本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于介孔顆粒的熒光適配體檢測microRNA方法。

背景技術(shù)：

MicroRNAs(microRNAs)是一種長度為18-25nt的單鏈RNAs。它通過調(diào)節(jié)目的mRNA的翻譯從而發(fā)揮作用，已有證明人體中有超過1000種microRNAs參與調(diào)控人類基因組中超過30％的基因，與多種生命活動(dòng)有關(guān)。microRNAs的異常表達(dá)與眾多疾病有關(guān)，例如心臟病，癌癥，糖尿病，神經(jīng)變性的疾病等，其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量與正常細(xì)胞相比有顯著差異，microRNAs可被看做一種生物標(biāo)志物和潛在可能的眾多疾病的治療靶標(biāo)，所以對(duì)microRNAs的定量具有重要意義。但是，由于microRNAs具有低含量、極易降解等特性，很難對(duì)microRNAs進(jìn)行定量檢測。近些年出現(xiàn)了一些擴(kuò)增策略和信號(hào)檢測體系，例如，應(yīng)用LNA探針提高檢測敏感性的Northern印記法、Quantitative RT-PCR、microRNA芯片法等。但這些方法大都存在設(shè)備或試劑昂貴，檢測過程復(fù)雜費(fèi)時(shí)的缺陷(Chemical Reviews，113卷，6207頁，2013年)。因此，建立方便、快速、靈敏、低成本的microRNAs檢測技術(shù)，不僅有助于推動(dòng)生命過程的研究，同時(shí)可以應(yīng)用于診斷、預(yù)后或治療診斷狀況或疾病。通過適配體技術(shù)和納米熒光猝滅劑的結(jié)合，開發(fā)新的microRNA熒光檢測方法，可以顯著降低熒光背景信號(hào)，增強(qiáng)信噪比，從而提高檢測靈敏度。到目前為止，國內(nèi)外研究人員已經(jīng)報(bào)道了大量不同形貌和表面性質(zhì)的納米猝滅劑，例如金納米粒子、碳納米管、納米氧化石墨烯、納米金屬-有機(jī)框架、二硫化鉬納米盤等，以期實(shí)現(xiàn)microRNA熒光檢測靈敏度的提高。然而，這些納米猝滅劑存在合成條件苛刻、合成路線復(fù)雜、部分顆粒生物相容性差的缺陷，極大地限制了體內(nèi)/體外檢測應(yīng)用。

