本發(fā)明屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于高效液相色譜法的沙庫必曲中間體及其光學異構(gòu)體的分離檢測方法。

背景技術(shù)：

瑞士諾華制藥公司研發(fā)的抗心衰藥物Entresto(代號LCZ696)是一種血管緊張素II受體與腦啡肽酶的雙重抑制劑，其包含等摩爾的纈沙坦(valsartan)和沙庫必曲(sacubitril)。

(2R,4S)-5-(聯(lián)苯-4-基)-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-甲基戊酸(代號AHU08)是合成沙庫必曲的關(guān)鍵中間體，其分子結(jié)構(gòu)中具有2個手性中心，因此AHU08中往往存在其它3種光學異構(gòu)體雜質(zhì)，分別是作為差向異構(gòu)體的Isomer1(2S,4S)、作為差向異構(gòu)體的Isomer2(2R,4R)和作為對映異構(gòu)體的Isomer3(2S,4R)(結(jié)構(gòu)如下所示)。這些光學異構(gòu)體雜質(zhì)會殘留在藥物中，影響藥物的質(zhì)量和安全性。因此，控制AHU08中其它光學異構(gòu)體的含量，對提高LCZ696的質(zhì)量，保證廣大患者的用藥安全具有重大意義。

對于上述AHU08的光學異構(gòu)體雜質(zhì)，需要在藥物合成過程中進行質(zhì)量控制。然而，對于具有手性碳原子(尤其是多個手性碳原子)的光學異構(gòu)體的分離一直是手性藥物合成和制劑質(zhì)量控制的難點。經(jīng)文獻檢索，未見有關(guān)于AHU08及其光學異構(gòu)體的分離檢測方法的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述情況，本發(fā)明旨在提供一種基于HPLC的沙庫必曲中間體(AHU08)及其光學異構(gòu)體的分離檢測方法。通過該方法能夠簡單、快速、準確地分離分析AHU08及其光學異構(gòu)體雜質(zhì)，可用于AHU08的制備過程和終產(chǎn)品質(zhì)量控制。

具體而言，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種基于高效液相色譜法的沙庫必曲中間體及其光學異構(gòu)體的分離檢測方法，其采用以涂敷有直鏈淀粉衍生物的硅膠作為固定相的手性柱，并且以非極性混合溶劑作為流動相，可以將沙庫必曲中間體及其光學異構(gòu)體進行有效分離，從而可以準確控制雜質(zhì)的含量。

在一項優(yōu)選的實施方案中，所述直鏈淀粉衍生物為直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。

在一項更優(yōu)選的實施方案中，所述以涂敷有直鏈淀粉衍生物的硅膠作為固定相的手性柱為CHIRALPAK AD-H手性柱(250mm×4.6mm，5μm)，使用該手性柱可以獲得更好的分離效果。該手性柱中的固定相為涂敷有直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的硅膠。

在一項優(yōu)選的實施方案中，所述非極性混合溶劑由低級烷烴和低級脂肪醇組成。所述低級烷烴選自正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷中的任意一種，優(yōu)選正己烷。所述低級脂肪醇選自甲醇、乙醇、異丙醇、叔丁醇中的任意一種，優(yōu)選乙醇。

在一項更優(yōu)選的實施方案中，所述非極性混合溶劑中的低級烷烴的體積百分比為90％～95％(優(yōu)選92％)，低級脂肪醇的體積百分比為5％～10％(優(yōu)選8％)。

在一項更優(yōu)選的實施方案中，除了所述低級烷烴和所述低級脂肪醇以外，所述非極性混合溶劑中還包含有機酸。所述有機酸選自甲酸、乙酸、三氟乙酸中的任意一種，優(yōu)選三氟乙酸。

在一項最優(yōu)選的實施方案中，所述非極性混合溶劑中的有機酸和其余組分(低級烷烴+低級脂肪醇)的體積比為0.1～0.5:100，優(yōu)選0.3:100。

上述分離檢測方法可以按照下列方式實施：

1)取包含沙庫必曲中間體(AHU08)及其光學異構(gòu)體的樣品適量，用流動相溶解，配制成濃度為0.5～1mg/ml(優(yōu)選0.5mg/ml)的樣品溶液；

2)設(shè)置流動相流速為0.8～1.0ml/min(優(yōu)選1.0ml/min)，色譜柱柱溫為30～35℃(優(yōu)選35℃)，紫外檢測器檢測波長為240～270nm(優(yōu)選254nm)；

3)取步驟1)中配制的樣品溶液5～20μl(優(yōu)選10μl)，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，利用面積歸一化法計算沙庫必曲中間體(AHU08)及其光學異構(gòu)體的含量，完成分離檢測過程。

