本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種快速評(píng)價(jià)微藻對(duì)高濃度二氧化碳耐受力的方法，涉及一種應(yīng)用于評(píng)估微藻二氧化碳耐受力的裝置，同時(shí)還涉及應(yīng)用于微藻快速擴(kuò)培的小型光生物反應(yīng)器裝置，尤其適合于篩選具有規(guī)模化生產(chǎn)潛質(zhì)的可利用煙道尾氣進(jìn)行培養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)微藻。

背景技術(shù)：

微藻是原核或者真核的光合微生物，是非常高效的太陽(yáng)能轉(zhuǎn)換器，分布于淡水或者咸水中，通過(guò)吸收水環(huán)境傳遞的光能、水和二氧化碳及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累生物量，可以將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，積累可被人類利用的代謝物或次生代謝物，如初級(jí)代謝物有油脂、蛋白質(zhì)及多糖；以及次生代謝物有蝦青素、藻藍(lán)蛋白、類胡蘿卜素等高價(jià)值活性物質(zhì)。其次，微藻可以固定二氧化碳，減少溫室氣體排放，降低環(huán)境污染。因而，耐受且能在高濃度二氧化碳條件下生長(zhǎng)的微藻可以利用工業(yè)煙道尾氣、燃煤及生物質(zhì)電廠尾氣進(jìn)行生長(zhǎng)，從而降低微藻培養(yǎng)的生產(chǎn)成本，不僅達(dá)到二氧化碳減排的目的，而且具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益及環(huán)境效益，從而使得微藻培養(yǎng)和資源化研究得到國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的關(guān)注。

目前，已經(jīng)公開(kāi)的關(guān)于微藻固定二氧化碳的專利文獻(xiàn)大多數(shù)集中在：

(1)種源：如通過(guò)誘變育種，篩選出耐高濃度二氧化碳(10～30％)的微藻，對(duì)該藻株進(jìn)行培養(yǎng)4天，其最終生物量可達(dá)1.3g·L^-1，其生物量產(chǎn)率約為0.3g·L^-1·d^-1(C12N1/12(2006.01)I)；此外，也有開(kāi)發(fā)一株凸頭柵藻，一天之內(nèi)每升藻液最多可去除0.88mg的二氧化碳，與此同時(shí)，該藻能耐受氧化硫與氮氧化物，但未提及藻株對(duì)其的耐受濃度(C12N1/12(2006.01)I)；

(2)優(yōu)化微藻減排二氧化碳的產(chǎn)業(yè)鏈中的關(guān)鍵技術(shù)，包括如對(duì)工業(yè)尾氣進(jìn)行除塵洗滌、加壓、調(diào)氣等裝置(B01D53/84(2006.01)I)；此外一種利用微藻清潔工業(yè)廢氣中二氧化碳的裝置和方法也見(jiàn)報(bào)道，其特征在于耦合培養(yǎng)液循環(huán)系統(tǒng)和廢水處理裝置，用經(jīng)培養(yǎng)液循環(huán)系統(tǒng)處理后的工業(yè)廢水作為培養(yǎng)溶液，選用耐熱性的小球藻進(jìn)行培養(yǎng)(B01D53/84(2006.01)I)；另外，也有報(bào)道利用高pH誘導(dǎo)藻液發(fā)生自沉降后，收獲后的高pH的上清液能高效吸收酸性二氧化碳，并調(diào)節(jié)該上清培養(yǎng)液至適合微藻生長(zhǎng)的水平(pH≥8.2)，實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基的高效補(bǔ)碳，保障采收后的上清液的循環(huán)利用(C12N1/12(2006.01)I)。