受貽貝粘附蛋白啟發(fā)的聚多巴胺納米粒子是一種新型的納米材料，其制備方法簡單，且具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和良好的生物相容性。在熒光檢測體系中，聚多巴胺納米顆粒和生物大分子尤其是單鏈DNA(ssDNA)分子結(jié)合，能通過芳香環(huán)結(jié)構(gòu)π電子的耦合和熒光共振能量轉(zhuǎn)移高效猝滅寡核苷酸上標(biāo)記的熒光染料的熒光信號(hào)(Chemical Science，5卷，3018頁，2014年)，因而被認(rèn)為是很有潛力的microRNA熒光檢測納米猝滅劑。需要注意的是，短雙鏈核酸的剛性棒狀結(jié)構(gòu)接近納米結(jié)構(gòu)表面時(shí)，會(huì)受到來自顆粒的DLVO(Derjaguin–Landau–Verwey–Overbeek)勢能作用下的排斥作用力(Physical Chemistry Chemical Physics,13卷,12603頁,2011年；Journal of Colloid and Interface Science,298卷,50頁,2006年)。由于大部分納米猝滅劑也具有正曲率的結(jié)合表面，受表面曲率效應(yīng)的影響，猝滅劑表面和雙鏈核酸之間的DLVO排斥作用較低，進(jìn)而導(dǎo)致單鏈核酸(microRNA適配體)結(jié)合弱，或者雙鏈核酸(microRNA及其適配體的復(fù)合體)不能有效脫離納米猝滅劑。樊春海等研究發(fā)現(xiàn)(Advanced Functional Materials,23卷,4140-4148頁,2013年)，具有正曲率表面的納米顆粒上，雙鏈核酸受到較小的靜電排斥作用，從而無法達(dá)到較高的脫離效率熒光響應(yīng)恢復(fù)強(qiáng)度和信噪比(小于12)。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是：受納米猝滅劑的正曲率外表面的影響，microRNA和其適配體形成的雙鏈核酸復(fù)合體脫離顆粒受到較大的限制，microRNA識(shí)別能形成的熒光響應(yīng)程度依然較低。開發(fā)具有孔結(jié)構(gòu)的、能通過負(fù)曲率效應(yīng)高效排斥雙鏈核酸、對(duì)microRNA識(shí)別有高效響應(yīng)性的納米猝滅劑顆粒及檢測體系，是解決這一問題的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種基于介孔顆粒的熒光適配體檢測microRNA方法；不同于現(xiàn)有技術(shù)中所用的非孔結(jié)構(gòu)的納米猝滅劑，本發(fā)明檢測系統(tǒng)中所述的介孔納米顆粒能通過孔結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)對(duì)單雙鏈核酸的親和性差異：其一，熒光適配體在孔道內(nèi)的高親和性裝載有效地猝滅單鏈核酸的熒光；其二，介孔聚多巴胺納米顆粒內(nèi)部孔道的負(fù)曲率，有利于表面PDA和雙鏈核酸之間親和性的降低，和microRNA識(shí)別之后熒光響應(yīng)的提高；最終，促使基于納米猝滅劑的microRNA檢測的信噪比的提高。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種microRNA納米檢測系統(tǒng)，所述microRNA納米檢測系統(tǒng)以介孔聚多巴胺納米顆粒為載體，以熒光素標(biāo)記的核酸適配體為探針，探針裝載進(jìn)入介孔孔道發(fā)生熒光猝滅；microRNA識(shí)別孔內(nèi)探針形成的雙鏈核酸復(fù)合體脫離顆粒形成熒光恢復(fù)；以DNA限制性內(nèi)切酶I(DNase I)的特異性DNA鏈段剪切功能實(shí)現(xiàn)microRNA循環(huán)和熒光信號(hào)放大，檢測microRNA的濃度范圍為10pM-100nM。

進(jìn)一步，所述介孔聚多巴胺納米載體顆粒粒徑為50nm～100nm，介孔孔徑為4nm～40nm。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述microRNA納米檢測系統(tǒng)的納米載體建立方法，所述納米載體建立方法包括以下步驟：

步驟一，在燒瓶中加入180mg～540mg嵌段共聚物F127、180mg～540mg均三甲苯、50mL～70mL無水乙醇、50mL～100mL去離子水，攪拌10min～60min后加入60mg～120mg三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、40mg～100mg多巴胺鹽酸鹽，室溫?cái)嚢?0小時(shí)～30小時(shí)；

步驟二：取反應(yīng)原液與丙酮混勻，反應(yīng)原液與丙酮的體積比5:2～5，11000rpm離心10min～20min，棄上清；加入20mL無水乙醇和10mL丙酮，超聲20min～60min，11000rpm離心5min～20min，重復(fù)兩次；最后收集沉淀即為介孔聚多巴胺納米載體，將其分散于無水乙醇中保存。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述納米載體建立方法建立的納米載體。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述納米載體的檢測microRNA的方法，所述檢測microRNA的方法包括以下步驟：

步驟一，熒光適配體的裝載，在1mL檢測緩沖液中加入10～120μg介孔聚多巴胺納米顆粒和50nM羥基熒光素標(biāo)記的核酸適配體，混勻30min，作為檢測體系；

