本發(fā)明涉及流式細(xì)胞監(jiān)測(cè)裝置技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種流式細(xì)胞儀及其三維視頻監(jiān)測(cè)裝置。

背景技術(shù)：

流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer，簡(jiǎn)稱FCM)是現(xiàn)在顯微鏡技術(shù)、化學(xué)熒光染色、電子學(xué)技術(shù)和計(jì)算機(jī)等領(lǐng)域的綜合進(jìn)步的結(jié)合下得以發(fā)展起來(lái)的對(duì)于快速直線流動(dòng)中的單細(xì)胞的特性及其成分，或其他各種微小顆粒(如細(xì)菌)及其負(fù)載物進(jìn)行多參數(shù)分析和分選的高新儀器，它不僅可測(cè)量細(xì)胞大小、內(nèi)部顆粒的形狀，還可檢測(cè)細(xì)胞表面和細(xì)胞漿抗原、細(xì)胞內(nèi)DNA以及RNA含量等，可對(duì)群體細(xì)胞在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分析。商業(yè)流式細(xì)胞儀主要包括光學(xué)系統(tǒng)、電子檢測(cè)系統(tǒng)與流動(dòng)室。

其中流動(dòng)室是整個(gè)儀器最核心的檢測(cè)載體，一般為方形或者圓形的長(zhǎng)而直的毛細(xì)管道。在該管道中，所有被檢測(cè)的顆粒及其所在樣品液，均要在二維流體聚焦力(hydrodynamic focusing)的作用下，緊密的束縛在管道中間形成單個(gè)顆粒依次通過(guò)的柱狀超細(xì)層流，其截面直徑或長(zhǎng)(寬)通常在10μm左右。細(xì)胞、微球等顆粒因此與樣品液一同被束縛在該柱狀流中，并被激光器(其光斑大小通常為20μm-80μm)在固定的位置所激發(fā)，進(jìn)而被散射光和熒光檢測(cè)系統(tǒng)所檢測(cè)和識(shí)別。

由于二維流體聚焦所形成的柱狀樣品流很細(xì)小，常規(guī)機(jī)械加工與制備工藝會(huì)引入一定的誤差(>50μm)，這些誤差導(dǎo)致不同批次生產(chǎn)、不同人員安裝出來(lái)的流動(dòng)室中聚焦樣品流的位置、穩(wěn)定程度存在一致性差異，并無(wú)法在毛細(xì)管道內(nèi)呈現(xiàn)均勻、清晰的流體分布，為儀器其他系統(tǒng)的裝配與調(diào)試過(guò)程提出了一定的考驗(yàn)。當(dāng)前圖像采集裝置為單軸，并導(dǎo)致監(jiān)測(cè)信息利用不充分，且識(shí)別效果差等技術(shù)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題，本發(fā)明目的在于提供一種流式細(xì)胞儀及其三維視頻監(jiān)測(cè)裝置，解決現(xiàn)有技術(shù)其流動(dòng)室樣品流存在不穩(wěn)定聚焦并無(wú)法在毛細(xì)管道內(nèi)呈現(xiàn)均勻、清晰的流體分布，其圖像采集裝置為單軸無(wú)法提供柱狀流的三維空間位置等技術(shù)問(wèn)題。

本發(fā)明提供了一套雙軸正交的視頻監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，從兩個(gè)空間方向上對(duì)樣品流聚焦情況進(jìn)行拍攝，并通過(guò)軟件自動(dòng)判斷其相對(duì)位置、寬度和長(zhǎng)期穩(wěn)定性，本文也提出了一套相應(yīng)的流動(dòng)室聚焦效果的測(cè)試與調(diào)試方法，以達(dá)到所有流動(dòng)室中樣品流均穩(wěn)定地聚焦在毛細(xì)管道軸心的目的。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種用于流式細(xì)胞儀的流動(dòng)室，包括毛細(xì)管道和具有倒錐體結(jié)構(gòu)的聚焦腔室，聚焦腔室的錐部連接毛細(xì)管道，連接處作為樣品液的毛細(xì)管道注入口；所述聚焦腔室還通有鞘液，鞘液通過(guò)所述聚焦腔室的內(nèi)壁在所述毛細(xì)管道注入口處與樣品液聚焦、包裹形成柱狀流。