(3)在大規(guī)模培養(yǎng)體系(跑道式培養(yǎng)池和環(huán)形培養(yǎng)池)下添加二氧化碳并提高對(duì)其利用率的裝置，如微藻養(yǎng)殖池有效補(bǔ)充二氧化碳的充氣凹槽，并提高藻液對(duì)二氧化碳的吸收率(C12N1/12(2006.01)I)；此外也有直接將二氧化碳直接溶入水中，將二氧化碳飽和水直接添加入藻液中(C12N 1/12(2006.01))；也有發(fā)明一種帶壓力表的二氧化碳溶解裝置，對(duì)二氧化碳?xì)怏w進(jìn)行加壓處理至0.1～1.0MPa通入二氧化碳溶解裝置，通過(guò)監(jiān)測(cè)溶液pH值(6.0～8.5)以確定二氧化碳是否充分溶解至回流培養(yǎng)液中，在其實(shí)施于螺旋藻培養(yǎng)的案例中，減少70～90％的NaHCO₃用量，二氧化碳固定率為163～178mg·L^-1·h^-1(C12N 1/12(2006.01))。另外，也有報(bào)道一種濃縮回收空氣中的二氧化碳用于微藻培養(yǎng)的裝置，在電壓作用下，電動(dòng)濃縮裝置的陽(yáng)極室和陰極室分別電動(dòng)產(chǎn)生H⁺和OH^-?？諝庵械亩趸歼M(jìn)入陰極室轉(zhuǎn)化為HCO₃^-以及CO₃^2-形式，并在電遷移作用下透過(guò)陰離子交換膜進(jìn)入陽(yáng)極室，在陽(yáng)極室內(nèi)獲得高濃度CO₂氣體；被濃縮的CO₂用于微藻的培養(yǎng)(C12M1/04(2006.01)I)。

從以往的報(bào)道可以發(fā)現(xiàn)，目前鮮有報(bào)道微藻耐受高濃度二氧化碳能力的快速評(píng)價(jià)裝置，而優(yōu)質(zhì)的耐受高濃度二氧化碳的微藻種源是微藻在煙道尾氣等減排產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用基礎(chǔ)。因此，針對(duì)微藻在固定煙道尾氣方面的應(yīng)用，需要對(duì)眾多保藏的微藻進(jìn)行二氧化碳耐受性的篩選及普查。然而，目前而言，較多的評(píng)價(jià)流程是在三角瓶、或者柱狀光生物反應(yīng)器培養(yǎng)微藻，通過(guò)取樣，比較吸光值評(píng)價(jià)微藻的生長(zhǎng)性能(C12N1/12(2006.01)I，C12Q1/04(2006.01)I)，而三角瓶和柱狀光生物反應(yīng)器體積較大不適宜用于大批量的藻株篩選，取樣工作對(duì)于批量藻株而言需投入大量的人力與物力。因此，本發(fā)明構(gòu)建二氧化碳培養(yǎng)缸，對(duì)培養(yǎng)缸中的二氧化碳濃度進(jìn)行追蹤檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)通氣和二氧化碳濃度穩(wěn)定，簡(jiǎn)易高效、光照透過(guò)性優(yōu)良；本發(fā)明使用十二孔板培養(yǎng)微藻，無(wú)須取樣，即可原位追蹤微藻生長(zhǎng)趨勢(shì)；并通過(guò)在小型光生物反應(yīng)器培養(yǎng)，比較發(fā)現(xiàn)兩種培養(yǎng)體系下藻株的生長(zhǎng)及對(duì)高濃度二氧化碳的耐受力趨勢(shì)一致，表明本發(fā)明基于十二孔板實(shí)驗(yàn)可表征不同藻株對(duì)高濃度二氧化碳的耐受力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在于提供了一種應(yīng)用于評(píng)估微藻二氧化碳耐受力的方法，本發(fā)明引入相對(duì)光密度變化率(deltaOD·d^-1)，見(jiàn)公式1)，該參數(shù)可有效地用于評(píng)價(jià)目標(biāo)藻株對(duì)高濃度二氧化碳的耐受力，而光密度變化率(OD·d^-1)用于評(píng)價(jià)目標(biāo)藻株在高濃度二氧化碳條件下的生長(zhǎng)力。同樣，經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明還可應(yīng)用于快速評(píng)價(jià)經(jīng)濟(jì)微藻在高低溫、酸堿等環(huán)境的生長(zhǎng)力和耐受力。本發(fā)明已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室條件下被較為成熟地應(yīng)用于優(yōu)良藻株篩選，平均每天人均可以評(píng)價(jià)2-3株微藻的生長(zhǎng)，較現(xiàn)行的光合生物反應(yīng)器下評(píng)價(jià)方法而言，該方法簡(jiǎn)單易行，操作簡(jiǎn)單，快速便捷。該方法同樣可以用于篩選耐受高濃度二氧化碳的優(yōu)良藻株。以光密度變化率(OD·d^-1)及相對(duì)光密度變化率(deltaOD·d^-1)兩個(gè)參數(shù)確定藻株在散點(diǎn)圖中的分布，對(duì)比后，可以篩選出既能耐受高濃度二氧化碳，且能在高濃度二氧化碳補(bǔ)給下快速生長(zhǎng)的優(yōu)良藻株。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是在于提供了一種應(yīng)用于評(píng)估微藻二氧化碳耐受力的裝置，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，使用方便，可設(shè)定既定的二氧化碳濃度，使用十二孔板培養(yǎng)微藻，可原位追蹤并評(píng)價(jià)經(jīng)濟(jì)微藻在高濃度二氧化碳環(huán)境的生長(zhǎng)力和耐受力等重要性能，補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)比較三株微藻在本發(fā)明裝置和小型光生物反應(yīng)器在高濃度二氧化碳條件下的生長(zhǎng)力及耐受力，結(jié)果顯示三株微藻在同等條件下的生長(zhǎng)及耐受力趨勢(shì)保持一致，結(jié)合上述的散點(diǎn)分布圖可以篩選出優(yōu)良的藻株，準(zhǔn)確率可以達(dá)到85％以上。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種小型的微藻快速活化及擴(kuò)培的裝置，該裝置結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，主要由培養(yǎng)部件和通氣部件兩個(gè)部分組成，操作方法與傳統(tǒng)的光合生物反應(yīng)器一致，優(yōu)點(diǎn)在于小體積培養(yǎng)，通氣穩(wěn)定可控，可應(yīng)用于大批量的藻株生長(zhǎng)性能評(píng)價(jià)及藻株生長(zhǎng)參數(shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

