本發(fā)明屬于生物標本的制備方法領(lǐng)域，涉及海洋和淡水生物標本。

背景技術(shù)：

目前，用來長期保存微型和小型水生生物是用福爾馬林溶液浸泡保存和利用天然樹脂封片保存。上述兩種方法雖然都能得到水生生物的標本，但其仍存在以下問題：首先，用福爾馬林溶液保存的小型水生生物有強烈的氣味，不適用于作為學(xué)生的教具。同時，浸泡的標本需要傾倒出來進行觀察，對于微小樣品來說操作過程麻煩，標本容易丟失，給教學(xué)和科研工作帶來不便。而如果運用經(jīng)典的樹脂封片法，由于水生生物含水量高，直接用樹脂浸泡保存則樹脂難以滲透進細胞內(nèi)部，因此經(jīng)常需要甘油等粘稠液體將樣品懸浮于其中再進行天然樹脂封片，或者是先將樣品脫水后再利用天然樹脂封片。在使用天然樹脂封片保存時，標本制作步驟麻煩，樹脂固化時間極長，而且封片用的天然樹脂易于變黃老化從而使標本受到破壞。

因此，在生物科普教學(xué)方面，對于小型水生生物的科普教學(xué)常常缺位，或者開展困難。在高等教育水產(chǎn)及水生生物類課程教學(xué)中，作為教具的標本每次實驗后均有一定的損耗。在科研中，由于福爾馬林浸泡的標本無論是攜帶還是運輸都存在困難，從事分類和鑒定工作的人們很難進行有效交流。

為了解決上述技術(shù)問題，人們提出了各種各樣的改進方案，例如國家知識產(chǎn)權(quán)局就公開了一種生物標本的塑化方法{申請?zhí)枺?01010612850.9}包括如下步驟：a、生物標本固定：用的福爾馬林對生物標本進行完全固定；b、脫水、脫脂：固定好的生物標本經(jīng)過制作后，丙酮置換直至標本的含水量＜1％為止；c、真空浸漬：將置換完全的生物標本浸漬于生物真空浸漬塑化劑中，在真空負壓冰柜中完成置換；d、烤箱烘烤：將置換完全生物標本放入烤箱中進行高溫烘烤，將生物標本體內(nèi)多余的生物真空浸漬塑化劑去除干凈；e、硬化：將經(jīng)過烤箱烘烤后的生物標本放入密閉的容器中硬化。

或是生物標本塑化法{申請?zhí)枺?0105847.9}法利用樹脂混合液將標本中的體液置換出來進行塑化，以提供一種生物標本塑化方法，其制作步驟包括有：脫水、完全浸泡于樹脂混合液中、靜置瀝干、涂布催化劑、靜置反應(yīng)及干燥固化等步驟。經(jīng)由塑化完成的生物標本，不但其外觀或標本組織細胞能保有完整狀態(tài)，且具有柔軟度及真實感，可供教學(xué)研究及標本的長期保存用。

亦或是透明水溶性樹脂小型生物標本制備法{申請?zhí)枺?00610054494.7}該方法使用原料為聚乙二醇、透明脲醛樹脂(液體)和冰醋酸。透明脲醛樹脂液與聚乙二醇重量比為1∶0.4～2.3，經(jīng)聚合反應(yīng)形成透明水溶性樹脂。冰醋酸(含量≥99.5)的加入量是聚乙二醇與透明脲醛樹脂進行聚合反應(yīng)形成的透明總量的5～15％，主要起凝固劑的作用，用上述工藝制備的樹脂制作生物標本，主要步驟分為三步：a.底膠的制備、b.包埋生物標本、c.面膠的制備，該方法是一種簡單易行的方法，其優(yōu)點在于：該方法原料易得，成本低；制備的透明水溶性樹脂流動性強，透明度好，便于生物標本的包埋；該方法制備的標本具韌性，不易開裂，能防蟲，防霉，并能保持標本原來的色彩，是一種成功率較高的小型生物標本的制作方法。

