗證。結果見圖53至圖66所示。由圖53至圖66可見，模型擬合結果良好、穩(wěn)健，對各樣本和pk-pd特征進行了較精確的數(shù)量表征。協(xié)變量和模型參數(shù)的誤差分布圖也表明，設定的協(xié)變量模型和誤差分布能反映影響最終藥代特點和藥效特點的變化關系，可以此基礎上對合并用藥及生理因素影響最終藥代和藥效作用進行量化解析。4.6模型參數(shù)擬合結果對全體樣本進行如上描述模型的參數(shù)擬合，條件概率分布的參數(shù)最終迭代值反映模型信息量的aic和bic值均小于-10^4，群體參數(shù)擬合結果見表5所示。表5模型擬合的參數(shù)值上述實驗結果表明：1.實驗動物模型的制備：本發(fā)明所建立的慢性盆腔炎動物模型，分別于造模后24h，72h，96h后陰道刮片，進行菌落培養(yǎng)，菌落計數(shù)結果顯示，各組大鼠所感染菌量符合實驗要求。解剖后模型大鼠子宮直觀可見明顯炎性充血腫脹，多數(shù)宮腔迂曲擴張，末端膨大，表明采用該方法可成功復制大鼠慢性盆腔炎模型，為后續(xù)實驗開展提供可靠保證。2.大鼠血漿中阿奇霉素測定方法：本發(fā)明所采用的hplc-ms方法測定大鼠血漿中的azm濃度，該方法選擇性好，具有良好的線性、精密度、準確度，樣品分析時間短，檢測靈敏度高，定量限可達15ng/ml，為后續(xù)azm在大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究提供有效方法。3.合并用藥對阿奇霉素藥物動力學的影響：與單獨使用azm組相比，合并用藥各組阿奇霉素的藥動學參數(shù)clt、v1、cld、v2和mit均無顯著影響(p>0.05)，主要藥動學參數(shù)見表6所示。此研究結果說明，婦科千金片整方及各拆方組合不明顯影響阿奇霉素在慢性盆腔炎大鼠體內(nèi)的藥物動力學特征，證明婦科千金片在臨床上可與阿奇霉素聯(lián)合應用于慢性盆腔炎等疾病的治療。表6單獨使用azm組與合并用藥組多次給藥后阿奇霉素主要藥動學參數(shù)(n＝10)4.不同藥物組藥效綜合評價本發(fā)明已對各藥效指標在各組間的差異進行說明，由于藥物作用后用于評價的藥效指標繁多，不能僅通過某一或某幾個指標的變化說明機體狀態(tài)的改善，本發(fā)明進一步通過科學的統(tǒng)計學方法，從眾多的指標中選擇合理的指標對總體藥效進行綜合性量化評價。采用pca-da、pls-da、andopls-da分析表明，藥效指標可壓縮為4主成分，壓縮后能反映總體藥效指標的信息百分率約為80％，可反映絕大多數(shù)組間藥效作用變異。將各樣本在以上四主成分空間各維度坐標值作為位置向量x＝(x1，x2，x3，x4)，以各維度反映原藥效空間的信息量作為權重向量w＝(w1，w2，w3，w4)，以空白對照組各樣本點x的平均為符號向量n，定義各樣本投影值為：sgn((x-n).w)*(x.w)(其中sgn為符號函數(shù))。繪制所得投影值在取樣時間軸上的分布圖，即pd指標的動力學分布圖，見圖67所示。結果表明藥效空間重組與各樣本重投影后所得距離值可反映整體藥效空間隨時間的動力學變化，具有明確的規(guī)律性。此投影距離可用于綜合反映藥效的藥效代表值。從樣本pd指標的動力學分布圖可見，空白組pd指標隨時間變異小，保持近擬線性常態(tài)穩(wěn)定，符合無造模攻擊等生理穩(wěn)態(tài)特點；模型組造模攻擊后有一定自發(fā)恢復現(xiàn)象，對其動力學進行多種曲線模式擬合，結果表明線性增長模型aic及bic值均較小，可用于描述相關動態(tài)過程，模型組pd指標的動力學變化可視為從病理改變度與生理正常值的改變度；各藥物干預組pd曲線是對藥物干預模型組pd空間曲線的宏觀反應。