一種用于評(píng)估微藻二氧化碳耐受力的方法，其步驟是：

A、培養(yǎng)基配制。培養(yǎng)基依據(jù)目標(biāo)藻株而定，所述的藻株包括涵蓋隸屬綠藻門(mén)的小球藻、柵藻、集星藻、纖維藻、球空星藻、葡萄鼓藻、實(shí)球藻、蹄形藻、集球藻、盤(pán)星藻、原球藻、并聯(lián)藻、月芽藻、紅球藻等；藍(lán)藻門(mén)的聚球藻、集胞藻；硅藻門(mén)的小環(huán)藻、脆桿藻、窄異極藻、菱板藻、舟形藻、菱形藻、舟形藻、三角褐指藻、針桿藻、直鏈藻等。所述的培養(yǎng)基具體有BG-11，SP，DM，SE，CSI等類型?；诳装宓亩趸寄褪苄詫?shí)驗(yàn)所使用的培養(yǎng)基為無(wú)碳培養(yǎng)基(即上述培養(yǎng)基去除無(wú)機(jī)或有機(jī)碳源)。

B、目標(biāo)藻株活化擴(kuò)種。對(duì)配制好的全培養(yǎng)基進(jìn)行高溫121℃，30min滅菌。之后在超凈工作臺(tái)將上述全培養(yǎng)基分裝至小型光生物反應(yīng)器裝置(圖1)(裝液體積約為60mL)，緊接著往上述光生物反應(yīng)器接入目標(biāo)藻種(固體平板上刮取1～5個(gè)克隆接入培養(yǎng)基，或者從液體種子中轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基)進(jìn)行擴(kuò)培，培養(yǎng)條件為，光照強(qiáng)度為50～60μmol·m^-2·s^-1，溫度控制在24-26℃，通氣培養(yǎng)約7～10天。