上述方法中，雖然在一定程度上解決了傳統(tǒng)標本制備方法中存在的技術(shù)問題，但是其途徑往往集中在改造樹脂，使之具備親水能力，從而保證可以迅速滲透到生物體內(nèi)，或者仍然使用疏水樹脂，但需要復(fù)雜的前處理。此類途徑不僅操作復(fù)雜，且成本較高，使用壽命較低，且有的方法由于存在特殊操作步驟不適合使用在水生生物上，因此迫切的需要一種方便簡單、保存效果好的新方法來制備標本。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對上述的在制備水生生物標本存在的操作復(fù)雜、缺乏廣泛適用性等技術(shù)問題，提出一種方法科學(xué)、操作方便、保存時間長且保存效果好、便于運輸?shù)睦铆h(huán)氧樹脂保存生物標本的新型方法。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為，本發(fā)明提供一種利用環(huán)氧樹脂保存水生生物標本的新型方法，包括以下有效步驟：

a、脫水：將已經(jīng)用固定液處理過的水生生物放入無水乙醇或者丙酮中，進行脫水，待脫水完成后，將生物放置到容器中；

b、配置樹脂：將環(huán)氧樹脂和固化劑按照3∶1的比例配置均勻，得到環(huán)氧樹脂混合漿；

c、包埋：將混合好的環(huán)氧樹脂混合漿倒入容器中，對生物進行整姿，包埋；

d、固化：待包埋完成后采用自然固化法或烘干法對標本進行固化，待固化完成后即可得到生物標本。

作為優(yōu)選，所述b步驟中，所述環(huán)氧樹脂為南亞128環(huán)氧樹脂(e-51)，所述固化劑為d230。

作為優(yōu)選，所述d步驟中，所述烘干法的控制溫度在60℃～100℃。

作為優(yōu)選，還包括a1、染色：將完成a步驟的水生生物浸入到考馬斯亮藍或者伊紅染色液進行染色，待染色完成后，將生物放入無水乙醇中，漂洗5分鐘至上面沒有粘附的燃料顆粒以及浮色，然后取出，進行b步驟即可。

作為優(yōu)選，所述a1步驟中考馬斯亮藍染色液的配置方法為：稱取100mg考馬斯亮藍溶于50ml90％乙醇中，加入85％的磷酸100ml，最后用蒸餾水定容到1000ml，然后將此溶液在常溫下可靜置一個月，即可得到考馬斯亮藍染色液。

作為優(yōu)選，所述考馬斯亮藍的型號為g-250。

作為優(yōu)選，所述a1步驟中伊紅染色液的配置方法為：將醇溶性伊紅0.1g加入100ml95％乙醇中，加溫至40℃左右，攪拌至全部溶解。降溫至室溫，即制成伊紅染色液。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果在于，

1、本發(fā)明利用環(huán)氧樹脂和固化劑的混合配置，使整個水生生物的標本制作簡便快速且成本低廉，使本方法生產(chǎn)的標本能夠適應(yīng)生物教具和標準樣品的生物標本的研究需要，同時，本發(fā)明所提供制成的生物標本便于保存、運輸、交換交流且本方法生產(chǎn)出的標本很好地保存了生物的分類鑒定特征，性質(zhì)穩(wěn)定，并且不易老化，尤其適合小型和微型水生生物的保存。

2、本方法生產(chǎn)出的標本形態(tài)特征清晰，無毒無味，堅硬透明，攜帶方便，可以作為工藝品和科普教具使用，也可供專業(yè)人士作為模式標本或者標準來使用。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作一簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為考馬斯亮藍染色后的效果圖；

圖2為考馬斯亮藍染色后的局部效果圖；

圖3為伊紅染色后的局部效果圖；

圖4為伊紅染色后的局部效果圖。

具體實施方式

為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點，下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明。需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請的實施例及實施例中的特征可以相互組合。

在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是，本發(fā)明還可以采用不同于在此描述的其他方式來實施，因此，本發(fā)明并不限于下面公開說明書的具體實施例的限制。

本方法適合保存的生物主要是海洋和淡水生小型和微型生物。尤其適合保存海洋和淡水浮游和底棲甲殼動物、硅甲藻、有孔蟲(體積細微易丟失)等(更多的適合生物需要進行試驗來確定)，本發(fā)明主要解決的問題是現(xiàn)有海洋和淡水生小型和微型生物的標本在制作過程中存在的技術(shù)問題，最終導(dǎo)致在我國目前的生物科普教學(xué)中，長期大量使用陸生生物，水生生物由于沒有好的教具制作方法長期在教學(xué)中缺位問題。