步驟二，microRNA樣品檢測，在檢測體系中加入含有待檢測microRNA的樣品和10U～100U的DNA限制性內(nèi)切酶I，37℃混勻20min～200min；將待熒光分析的溶液加入到石英比色皿中，利用熒光分光光度計(jì)檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長為480nm，發(fā)射光波長為523nm，以熒光強(qiáng)度的增加表示microRNA的量。

進(jìn)一步，所述步驟一中檢測緩沖液溶劑為去離子水，其溶液組分及含量為：

三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，20毫摩爾每升；

氯化鈉，140毫摩爾每升；

氯化鉀，5毫摩爾每升；

氯化鈣，1毫摩爾每升；

氯化鎂，1毫摩爾每升；

pH為7.6。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果為：microRNAs檢測系統(tǒng)以介孔聚多巴胺納米顆粒為載體，顆粒粒徑為50～100nm，介孔孔徑為4～40nm；以羥基熒光素標(biāo)記核酸適配體為探針。本發(fā)明可以很好地應(yīng)用于microRNA檢測：探針裝載進(jìn)入介孔孔道可以實(shí)現(xiàn)效率為97％的高效熒光猝滅；介孔聚多巴胺納米顆粒內(nèi)部孔道的負(fù)曲率，有利于表面PDA和雙鏈核酸之間DLVO排斥作用力的加強(qiáng)和microRNA識(shí)別之后雙鏈核酸復(fù)合體的高效脫落和熒光恢復(fù)；DNA限制性內(nèi)切酶的輔助剪切功能，能實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)放大；最終，這些因素的綜合作用可以使檢測信噪比達(dá)到45，進(jìn)而使3σ法檢測限達(dá)到0.04nM，顯著高于已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的實(shí)心非孔球形納米猝滅劑。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的基于介孔顆粒的熒光適配體檢測microRNA方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的microRNA檢測方法的模擬示意圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的分析方法中介孔聚多巴胺的材料表征圖。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的介孔聚多巴胺納米顆粒隨時(shí)間對(duì)熒光標(biāo)記核酸適配體以及適配體和microRNA復(fù)合體的猝滅動(dòng)力學(xué)曲線示意圖。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測體系核酸的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。

圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的不同濃度介孔聚多巴胺對(duì)相同濃度熒光標(biāo)記核酸適配體的猝滅效率示意圖。

圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的Let-7a的檢測結(jié)果圖光譜圖。

圖8是本發(fā)明實(shí)施例提供的Let-7a的檢測線性區(qū)間示意圖。

圖9是本發(fā)明實(shí)施例提供的A549細(xì)胞裂解液中microRNA-21的檢測線性區(qū)間示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的基于介孔顆粒的熒光適配體檢測microRNA方法包括以下步驟：

S101：熒光適配體的裝載，在1mL檢測緩沖液中加入10～120μg介孔聚多巴胺納米顆粒(MPDA)和50nM羥基熒光素(FAM)標(biāo)記的核酸適配體，混勻30min，作為檢測體系；

S102：microRNA樣品檢測。在檢測體系中加入含有待檢測microRNA的樣品和10～100U的DNA限制性內(nèi)切酶I，37℃混勻20～200min。將上述待熒光分析的溶液加入到石英比色皿中，利用熒光分光光度計(jì)檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長為480nm，發(fā)射光波長為523nm，以熒光強(qiáng)度的增加表示microRNA的量。

在步驟S101中：其中，檢測緩沖液溶劑為去離子水，其溶液組分及含量為：

三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)，20毫摩爾每升；

氯化鈉，140毫摩爾每升；

氯化鉀，5毫摩爾每升；

氯化鈣，1毫摩爾每升；

氯化鎂，1毫摩爾每升；

pH為7.6。

本發(fā)明實(shí)施例提供的microRNA檢測系統(tǒng)，以介孔聚多巴胺納米顆粒為載體，以熒光素標(biāo)記的核酸適配體為探針，探針裝載進(jìn)入介孔孔道發(fā)生熒光猝滅；microRNA識(shí)別孔內(nèi)探針形成的雙鏈核酸復(fù)合體脫離顆粒形成熒光恢復(fù)；以DNA限制性內(nèi)切酶I的剪切功能實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大功能，檢測microRNA的濃度范圍為10pM-100nM。