C、目標(biāo)藻株接種及OD₆₈₀檢測(cè)。檢測(cè)擴(kuò)種7～10天后的藻液OD₆₈₀(C₁)以決定接種量V₁(見(jiàn)公式2)。確定接種量V₁之后對(duì)藻液進(jìn)行離心(3000×g，5min)，反復(fù)(2－5次)上述(步驟A)無(wú)碳培養(yǎng)基洗凈后重懸，接入十二孔板，每株藻株接入OD₆₈₀濃度C₂約為0.2～0.3左右，每孔接入體積為3mL，共計(jì)三個(gè)平行。而后將十二孔板(圖2)放置在培養(yǎng)缸中靜置培養(yǎng)(不敞蓋)，培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度為30～40μmol·m^-2·s^-1，溫度控制在24-26℃，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)缸二氧化碳濃度(二氧化碳體積占比氣體總體積，下同)分別為1～20％和0.03％(注：培養(yǎng)缸的目的是篩選耐高濃度二氧化碳的藻株，因此，可設(shè)定二氧化碳的濃度為1～20％，對(duì)照組為空氣組，即0.03％)。

D、OD₆₈₀檢測(cè)：檢測(cè)OD₆₈₀之前，使用一次性吸管(無(wú)菌)對(duì)藻液進(jìn)行重懸直至藻液均勻，使用酶標(biāo)儀(多功能酶標(biāo)儀SpectraMaxM3，Molecular Devices,美國(guó))對(duì)十二孔板中的藻液OD₆₈₀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)吸光度波長(zhǎng)為680nm。

E、目標(biāo)藻株在1～20％CO₂(二氧化碳體積占比氣體總體積)的生長(zhǎng)力及耐受力評(píng)價(jià)。追蹤OD₆₈₀變化曲線，以O(shè)D·d^-1代表設(shè)定條件下的生長(zhǎng)力，以1～20％CO₂條件下的光密度變化率與空氣下的光密度變化率差值(deltaOD·d^-1)代表目標(biāo)藻株對(duì)高濃度二氧化碳的耐受力。

F、優(yōu)良藻株篩選：散點(diǎn)作圖法，依據(jù)以O(shè)D·d^-1及deltaOD·d^-1兩個(gè)參數(shù)確定藻株在散點(diǎn)圖中的分布，對(duì)比后，可以篩選出既能耐受高濃度二氧化碳，且能在高濃度二氧化碳補(bǔ)給下快速生長(zhǎng)的優(yōu)良藻株。

公式1：deltaOD·d^-1＝(OD·d^-1)_1～20％CO2-(OD·d^-1)_air

公式2：

其中：deltaOD·d^-1，為1～20％二氧化碳(CO₂)條件下的光密度變化率與空氣下的光密度變化率差值，代表目標(biāo)藻株對(duì)高濃度二氧化碳的耐受力；OD·d^-1為高濃度二氧化碳組(1～20％CO₂)和空氣組(air)的光密度變化率，代表目標(biāo)藻株在高濃度二氧化碳組(1～20％CO₂)和空氣組(air)的生長(zhǎng)力；CO₂代表二氧化碳；二氧化碳占比氣體總體積的1～20％；V₁為接入十二孔板所需的活化擴(kuò)培后原藻液的體積(單位，mL)；C₂為十二孔板的藻液光密度；C₁為活化擴(kuò)培7～10天后的原藻液光密度；mL為藻液體積單位(毫升)；air為空氣組，二氧化碳體積占比氣體總體積的0.03％。

在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用該方法篩選出deltaOD·d^-1＞0.3d^-1的優(yōu)良藻株(即該藻株基于本裝置10％CO₂和空氣條件下的光密度變化率差值大于0.3d^-1)，應(yīng)用于戶外600L的管道光生物反應(yīng)器的中試規(guī)模，分別通入二氧化碳濃度為3-5％的生物質(zhì)電廠煙道尾氣和空氣組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩條件下的單位時(shí)間單位體積生物量產(chǎn)率分別為0.2和0.025g·L^-1·d^-1，培養(yǎng)十天之后分別可收獲約0.5和0.1kg干藻粉，說(shuō)明本發(fā)明可篩選出耐受高濃度二氧化碳的優(yōu)良藻株，并能成功應(yīng)用于煙道尾氣減排。