實施例1，本實施例提供一種不需要染色的生物標本的制作方法

首先將需要制成標本、已經(jīng)固定后的生物直接放入無水乙醇或者丙酮中，進行脫水。對于小型和微型的水生生物來說，脫水時間很短。大概在幾十分鐘到幾天不等。之后，將標本取出，放入到容器中。在此過程中，如果標本身體非常柔軟，脫水步驟中可能萎縮，為了防止在脫水過程中發(fā)生變形，可以采取梯度脫水的辦法，或者縮短脫水時間。

然后，按照重量比例3∶1混合環(huán)氧樹脂和固化劑，在本實施例中，環(huán)氧樹脂采用南亞128環(huán)氧樹脂(e-51)，黏度為12000-15000，環(huán)氧當(dāng)量184-190，為液態(tài)雙酚a型樹脂。黏度較高，應(yīng)用歷史悠久，成品無毒無氣味，而固化劑則選用d230，其具有透明度好、抗黃變、柔韌性好、色澤光亮、無毒無刺激等優(yōu)點，在此過程中，如果樹脂量比較大，將產(chǎn)生大量氣泡。必要時可以用抽濾器抽濾以迅速消除氣泡。如樹脂量很少，則該步驟無需抽濾，靜止等待氣泡消失即可。

在本實施例中，選用e-51做環(huán)氧樹脂主要是利用其粘稠性，方便好對后期的生物標本進行整姿，另外，也是最重要的一點，是用e-51和d230配置好的環(huán)氧樹脂混合漿在包埋過程中，一些由于甲醛保存過程而體色變得暗淡渾濁的生物體在d230作用下，5min之內(nèi)，即變得透明，接近活著時候的體色，且內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰可見，外部形態(tài)、肌肉、消化道等都得到了完整的保存。這一點對于生物標本顯微鏡觀察非常重要。大型底棲和浮游甲殼動物則不會變色，保持福爾馬林固定樣品后的顏色，這點對于標本的制作具有重大的意義，節(jié)省了傳統(tǒng)標本制作中透明化試劑使用步驟，且使標本中的生物接近活體的外觀，這也是本發(fā)明的重點之處。

將混合好的環(huán)氧樹脂混合漿傾倒入容器中，對標本進行整姿。因為環(huán)氧樹脂有一定粘稠度，因此對于小型和微型水生生物來說，整姿很方便，如果需要對標本進行解剖，也在該步驟進行。解剖完之后，注意將解剖后得到的肢體展平，或者擺成適合觀察的姿勢。也可以將標本先解剖再緩緩傾入混合后的樹脂。樹脂的厚度需要盡量薄，剛浸沒標本即可，便于觀察成型后的標本。然后，即可對標本進行固化操作，固化可以采用自然固化法，也可以用烘箱進行。較高的溫度(60到100度)有利于標本的充分固化。該步驟視條件而定。固化后的標本，其形態(tài)近似于市售水晶工藝品和傳統(tǒng)的樹膠封片標準標本，保存方便，便于攜帶、觀察和交流。

實施例2，本實施例提供一種以考馬斯亮藍染色液染色的海洋生物標本的制作方法

首先將需要制成標本的生物直接放入無水乙醇進行脫水。對于小型和微型的水生生物來說，脫水時間很短。大概在幾十分鐘到幾天不等。之后，將標本取出，放入到容器中。在此過程中，如果標本身體非常柔軟易萎縮，為了防止在脫水過程中發(fā)生變形，可以采取梯度脫水的辦法，或者縮短脫水時間。

稱取100mg考馬斯亮藍g-250溶于50ml90％乙醇中，加入85％的磷酸100ml，最后用蒸餾水定容到1000ml，然后將此溶液在常溫下可靜置一個月，即可得到考馬斯亮藍染色液。

然后將上述脫水后的生物浸入到考馬斯亮藍進行染色，待染色完成后，將海洋生物放入無水乙醇中，漂洗5分鐘至上面沒有粘附的燃料顆粒以及浮色，然后取出。

接著，按照重量比例在3∶1混合環(huán)氧樹脂和固化劑，在本實施例中，環(huán)氧樹脂采用南亞128環(huán)氧樹脂(e-51)，黏度為12000-15000，環(huán)氧當(dāng)量184-190，為液態(tài)雙酚a型樹脂。黏度較高，應(yīng)用歷史悠久，成品無毒無氣味，而固化劑則選用d230，其具有透明度好、抗黃變、柔韌性好、色澤光亮、無毒無刺激等優(yōu)點，在此過程中，如果樹脂量比較大，將產(chǎn)生大量氣泡。必要時可以用抽濾器抽濾以迅速消除氣泡。如樹脂量很少，則該步驟無需抽濾，靜止等待氣泡消失即可。