模型化的描述這一現(xiàn)象即：模型組pd＝生理pd函數(shù)-病理pd函數(shù)；各治療組pd＝生理pd函數(shù)-病理pd函數(shù)+藥物作用函數(shù)。結果顯示，實驗動物造模后，機體綜合特征與正常組比較發(fā)生明顯改變，給予不同的藥物組合治療后，綜合藥效均隨治療時間的延續(xù)，趨向于回復正常水平。各藥物組之間的治療效果比較，各組總體藥效水平相當，無明顯差異性。5.ppk/ppd模型的構建及評價藥動模型以inversegaussin模型擬合較好，但聯(lián)結pd后模型收斂性差，因此最終確定了二房室模型。藥效如前所示分解為三部，分別反映生理狀態(tài)，病理狀態(tài)和藥物的累加改善。其中生理和病理函數(shù)根據(jù)圖46選擇為線性模型，擬合結果較好的反映了空白對照組和模型對照組的時變規(guī)律，其后計算中其模型群體參數(shù)固定，設定其概率分布均為正態(tài)分布。根據(jù)azm特點和藥效空間投影的時間累加性，比較多種聯(lián)結模型后選擇直接聯(lián)結的藥效部位藥物累加量模型，即azm的藥效作用是藥效作用靶位的富積藥量值的函數(shù)，函數(shù)形式為emax模型。表7擬合模型群體參數(shù)計算結果(1)合并用藥對azm藥動學的影響由最終確定的結構和協(xié)變量模型可見，合并qr、dg和ff組不會對azm的吸收、分布及排泄參數(shù)產(chǎn)生可定量的有顯著性的較大影響。(2)合并用藥對azm藥效學的影響由最終確定的結構和協(xié)變量模型可見，合并不對azmec50產(chǎn)生明確可測量的影響，但各組均會增強最終的emax值，emax_pop＝5.96，qr影響率為e^0.209＝1.23，dg影響率為e^0.416＝1.51，ff影響率為e^0.3＝1.17，即合并qr后azm的表觀最大效應增強1.23倍，其余組效應均相似，倍率也相似。以inversegaussin模型對阿奇霉素在各組實驗動物體內(nèi)的藥動學參數(shù)進行擬合，結果合并用藥各組對阿奇霉素在慢性盆腔炎大鼠體內(nèi)的藥動學參數(shù)無明顯影響；結合ppk-ppd模型計算結果，三個合并用藥組對阿奇霉素的組織分布具有增強作用，且這種作用強度在amzqr、amzdg、amzff三組中的倍率相當。此研究結果說明，婦科千金片整方及各拆方組合不明顯影響阿奇霉素在慢性盆腔炎大鼠體內(nèi)的藥物動力學特征，提示婦科千金片在臨床上可與阿奇霉素聯(lián)合應用于慢性盆腔炎等疾病的治療。合并用藥不對阿奇霉素ec50產(chǎn)生明確可測量的影響，即但各組均會增強最終的emax值，三個合并用藥組對阿奇霉素emax的增強效應及倍率相似。結合合并用藥組和單獨應用阿奇霉素組在藥動學和總體藥效學上的差異性，三個合并用藥組在藥動學和藥效學上與單獨使用阿奇霉素組相比，三者對藥動學參數(shù)的改善及藥效的增強總體作用水平相當。合并用藥各組對阿奇霉素總體藥效具有一定的增強作用。本發(fā)明通過ppk/ppd模型定量研究婦科千金方不同藥物組對阿奇霉素藥動學及藥效學的影響，將指導臨床用藥的ppk/ppd模型，通過針對性改進和優(yōu)化，有機地應用于中藥復方的組方研究中，可定量研究不同因素(如：不同組方藥物組)對群體藥動/藥效參數(shù)的影響，為臨床合理用藥提供指導；同時明確了婦科千金方中發(fā)揮抗炎功效的主要藥物群，為對中藥創(chuàng)新制劑研究，以及婦科千金方的二次開發(fā)具有重要意義，為中藥組方研究提供一個新的可借鑒方法。當前第1頁12