一種應(yīng)用于評(píng)估微藻二氧化碳耐受力的裝置，它由LED燈管、出氣口、進(jìn)氣口、透光培養(yǎng)缸、透光孔板、保濕波浪海綿、培養(yǎng)缸上方開(kāi)口、透光玻璃蓋組成，其特征在于：透光培養(yǎng)缸分別與透光玻璃蓋、LED燈管相連，透光培養(yǎng)缸左右兩側(cè)分別開(kāi)有進(jìn)氣口和出氣口，并在透光培養(yǎng)缸內(nèi)部與保濕波浪海綿6連接，保濕波浪海綿與透光孔板連接。該透光培養(yǎng)缸長(zhǎng)為85～100cm，寬為30～50cm，高為20～40cm，透光玻璃蓋及下方透光且上部有培養(yǎng)缸上方開(kāi)口(適當(dāng))，設(shè)置在透光培養(yǎng)缸上方的可控式LED燈管，設(shè)置在透光培養(yǎng)缸底部的可吸水保濕波浪海綿，以及設(shè)置在左側(cè)右下方的進(jìn)氣口和右側(cè)左上方的出氣口，實(shí)驗(yàn)用的透光孔板。透光培養(yǎng)缸為立方形，材質(zhì)為鈉鈣硅酸鹽玻璃，厚度為3-4cm，透光率不低于86％，表面平滑，在透光培養(yǎng)缸右側(cè)左上方和左側(cè)右下方分別開(kāi)一個(gè)直徑約為0.5-1cm的出氣口和進(jìn)氣口，對(duì)于二氧化碳培養(yǎng)缸而言，出氣口與進(jìn)氣口的設(shè)置，應(yīng)位于左右兩側(cè)的對(duì)角線位置，由于二氧化碳密度較空氣大(在標(biāo)準(zhǔn)狀況下，空氣的平均密度為1.294g·L^-1，二氧化碳的為1.429g·L^-1)，因此須保證出氣口在上，進(jìn)氣口在下，(空氣培養(yǎng)缸則無(wú)需嚴(yán)格要求出氣口和進(jìn)氣口的上下位置關(guān)系)，且孔徑不宜超過(guò)1cm，這樣可以使培養(yǎng)缸內(nèi)的二氧化碳濃度保持穩(wěn)定，培養(yǎng)缸上方開(kāi)口有一個(gè)直徑10-15cm的圓形孔，在上端圓形孔區(qū)域加蓋一個(gè)邊長(zhǎng)20-30cm的透光玻璃蓋，蓋上透光玻璃蓋之后通氣須保證密封性良好，通氣導(dǎo)管為硅膠管，在通氣導(dǎo)管上部接入過(guò)濾器，過(guò)濾器為35～50mm的針頭式過(guò)濾器，內(nèi)部為孔徑0.2～0.65μm的混合纖維酯微孔濾膜，該部件為微藻提供一個(gè)穩(wěn)定的氣體環(huán)境。透光培養(yǎng)缸底部放置波浪型吸水保濕海綿，材質(zhì)為聚氨酯，具有高吸水及高回彈性能，設(shè)置可以保證透光培養(yǎng)缸內(nèi)的濕度，有效防止孔板中的藻液蒸發(fā)。此外，透光培養(yǎng)缸上安置LED燈管，可保證孔板表面接受到的光照強(qiáng)度在40～60μmol·m^-2·s^-1。

一種應(yīng)用于微藻快速擴(kuò)培的小型光生物反應(yīng)器裝置，它由過(guò)濾器、通氣導(dǎo)管、六通式氣體分流裝置、打孔膠塞、玻璃管、透光玻璃管、六孔架子組成。其特征在于：透光玻璃管分別與打孔膠塞和六孔架子連接，打孔膠塞與玻璃管連接，玻璃管與通氣導(dǎo)管連接，六通式氣體分流裝置上端和下端與通氣導(dǎo)管連接，六通式氣體分流裝置上的通氣導(dǎo)管連接過(guò)濾器。過(guò)濾器包括100ml透光玻璃管，還包括設(shè)置在透光玻璃管瓶口的打孔膠塞、設(shè)置在透光玻璃管內(nèi)部的通氣玻璃管、穩(wěn)定透光玻璃管的六孔架子、上部的六通式氣體分流裝置以及通氣導(dǎo)管。透光玻璃管為圓柱形，材質(zhì)為樹(shù)脂玻璃，直徑約3～5cm，高度為10～20cm，高度與直徑的比值為4～7之間，玻璃厚度為0.2～0.3cm，透光玻璃管共6個(gè)。每個(gè)透光玻璃管連接著打孔膠塞，并安置在六孔架子上，構(gòu)成微藻的培養(yǎng)部件。每個(gè)打孔膠塞連接著上口接通氣導(dǎo)管的通氣玻璃管，通氣導(dǎo)管相應(yīng)對(duì)接六通式氣體分流裝置的通氣閥門(mén)，六通式氣體分流裝置上接通氣導(dǎo)管，通氣導(dǎo)管上接過(guò)濾器，通氣導(dǎo)管為硅膠管，上部接入過(guò)濾器為35～50mm的針頭式過(guò)濾器，內(nèi)部為孔徑0.2～0.65μm的混合纖維酯微孔濾膜。該通氣裝置為穩(wěn)定性的可控式六通通氣裝置，材質(zhì)為不銹鋼，可控裝置為把手式開(kāi)關(guān)，通氣量大小可控，構(gòu)成微藻培養(yǎng)的通氣部件。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和顯著地效果：