在本實施例中，選用e-51做環(huán)氧樹脂主要是利用其粘稠性，方便好對后期的生物標本進行整姿，另外，也是最重要的一點，是用e-51和d230配置好的環(huán)氧樹脂混合漿在包埋過程中，一些由于甲醛保存過程而體色變得暗淡渾濁的生物體在d230作用下，5min之內(nèi)，即變得透明，接近活著時候的體色，且內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰可見，外部形態(tài)、肌肉、消化道等都得到了完整的保存。這一點對于生物標本顯微鏡觀察非常重要。大型底棲和浮游甲殼動物則不會變色，保持福爾馬林固定樣品后的顏色，這點對于標本的制作具有重大的意義，節(jié)省了傳統(tǒng)標本制作中透明化試劑使用步驟，且使標本中的生物接近活體的外觀，這也是本發(fā)明的重點之處。

將混合好的環(huán)氧樹脂混合漿傾倒入容器中，對標本進行整姿。因為環(huán)氧樹脂有一定粘稠度，因此對于小型和微型水生生物來說，整姿很方便，如果需要對標本進行解剖，也在該步驟進行。解剖完之后，注意將解剖后得到的肢體展平，或者擺成適合觀察的姿勢。也可以將標本先解剖再緩緩傾入混合后的樹脂。樹脂的厚度需要盡量薄，剛浸沒標本即可，便于觀察成型后的標本。然后，即可對標本進行固化操作，固化可以采用自然固化法，也可以用烘箱進行。較高的溫度(60到100度)有利于標本的充分固化。該步驟視條件而定。固化后的標本，如圖1、圖2所示其形態(tài)近似于市售水晶工藝品和傳統(tǒng)的樹膠封片標準標本，保存方便，便于攜帶、觀察和交流。染色劑的作用是將透明的標本染色，便于在玻片上查找到標本的位置，同時染色劑可以使肌肉組織和外表進一步清晰化，便于觀察。

實施例3，本實施例提供一種以伊紅染色液染色的海洋生物標本的制作方法

首先將需要制成標本的水生生物直接放入無水乙醇進行脫水。對于小型和微型的水生生物來說，脫水時間很短。大概在幾十分鐘到幾天不等。之后，將標本取出，放入到容器中。在此過程中，如果標本身體非常柔軟，脫水步驟中容易萎縮，為了防止在脫水過程中發(fā)生變形，可以采取梯度脫水的辦法，或者縮短脫水時間。

然后，將醇溶性伊紅0.1g加入100ml95％乙醇中，加溫至40℃左右，攪拌至全部溶解。降溫至室溫，即制成伊紅染色液。

然后將上述脫水處理后的生物浸入到伊紅染色液進行染色，待染色完成后，將生物放入無水乙醇中，漂洗5分鐘至上面沒有粘附的燃料顆粒以及浮色，然后取出。

接著，按照重量比例在3∶1混合環(huán)氧樹脂和固化劑，在本實施例中，環(huán)氧樹脂采用南亞128環(huán)氧樹脂(e-51)，黏度為12000-15000，環(huán)氧當(dāng)量184-190，為液態(tài)雙酚a型樹脂。黏度較高，應(yīng)用歷史悠久，成品無毒無氣味，而固化劑則選用d230，其具有透明度好、抗黃變、柔韌性好、色澤光亮、無毒無刺激等優(yōu)點，在此過程中，如果樹脂量比較大，將產(chǎn)生大量氣泡。必要時可以用抽濾器抽濾以迅速消除氣泡。如樹脂量很少，則該步驟無需抽濾，靜止等待氣泡消失即可。