所述介孔聚多巴胺納米載體顆粒粒徑為50～100nm，介孔孔徑為4～40nm。

所述的microRNA納米檢測系統(tǒng)的納米載體的建立方法包括以下步驟：

步驟一：在燒瓶中加入180～540mg嵌段共聚物F127(EO106PO70EO106)、180～540mg均三甲苯(TMB)、50～70mL無水乙醇、50～100mL去離子水，攪拌10～60min后加入60～120mg三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、40～100mg多巴胺鹽酸鹽，室溫?cái)嚢?0～30小時(shí)。

步驟二：取反應(yīng)原液與丙酮混勻(體積比5:2～5)，11000rpm離心10～20分鐘，棄上清。加入20mL無水乙醇和10mL丙酮，超聲20～60min，11000rpm離心5～20min，重復(fù)兩次。最后收集沉淀即為介孔聚多巴胺納米載體，將其分散于無水乙醇中保存。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的描述。

如圖2所示，是本發(fā)明實(shí)施例提供的基于介孔顆粒的microRNA檢測系統(tǒng)示意圖。如圖3所示為本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測系統(tǒng)中所述的介孔聚多巴胺納米顆粒的透射電子顯微鏡照片、氮?dú)馕降葴鼐€、孔徑分布曲線，其粒徑為～70nm，介孔孔徑為4～40nm。

本發(fā)明實(shí)施例中所用的microRNA和適配體的核酸序列：

實(shí)施例1(Let-7a分析)

步驟一：在燒瓶中加入180～540mg嵌段共聚物F127(EO₁₀₆PO₇₀EO₁₀₆)、360mg均三甲苯(TMB)、50～70mL無水乙醇、50～100mL去離子水，攪拌10～60min后加入60～120mg三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、40～100mg多巴胺鹽酸鹽，室溫?cái)嚢?0～30小時(shí)。

步驟二：取反應(yīng)原液與丙酮混勻(體積比5:2～5)，11000rpm離心10～20分鐘，棄上清。加入20mL無水乙醇和10mL丙酮，超聲20～60min，11000rpm離心5～20min，重復(fù)兩次。最后收集沉淀即為介孔聚多巴胺納米載體，將其分散于無水乙醇中保存。

步驟三：在1mL檢測緩沖液(20mM Tris-HCl(pH 7.6)、140mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl₂、1mM MgCl₂)中加入90μg介孔聚多巴胺納米顆粒(MPDA)和50nM P1，混勻30min，作為檢測體系。如圖4所示，檢測體系加入單鏈適配體和雙鏈的適配體/microRNA復(fù)合體后熒光強(qiáng)度隨時(shí)間先快后慢逐漸衰減，隨后趨于平緩，在350秒時(shí)強(qiáng)度分別降低為3811和128，熒光強(qiáng)度比率30。，說明MPDA顆粒的孔結(jié)構(gòu)對(duì)雙鏈、單鏈核酸親和性具有很大差異，這非常有利于適配體的高親和性結(jié)合和適配體/microRNA復(fù)合體的低親和性脫離。檢測體系核酸的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖5所示。其中泳道1為適配體(Probe)；泳道2為核酸內(nèi)切酶I(DNase I)作用后的Probe，發(fā)現(xiàn)酶剪切之后的短鏈核酸條帶；泳道3為DNase I作用后的microRNA，DNase I對(duì)其無剪切作用；泳道4為DNase I作用后的Probe-microRNA雙鏈核酸，再次觀察到酶剪切DNA之后的小鏈段條帶；泳道5為裝載Probe后的MPDA(Probe-MPDA)，泳道6位DNase I作用后的Probe-MPDA，證明了MPDA對(duì)熒光適配體的裝載和孔徑對(duì)其的保護(hù)作用；泳道7為加入檢測目標(biāo)microRNA的Probe-MPDA，泳道8為加入檢測目標(biāo)microRNA和DNase I的Probe-MPDA，酶切產(chǎn)物條帶的發(fā)現(xiàn)說明microRNA可以有效識(shí)別適配體，雜交雙鏈核酸可以脫離顆粒并被DNase I內(nèi)切成小的核酸片段，從而驗(yàn)證了檢測體系的可行性。圖6為適配體熒光猝滅效率隨顆粒濃度變化曲線圖，隨著顆粒濃度的增加，猝滅效率經(jīng)歷先快后慢的增長，當(dāng)顆粒濃度超過實(shí)施例所用的90μg/mL時(shí)，猝滅效率超過97％，說明適配體探針的熒光在介孔孔道內(nèi)被有效猝滅。