基于十二孔板對(duì)藻株高濃度二氧化碳耐受力的評(píng)價(jià)方法，效率高，操作方便，可以原位檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，設(shè)備簡(jiǎn)單，安全可靠，可評(píng)價(jià)經(jīng)濟(jì)微藻在高濃度二氧化碳環(huán)境的生長(zhǎng)力和耐受力等重要性能；此外，補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)比較三株微藻在該發(fā)明裝置和小型光生物反應(yīng)器在高濃度二氧化碳條件下的生長(zhǎng)力及耐受力，結(jié)果顯示三株微藻在同等條件下的生長(zhǎng)及耐受力趨勢(shì)保持一致，進(jìn)一步表明基于十二孔板實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)藻株生長(zhǎng)及耐受力的有效性。此外，結(jié)合上述的散點(diǎn)分布圖可用于大批量篩選耐受高濃度二氧化碳的優(yōu)良藻株，準(zhǔn)確率可以達(dá)到85％以上。該發(fā)明適用于大批量藻株對(duì)高濃度二氧化碳耐受力的評(píng)價(jià)工作之外，對(duì)于評(píng)估藻株耐受酸性、堿性、高溫、低溫的能力，該方法也同樣適宜。

附圖說(shuō)明

圖1為一種微藻快速擴(kuò)培的小型光生物反應(yīng)器裝置結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為一種二氧化碳培養(yǎng)缸三維示意圖。

圖3A為圖2中培養(yǎng)缸的前視圖。

圖3B為圖2中培養(yǎng)缸的左和右視圖。

圖3C為圖2中培養(yǎng)缸的俯視圖。

圖3D為本發(fā)明中使用的十二孔板解剖圖。

其中：1－LED燈管、2－出氣口、3－進(jìn)氣口、4－透光培養(yǎng)缸、5－透光孔板、6－保濕波浪海綿、7－培養(yǎng)缸上方開(kāi)口、8－透光玻璃蓋、9－過(guò)濾器(SLGP033RS，Millipore)、10－通氣導(dǎo)管、11－六通式氣體分流裝置(8轉(zhuǎn)4MM不銹鋼六頭，DIY)、12－打孔膠塞、13－玻璃管、14－透光玻璃管、15－六孔架子。

圖4為小型柱狀光生物反應(yīng)器與十二孔板對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果分布圖。

其中，目標(biāo)藻株(編號(hào)為1,2,3)分別在十二孔板和100mL柱狀光生物反應(yīng)器的10％CO₂的耐受實(shí)驗(yàn)。deltaOD·d^-1用于評(píng)價(jià)目標(biāo)藻株對(duì)10％CO₂的耐受力，而OD·d^-1用于評(píng)價(jià)目標(biāo)藻株在10％CO₂的生長(zhǎng)力，結(jié)合散點(diǎn)圖可以用于大批量篩選耐受高濃度二氧化碳的優(yōu)良藻株。結(jié)果顯示，十二孔板和100mL柱狀光生物反應(yīng)器的實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映兩體系下藻株生長(zhǎng)狀況趨勢(shì)一致，利用散點(diǎn)圖可以獲得耐受力及生長(zhǎng)力最佳的編號(hào)為3的藻株，進(jìn)一步表明基于十二孔板實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)和篩選藻株耐受力的有效性。