在本實施例中，選用e-51做環(huán)氧樹脂主要是利用其粘稠性，方便好對后期的生物標本進行整姿，另外，也是最重要的一點，是用e-51和d230配置好的環(huán)氧樹脂混合漿在包埋過程中，一些由于甲醛保存過程而體色變得暗淡渾濁的生物體在d230作用下，5min之內(nèi)，即變得透明，接近活著時候的體色，且內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰可見，外部形態(tài)、肌肉、消化道等都得到了完整的保存。這一點對于生物標本顯微鏡觀察非常重要。大型底棲和浮游甲殼動物則不會變色，保持福爾馬林固定樣品后的顏色，這點對于標本的制作具有重大的意義，節(jié)省了傳統(tǒng)標本制作中透明化試劑使用步驟，且使標本中的生物接近活體的外觀，這也是本發(fā)明的重點之處。

將混合好的環(huán)氧樹脂混合漿傾倒入容器中，對標本進行整姿。因為環(huán)氧樹脂有一定粘稠度，因此對于小型和微型水生生物來說，整姿很方便，如果需要對標本進行解剖，也在該步驟進行。解剖完之后，注意將解剖后得到的肢體展平，或者擺成適合觀察的姿勢。也可以將標本先解剖再傾入混合后的樹脂。樹脂的厚度需要盡量薄，剛浸沒標本即可，便于觀察成型后的標本。然后，即可對海洋生物進行固化操作，固化可以采用自然固化法，也可以用烘箱進行。較高的溫度(60到100度)有利于標本的充分固化。該步驟視條件而定。固化后的標本，如圖3、圖4所示其形態(tài)近似于市售水晶工藝品和傳統(tǒng)的樹膠封片標準標本，保存方便，便于攜帶、觀察和交流。染色劑的作用是將透明的標本染色，便于在玻片上查找到標本的位置，同時染色劑可以使肌肉組織和外表進一步清晰化，便于觀察。

另外，本發(fā)明所提供的環(huán)氧樹脂和固定劑配置液也可以針對水生植物進行標本制作，其制作方法在環(huán)氧樹脂混合漿的配置、包埋以及固化過程均一致，其的區(qū)別主要集中在標本的前處理過程中。

對于浮游植物，為了觀察其殼面的精巧花紋，可以以雙氧水溶解掉有機質(zhì)再進行制片，也可以直接進行制片。下面先提供直接制片的方法，其步驟如下：

首先，以浮游植物網(wǎng)具撈取浮游植物，鏡檢檢查其密度和種類組成，加入中性甲醛固定。甲醛固定后進行沉降，以保鮮膜蒙住量筒口，靜止24小時至48小時后，將上清液吸出，余下底部液體混合均勻即為濃縮后的硅藻。將硅藻連同培養(yǎng)液一起傾倒進燒杯中，按照1∶10的比例添加無水乙醇，然后再度靜止沉降。吸出上清液，倒出硅藻，重新加入無水乙醇。然后重復(fù)地將硅藻連同培養(yǎng)液一起傾倒進燒杯中，按照1∶10的比例添加無水乙醇，然后再度靜止沉降。吸出上清液，倒出硅藻，重新加入無水乙醇。直至藻體中基本不含水分。

接著，倒入乙醇輕輕攪動至沉淀全部浮起，靜置十幾秒，取懸浮液，棄去下層沉淀的沙粒等雜質(zhì)。將硅藻液濃縮后吸出，滴到玻片上，待乙醇揮發(fā)到幾乎整個玻片干燥，然后將混合后的膠液倒上去。待其自流平整，充分固化后即可?？梢栽诠袒皦荷w玻片也可以選擇不壓蓋玻片。

消化硅藻中的有機質(zhì)后再行制片的步驟如下：

將濃縮后的硅藻液加入30％雙氧水適量(不小于藻液體積的5倍)，在70℃下水浴加熱進行反應(yīng)。加熱至有機物被完全溶解，停止加熱降溫至室溫。傾倒出樣品，靜置濃縮。也可以進行離心濃縮，但在取出硅藻樣品時需非常注意，避免因擾動或者離心速度過高而損壞硅藻群體的形態(tài)。添加無水乙醇，靜置沉淀濃縮，再度加入乙醇，重復(fù)步驟直至藻體內(nèi)的水分全部被乙醇置換掉。倒入乙醇，攪動，取懸浮液棄去沉淀沙粒。將得到的懸浮液濃縮后，滴在玻片上，待乙醇大部分揮發(fā)玻片稍潤濕的時候，滴上環(huán)氧樹脂混合漿封片，待固化后即可。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例應(yīng)用于其它領(lǐng)域，但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。