本發(fā)明采用以涂敷有直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的硅膠作為固定相的手性柱(CHIRALPAK AD-H)，實現(xiàn)了簡單、快速、準確地分離檢測AHU08及其光學異構(gòu)體(雜質(zhì))；以非極性混合溶劑(正己烷/乙醇+三氟乙酸)作為流動相，確保了溶液的穩(wěn)定性；通過優(yōu)化流動相流速、色譜柱柱溫以及進樣體積等參數(shù)，提高了色譜峰的對稱性。本發(fā)明解決了含有AHU08及其光學異構(gòu)體的原料及制劑的分離檢測問題，從而確保了沙庫必曲以及含有沙庫必曲的組合物或制劑的質(zhì)量可控性。

附圖說明

圖1為實施例1中以正己烷:乙醇:三氟乙酸＝92:8:0.1(v/v/v)作為流動相的HPLC圖譜。

圖2為實施例2中以正己烷:乙醇:三氟乙酸＝92:8:0.3(v/v/v)作為流動相的HPLC圖譜。

圖3實施例3中以正己烷:乙醇:三氟乙酸＝92:8:0.5(v/v/v)作為流動相的HPLC圖譜。

具體實施方式

下面將結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明中的技術(shù)方案做出進一步的闡述。除非另有說明，下列實施例中所使用的試劑、材料及儀器均可通過常規(guī)商業(yè)手段獲得。

實施例1：AHU08及其光學異構(gòu)體的分離檢測。

儀器與條件：

高效液相色譜儀：Thermo U3000(Thermo公司)；

色譜柱：CHIRALPAK AD-H手性柱(250mm×4.6mm，5μm)(Daicel公司)；

流動相：正己烷:乙醇:三氟乙酸＝92:8:0.1(v/v/v)；

流速：1.0ml/min；

柱溫：35℃；

檢測波長：254nm；

進樣體積：10μl。

實施步驟：

稱取AHU08、Isomer1、Isomer 2、Isomer 3各2mg，置于20ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。取AHU08 10mg，精密稱定，置于20ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。

分別量取系統(tǒng)適用性溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，AHU08與其光學異構(gòu)體的分離度應(yīng)大于1.5。量取供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，采用面積歸一化法計算4種成分的含量，要求除AHU08以外的3種異構(gòu)體的含量不得大于1％，其結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，AHU08的保留時間為12.493min，Isomer1的保留時間為13.810min，Isomer2和Isomer3的保留時間為17.025min，各峰之間的分離度均大于2.0。

實施例2：AHU08及其光學異構(gòu)體的分離檢測。

儀器與條件：

高效液相色譜儀：Thermo U3000(Thermo公司)；

色譜柱：CHIRALPAK AD-H手性柱(250mm×4.6mm，5μm)(Daicel公司)

流動相：正己烷:乙醇:三氟乙酸＝92:8:0.3(v/v/v)；

流速：1.0ml/min；

柱溫：35℃；

檢測波長：254nm；

進樣體積：10μl。

實施步驟：

稱取AHU08、Isomer1、Isomer 2、Isomer 3各2mg，置于20ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。取AHU08 10mg，精密稱定，置于20ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。

分別量取系統(tǒng)適用性溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，AHU08與其光學異構(gòu)體的分離度應(yīng)大于1.5。量取供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，采用面積歸一化法計算4種成分的含量，要求除AHU08以外的3種異構(gòu)體的含量不得大于1％，其結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，AHU08的保留時間為11.183min，Isomer1的保留時間為12.238min，Isomer2和Isomer3的保留時間為15.178min，各峰之間分離度均大于2.0。

實施例3：AHU08及其光學異構(gòu)體的分離檢測。

儀器與條件：

高效液相色譜儀：Thermo U3000(Thermo公司)；

色譜柱：CHIRALPAK AD-H手性柱(250mm×4.6mm，5μm)(Daicel公司)

流動相：正己烷:乙醇:三氟乙酸＝92:8:0.5(v/v/v)；

流速：1.0ml/min；

柱溫：35℃；

檢測波長：254nm；

進樣體積：10μl。

實施步驟：

稱取AHU08、Isomer1、Isomer 2、Isomer 3各2mg，置于20ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。取AHU08 10mg，精密稱定，置于20ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。

分別量取系統(tǒng)適用性溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，AHU08與其光學異構(gòu)體的分離度應(yīng)大于1.5。量取供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，采用面積歸一化法計算4種成分的含量，要求除AHU08以外的3種異構(gòu)體的含量不得大于1％，其結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，AHU08的保留時間為10.235min，Isomer1的保留時間為11.280min，Isomer2和Isomer3的保留時間為13.913min，各峰之間分離度均大于2.0。