具體實(shí)施方式

該方法適合所有微藻中單細(xì)胞微藻的高濃度二氧化碳濃度的耐受力評(píng)價(jià)，優(yōu)先可以應(yīng)用于藻液均勻的微藻。本文以小球藻為例，說(shuō)明該方法的具體實(shí)施步驟，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明所述技術(shù)方案，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域中的常規(guī)方案，所用原料均為市場(chǎng)流通的商品。

實(shí)施例1：

一種用于評(píng)價(jià)藻株對(duì)高濃度二氧化碳的耐受力的方法，以CO₂濃度為10％(二氧化碳體積占比氣體體積)為例，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制，本方法可以應(yīng)用于二氧化碳濃度到1～20％之間。其步驟是：

一、培養(yǎng)基配制：

實(shí)驗(yàn)所用的擴(kuò)種培養(yǎng)基均為常規(guī)培養(yǎng)基，如小球藻、柵藻等的培養(yǎng)基為BG-11，而基于孔板的二氧化碳耐受性實(shí)驗(yàn)而言培養(yǎng)基為無(wú)碳培養(yǎng)基，即BG-11不添加Na₂CO₃。本實(shí)施案例以小球藻為例，其擴(kuò)種培養(yǎng)基的組分如下：

表1擴(kuò)種用的BG-11培養(yǎng)基組分

*配方如表2所示。

表2Trace metal mix A5的營(yíng)養(yǎng)成分及濃度

培養(yǎng)基依據(jù)目標(biāo)藻株而定，所述的藻株包括涵蓋隸屬綠藻門(mén)的小球藻、柵藻、集星藻、纖維藻、球空星藻、葡萄鼓藻、實(shí)球藻、蹄形藻、集球藻、盤(pán)星藻、原球藻、并聯(lián)藻、月芽藻、紅球藻等；藍(lán)藻門(mén)的聚球藻、集胞藻；硅藻門(mén)的小環(huán)藻、脆桿藻、窄異極藻、菱板藻、舟形藻、菱形藻、舟形藻、三角褐指藻、針桿藻、直鏈藻等。所述的培養(yǎng)基具體有BG-11，SP，DM，SE，CSI等類型。

二、目標(biāo)藻株活化擴(kuò)種：

對(duì)配制好的全培養(yǎng)基(步驟一)進(jìn)行高溫121℃，30min滅菌。之后在超凈工作臺(tái)將上述全培養(yǎng)基分裝至小型光生物反應(yīng)器裝置(圖4)(裝液體積約為60mL)，緊接著往上述光生物反應(yīng)器接入目標(biāo)藻種(固體平板上刮取少量克隆接入培養(yǎng)基，或者從液體種子中轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基)進(jìn)行擴(kuò)培，培養(yǎng)條件為，光照強(qiáng)度為50μmol·m^-2·s^-1，溫度控制在24或25或26℃，通氣培養(yǎng)7或8或9或10天。

三、目標(biāo)藻株接種及OD₆₈₀檢測(cè)：

檢測(cè)擴(kuò)種7或8或9或10天后的藻液OD₆₈₀(C₁)以決定接種量V₁(見(jiàn)公式2)。確定接種量V₁之后對(duì)藻液進(jìn)行離心(2000～3000×g，3～7min)，反復(fù)3次使用的無(wú)碳培養(yǎng)基(步驟一)洗凈后重懸，接入十二孔板，每株藻株接入OD₆₈₀濃度C₂約為0.3左右，每孔接入體積為3mL，共計(jì)三個(gè)平行。而后將十二孔板如圖1所示放置在培養(yǎng)缸中靜置培養(yǎng)(不敞蓋)，培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度為30～40μmol·m^-2·s^-1，溫度控制在24或25或26℃，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)缸二氧化碳濃度(二氧化碳體積占比氣體總體積)分別為10％和0.03％。

公式2：

(例：如活化擴(kuò)培后藻液的光密度C₁＝1.0，接入十二孔板藻液光密度C₂＝0.3，即接入十二孔板所需的活化擴(kuò)培后原藻液的體積V₁＝0.9mL)