上述方案中，所述聚焦腔室的側(cè)部或頂部平面設(shè)置有鞘液導(dǎo)入口和樣品液導(dǎo)入口。

上述方案中，所述鞘液導(dǎo)入口,其數(shù)量至少包括兩個(gè)；所述樣品液導(dǎo)入口，設(shè)置在聚焦腔室的倒錐體中軸線上，并設(shè)置一位置可調(diào)整的樣品針通過(guò)所述樣品液導(dǎo)入口導(dǎo)入所述樣品液。

一種用于流式細(xì)胞儀的監(jiān)測(cè)裝置，包括

毛細(xì)管道，通有一包含樣品液的柱狀流；

第一光源，照射毛細(xì)管道，并致使柱狀流散射光線；

第一圖像采集裝置，接收毛細(xì)管道內(nèi)柱狀流的后向散射光或側(cè)向散射光；

第二圖像采集裝置，對(duì)應(yīng)第一圖像采集裝置所接收的后向散射光或側(cè)向散射光，接收剩余的側(cè)向散射光或后向散射光。

上述方案中，所述的第二圖像采集裝置，或者接收前向散射光。

上述方案中，還包括第二光源，與所述的第一光源、第一圖像采集裝置和第二圖像采集裝置在相對(duì)于毛細(xì)管道內(nèi)柱狀流流向所垂直的平面上對(duì)應(yīng)光發(fā)射所致散射和散射光接收關(guān)系異面地或共面地呈十字形安裝結(jié)構(gòu)或X字母形安裝結(jié)構(gòu)，十字形安裝結(jié)構(gòu)或X字母形安裝結(jié)構(gòu)的中心在毛細(xì)管道中軸線上。

上述方案中，所述第二光源，通過(guò)第一光源反射、折射或分束設(shè)置得到，或者選用互補(bǔ)頻譜或有重疊頻譜的光源。

一種流式細(xì)胞儀組件，包括

流動(dòng)室，包括毛細(xì)管道和具有倒錐體結(jié)構(gòu)的聚焦腔室，向其導(dǎo)入樣品液和至少兩處導(dǎo)入鞘液并通過(guò)聚焦腔室內(nèi)壁將鞘液在毛細(xì)管道注入口處與樣品液聚焦、包裹形成柱狀流；

監(jiān)測(cè)裝置，包括第一光源、第二光源、第一圖像采集裝置和第二圖像采集裝置；

所述的第一光源、第二光源、第一圖像采集裝置和第二圖像采集裝置，在相對(duì)于毛細(xì)管道內(nèi)柱狀流流向所垂直的平面上對(duì)應(yīng)光發(fā)射所致毛細(xì)管道散射和散射光接收的位置關(guān)系異面地或共面地呈十字形安裝結(jié)構(gòu)或X字母形安裝結(jié)構(gòu)，十字形安裝結(jié)構(gòu)或X字母形安裝結(jié)構(gòu)的中心在毛細(xì)管道中軸線上。

上述方案中，所述的毛細(xì)管道選用高透明、無(wú)自發(fā)熒光、耐酸堿的材料；所述毛細(xì)管道的形狀為筆直長(zhǎng)管道，其內(nèi)截面為方形或者長(zhǎng)方形，外截面對(duì)應(yīng)內(nèi)截面為方形或者長(zhǎng)方形。

上述方案中，所述的第一圖像采集裝置和第二圖像采集裝置，均包括拍攝相機(jī)、與拍攝相機(jī)匹配的收集鏡頭，拍攝相機(jī)裝配收集鏡頭并分別安裝于一個(gè)三維調(diào)整架；所述的第一光源與第一圖像采集裝置對(duì)準(zhǔn)并構(gòu)成第一軸監(jiān)測(cè)結(jié)構(gòu)，所述的第二光源與第二圖像采集裝置對(duì)準(zhǔn)并構(gòu)成第二軸監(jiān)測(cè)結(jié)構(gòu)，第一軸監(jiān)測(cè)結(jié)構(gòu)和第二軸監(jiān)測(cè)結(jié)構(gòu)的中軸位置關(guān)系為正交。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