步驟四：在檢測體系中加入含有待檢測microRNAs的樣品和20U的DNA限制性內(nèi)切酶I，37℃混勻90min，檢測熒光強(qiáng)度。

本發(fā)明實(shí)施例對(duì)microRNA的檢測結(jié)果如圖7所示，隨Let-7a濃度增加(0pM-100nM)，熒光強(qiáng)度恢復(fù)值越高。如圖8所示，當(dāng)Let-7a濃度在200pM-5nM區(qū)間內(nèi)時(shí)，熒光強(qiáng)度與Let-7a濃度呈很好的線性關(guān)系(R2＝0.997)，熒光強(qiáng)度信噪比(加入和不加microRNA的熒光強(qiáng)度比值)在100nM濃度時(shí)達(dá)到45，由3σ法得到的檢測限為0.04nM。表明本檢測系統(tǒng)對(duì)于檢測microRNA具有良好的效果。

實(shí)施例2(細(xì)胞裂解液中microRNA-21分析)

步驟一：在燒瓶中加入180～540mg嵌段共聚物F127(EO₁₀₆PO₇₀EO₁₀₆)、360mg均三甲苯(TMB)、50～70mL無水乙醇、50～100mL去離子水，攪拌10～60min后加入60～120mg三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、40～100mg多巴胺鹽酸鹽，室溫?cái)嚢?0～30小時(shí)。

步驟二：取反應(yīng)原液與丙酮混勻(體積比5:2～5)，11000rpm離心10～20分鐘，棄上清。加入20mL無水乙醇和10mL丙酮，超聲20～60min，11000rpm離心5～20min，重復(fù)兩次。最后收集沉淀即為介孔聚多巴胺納米載體，將其分散于無水乙醇中保存。

步驟三：在1mL檢測緩沖液(20mM Tris-HCl(pH 7.6)、140mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl₂、1mM MgCl₂)中加入90μg介孔聚多巴胺納米顆粒(MPDA)和50nM P1，混勻30min，作為檢測體系。

步驟四：在1mL檢測緩沖液(20mM Tris-HCl(pH7.6)、140mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl₂、1mM MgCl₂)中加入90μg介孔聚多巴胺納米顆粒(MPDA)和50nM P1，混勻30min。加入20U的DNA限制性內(nèi)切酶I和不同數(shù)量A549細(xì)胞的裂解液總RNA提取液(1萬-5000萬細(xì)胞)，37℃恒溫混勻90min，檢測熒光強(qiáng)度。本發(fā)明實(shí)施例檢測microRNA結(jié)果如圖9所示，1萬個(gè)細(xì)胞的RNA提取液就有熒光響應(yīng)，且隨細(xì)胞數(shù)目增多，其裂解液中microRNA-21含量越多，使得檢測體系熒光強(qiáng)度恢復(fù)越大。表明本檢測系統(tǒng)對(duì)于檢測細(xì)胞裂解液中的microRNA具有良好的效果。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。