1.兩個(gè)鞘液從腔室頂部或者側(cè)壁直接導(dǎo)入，在樣品針周?chē)纬森h(huán)繞，并在出射的樣品流周?chē)纬啥S流體聚焦動(dòng)力，在聚焦腔室錐部壁內(nèi)，像劍鞘一樣將其樣品流包裹成柱狀流，柱狀流平滑進(jìn)入毛細(xì)管管道，并保持其原有的聚焦結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了毛線管道內(nèi)穩(wěn)定的細(xì)胞流體并且在沿毛線管道內(nèi)柱狀流流向的縱向截面上形成了清晰、容易區(qū)分的鞘流-樣品流-鞘流的流體分布；

2.每組光源和聚光鏡、收集鏡頭和拍攝相機(jī)共軸相對(duì)放置，光源和聚光鏡發(fā)出的光源穿過(guò)毛細(xì)管，照亮其核心區(qū)域，并穿過(guò)收集鏡頭匯聚到拍攝相機(jī)成像面，兩組照明和拍攝系統(tǒng)高度處于同一水平面上，并以90°正交的方式占據(jù)四個(gè)方位，形成對(duì)毛細(xì)管道的雙視角立體觀察；

3.本發(fā)明通過(guò)雙視角立體監(jiān)測(cè)結(jié)構(gòu)，還能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)效果互相補(bǔ)償，90°正交位置關(guān)系的監(jiān)測(cè)結(jié)構(gòu)能恰好互相符合側(cè)向散射接收要求，即第一光源對(duì)毛細(xì)管道的后向散射由第一圖像采集裝置接收并且其側(cè)向散射將補(bǔ)償?shù)诙D像采集裝置的采集結(jié)果，第二光源對(duì)毛細(xì)管道的后向散射由第二圖像采集裝置接收并且其側(cè)向散射將補(bǔ)償?shù)谝粓D像采集裝置的采集結(jié)果，巧妙地實(shí)現(xiàn)了額外的效果增強(qiáng)；

4.本發(fā)明在安裝時(shí)可以反饋地為對(duì)準(zhǔn)位置作出微小調(diào)整以確保實(shí)現(xiàn)雙向偏心距最小，即保持流動(dòng)室安裝后各樣品流位置的一致性，對(duì)毛細(xì)管道中聚焦所成一條圓柱狀的液流柱寬度、相對(duì)位置的進(jìn)行了自動(dòng)檢測(cè)，也能對(duì)流動(dòng)室二維流體動(dòng)力聚焦效果作出判斷、監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)，提高生產(chǎn)流動(dòng)室的良品率。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的流式細(xì)胞儀示意圖，1為流動(dòng)室的聚焦腔室，2L、2R為位于聚焦腔室側(cè)面的鞘液導(dǎo)入口，3為樣品液導(dǎo)入口，4為毛細(xì)管道；

圖2為本發(fā)明(左)流動(dòng)室安裝關(guān)系、(中)聚焦樣品流與毛細(xì)管道的位置關(guān)系、(右)毛細(xì)管道橫截面的示意圖；

圖3為本發(fā)明三維視頻監(jiān)測(cè)結(jié)構(gòu)俯視圖；

圖4為本發(fā)明三維視頻監(jiān)測(cè)軟件分析系統(tǒng)示例圖，(左上)為第一圖像采集裝置所得圖像的識(shí)別結(jié)果、(右上)為第二圖像采集裝置所得圖像的識(shí)別結(jié)果、(左下)為聚焦空間位置的識(shí)別結(jié)果、(右下)為各參數(shù)計(jì)算數(shù)值；

圖5為本發(fā)明視頻分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)示例圖；

圖6為流動(dòng)室安裝調(diào)配流程圖。

具體實(shí)施方式

本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的所有特征，或公開(kāi)的所有方法或過(guò)程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明：

實(shí)施例

本發(fā)明提供了一種用于流動(dòng)室裝配的三維視頻監(jiān)測(cè)裝置及其識(shí)別方法，可完成對(duì)毛細(xì)管道中聚焦成一條圓柱狀的液流柱寬度、相對(duì)位置的自動(dòng)檢測(cè)，該裝置主要用于流式細(xì)胞儀核心組件，即流動(dòng)室的二維流體動(dòng)力聚焦效果的判斷、監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)，并為其安裝時(shí)位置的微小調(diào)整提供參考依據(jù)。

整個(gè)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)包括兩套光源、聚焦鏡、收集鏡頭、拍攝相機(jī)和三維調(diào)整架，其中光源和聚光鏡組合配套使用，用于形成直徑略大于毛細(xì)管道外徑的準(zhǔn)直光斑，并照亮其管道中央部分；收集鏡頭和拍攝相機(jī)配套使用，用于對(duì)毛細(xì)管的管道中的液流情況進(jìn)行成像記錄，其視場(chǎng)略大于毛細(xì)管道的內(nèi)徑；收集鏡頭和拍攝相機(jī)擰緊裝配后安裝在三維調(diào)整架上，用于視頻檢測(cè)的空間位置調(diào)整。

如圖3，每組光源和聚光鏡、收集鏡頭和拍攝相機(jī)共軸相對(duì)放置，光源和聚光鏡發(fā)出的光源穿過(guò)毛細(xì)管，照亮其核心區(qū)域，并穿過(guò)收集鏡頭匯聚到拍攝相機(jī)成像面。兩組照明和拍攝系統(tǒng)高度處于同一水平面上，并以90°正交的方式占據(jù)四個(gè)方位，形成對(duì)毛細(xì)管道的雙視角立體觀察。三維調(diào)整架用于實(shí)施照明光路和收集光路的對(duì)準(zhǔn)，并提供上下調(diào)節(jié)的自由度，用于實(shí)現(xiàn)對(duì)毛細(xì)管道不同高度位置的追蹤監(jiān)測(cè)。

如圖2，本發(fā)明中核心觀察與檢測(cè)對(duì)象為毛細(xì)管內(nèi)管道及其流體，更具體為在毛細(xì)管道中聚焦成一條細(xì)柱狀流的樣品流，以及其相對(duì)于毛細(xì)管道內(nèi)壁的空間位置。該毛細(xì)管道優(yōu)先由玻璃、石英等高透明、無(wú)自發(fā)熒光、耐酸耐堿等材料構(gòu)成，毛細(xì)管道為筆直長(zhǎng)管道，其內(nèi)截面可以為方形或者長(zhǎng)方形，外截面可以為相應(yīng)的方形或者長(zhǎng)方形。

如圖1，該毛細(xì)管道入口安裝到聚焦腔室出口上，上下整體構(gòu)成流動(dòng)室。聚焦腔室為倒錐體結(jié)構(gòu)，除了在錐頂?shù)脑摮隹谕猓陧敳科矫孢€有三個(gè)入口，包括兩個(gè)鞘液入口、一個(gè)樣品液入口。其中樣品液由樣品針導(dǎo)入，其針尖伸出延長(zhǎng)到聚焦腔室中間位置，該樣品針應(yīng)位于聚焦腔室的軸心。兩個(gè)鞘液從腔室頂部平面或者側(cè)壁直接導(dǎo)入，在樣品針周?chē)纬森h(huán)繞，并在出射的樣品流周?chē)纬啥S流體聚焦動(dòng)力。在聚焦腔室錐部出口，像劍鞘一樣將其樣品流包裹成柱狀流。最后，這些流體平滑進(jìn)入毛細(xì)管管道，并保持其原有的聚焦結(jié)構(gòu)。

在所述特征中，樣品柱狀流相對(duì)毛細(xì)管道壁的位置，取決于樣品針的安裝角度和位置，本視頻監(jiān)測(cè)的結(jié)果可為其微小調(diào)整提供依據(jù)。

所述視頻監(jiān)測(cè)是指雙軸相機(jī)拍攝到毛細(xì)管管道內(nèi)流體的狀態(tài)，并由軟件識(shí)別系統(tǒng)自動(dòng)識(shí)別出對(duì)應(yīng)信息，實(shí)時(shí)定量給出判讀結(jié)果、并記錄的過(guò)程。對(duì)每一套成像系統(tǒng)而言，所述軟件識(shí)別包括：成像質(zhì)量是否清晰，毛細(xì)管管道是否在視頻中，毛細(xì)管內(nèi)壁左右邊界的識(shí)別，樣品流左右邊界的識(shí)別。通過(guò)這四條邊界的識(shí)別和位置記錄，可計(jì)算得到樣品流寬度、聚焦液流柱的中心位置距離毛細(xì)管左右內(nèi)壁的距離，樣品流中心線和毛細(xì)管內(nèi)壁中心的偏心距等信息。將正交的雙視頻匯總，得到橫向多參數(shù)，側(cè)向多參數(shù)的信息，畫(huà)出聚焦樣品流在毛細(xì)管道橫截面上的二維坐標(biāo)測(cè)繪圖，如圖4所示。用于評(píng)價(jià)流動(dòng)室的工作狀態(tài)是否正常，并通過(guò)調(diào)整樣品針的位置，得到雙向偏心距最小的目的。

這些數(shù)據(jù)還可進(jìn)行最大值、最小值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差，變異系數(shù)等單參數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，也可以進(jìn)行前向與側(cè)向比例的關(guān)聯(lián)性分析。通過(guò)該視頻監(jiān)測(cè)裝置，還可長(zhǎng)時(shí)間記錄流動(dòng)聚焦的相對(duì)位置、寬度等參數(shù)信息，進(jìn)行鞘流穩(wěn)定時(shí)間、寬度變化幅度、位置變化幅度等指標(biāo)的評(píng)價(jià)，如圖5所示。對(duì)各個(gè)裝配好的流式室進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，幫助提高出廠產(chǎn)品的良品率。

所示特征中，收集鏡頭，包括多個(gè)凸透鏡，且用于將毛細(xì)管內(nèi)壁邊緣和內(nèi)壁中運(yùn)動(dòng)流體在產(chǎn)生的像放大為適合拍攝相機(jī)感光面大小的實(shí)像。所述收集鏡頭包括可以包括第一凸鏡、第二凸鏡和第三凸鏡，第二凸鏡位于第一凸鏡和第三凸鏡之間，所述凸鏡可以為石英玻璃。

本發(fā)明所述的，收集鏡頭及相機(jī)調(diào)整架具備三維調(diào)整自由度，首先可分別在水平面二維調(diào)整以使得照明和成像部分共軸，其次還可同時(shí)在高度方向上進(jìn)行調(diào)整，對(duì)毛細(xì)管道不同高度進(jìn)行檢測(cè)，得到不同高度位置處的二維信息測(cè)繪圖。

本發(fā)明所述的，流動(dòng)室還可繞毛細(xì)管軸心進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)，對(duì)不同視角情況下樣品流聚焦特性的檢測(cè)。在每個(gè)角度下由正交雙檢測(cè)系統(tǒng)記錄兩組數(shù)值，通過(guò)180°旋轉(zhuǎn)加自動(dòng)識(shí)別描繪，可以得到樣品流360°度的真實(shí)聚焦情況。

具體實(shí)施方式中，毛細(xì)管可采用內(nèi)徑200μm外徑8mm的方形石英玻璃，視頻采集相機(jī)可采用640*480像素的1/2英寸的CCD相機(jī)，收集鏡頭可采用17X長(zhǎng)焦鏡頭，整體的空間分辨率為0.925μm，采集頻率為60fps。

一種實(shí)施例中，流動(dòng)室的裝配流程可以如下：

S1：對(duì)流動(dòng)室部件進(jìn)行預(yù)裝配，并連接上外部管路，用0.1M氫氧化鈉溶液、清洗液交替清洗兩次流動(dòng)室，去除殘留雜質(zhì)；

S2：鞘液管道通入鞘液，樣品管道通入校準(zhǔn)溶液，在測(cè)試進(jìn)樣比例下，形成柱狀鞘流。在本三維監(jiān)測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行分析；

S3：由視頻軟件分析，得到樣品流在前向與側(cè)向的偏心距；對(duì)進(jìn)樣針兩軸位置進(jìn)行微調(diào)，直至兩個(gè)方向偏心距為零；

S4：分析樣品流，得到前向與側(cè)向的寬度，并與標(biāo)準(zhǔn)值比對(duì)；長(zhǎng)期連續(xù)監(jiān)測(cè)樣品流的寬度與偏心距信息，得到穩(wěn)定性評(píng)價(jià)；

所述校準(zhǔn)溶液可以為各類(lèi)高吸光、有色溶液，包含但不限于甲基藍(lán)、亞甲基藍(lán)、洋紅、羅丹明、結(jié)晶紫等溶液。

另外，需要說(shuō)明的是，光源、聚焦鏡、收集鏡頭及相機(jī)的參數(shù)比較靈活，本領(lǐng)域人員可以根據(jù)實(shí)際選定，非本發(fā)明的關(guān)鍵參數(shù)。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何屬于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。