四、OD₆₈₀檢測(cè)：

檢測(cè)OD₆₈₀之前，使用一次性吸管(無(wú)菌)對(duì)藻液進(jìn)行重懸直至藻液均勻，使用酶標(biāo)儀(多功能酶標(biāo)儀SpectraMax M3，Molecular Devices,美國(guó))對(duì)十二孔板中的藻液OD₆₈₀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)吸光度波長(zhǎng)為680nm。

五、目標(biāo)藻株在10％CO₂生長(zhǎng)力及耐受力評(píng)價(jià)：

追蹤OD₆₈₀變化曲線，以O(shè)D·d^-1評(píng)價(jià)設(shè)定條件下(如空氣或10％CO₂條件下)的生長(zhǎng)力，以10％CO₂條件下的OD·d^-1與空氣下的OD·d^-1的差值(deltaOD·d^-1，見(jiàn)公式1)評(píng)價(jià)目標(biāo)藻株對(duì)高濃度二氧化碳的耐受力。

公式1：deltaOD·d^-1＝(OD·d^-1)_10％CO2-(OD·d^-1)_air

(例：在10％CO2條件下目標(biāo)藻株的光密度變化率為0.6·d^-1,在空氣條件下目標(biāo)藻株的光密度變化率(OD·d^-1)_air為0.2·d^-1，則deltaOD·d^-1為0.4·d^-1。)

六、驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)：

對(duì)上述基于十二孔板實(shí)驗(yàn)得到藻株耐受10％CO₂的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取出deltaOD·d^-1分別為-0.07,-0.006,0.29·d^-1，分別代表對(duì)高濃度二氧化碳耐受力差、中、優(yōu)的藻株。對(duì)該三株微藻進(jìn)行活化擴(kuò)培，離心后接入上述無(wú)碳培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度為30或40μmol·m^-2·s^-1，溫度控制在24或25或26℃，通氣速率為0.3～0.5L/min，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別為二氧化碳占體積比氣體總體積的10％和0.03％。結(jié)果如圖4所示，目標(biāo)藻株(編號(hào)為1,2,3)分別在十二孔板和100mL柱狀光生物反應(yīng)器的10％CO₂耐受實(shí)驗(yàn)，其中deltaOD·d^-1用于評(píng)價(jià)目標(biāo)藻株對(duì)10％CO₂的耐受力，OD·d^-1用于評(píng)價(jià)目標(biāo)藻株在10％CO₂的生長(zhǎng)力，結(jié)合散點(diǎn)圖可以用于大批量篩選耐受高濃度二氧化碳的優(yōu)良藻株。結(jié)果顯示，十二孔板和100mL柱狀光生物反應(yīng)器的實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映兩體系下藻株生長(zhǎng)狀況趨勢(shì)一致，利用散點(diǎn)圖可以獲得耐受力及生長(zhǎng)力最佳的編號(hào)為3的藻株，進(jìn)一步表明基于十二孔板實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)和篩選藻株耐受力的有效性。

七、中試規(guī)模利用煙道尾氣處理培養(yǎng)優(yōu)良藻株

在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用該方法篩選出deltaOD·d^-1＞0.3d^-1的優(yōu)良藻株(即該藻株基于本裝置10％CO₂和空氣條件下的光密度變化率差值大于0.3d^-1)，應(yīng)用于戶外600L的管道光生物反應(yīng)器的中試規(guī)模，分別通入二氧化碳濃度為3-5％的生物質(zhì)電廠煙道尾氣和空氣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩條件下的單位時(shí)間單位體積生物量產(chǎn)率分別為0.2和0.025g·L^-1·d^-1，培養(yǎng)十天之后分別可收獲約0.5和0.1kg干藻粉，說(shuō)明本發(fā)明可篩選出耐受高濃度二氧化碳的優(yōu)良藻株，并能成功應(yīng)用于煙道尾氣減排。

實(shí)施例2：

根據(jù)圖2、圖3A、圖3B、圖3C、圖3D可知，一種應(yīng)用于評(píng)估微藻二氧化碳耐受力的裝置，它由LED燈管1、出氣口2、進(jìn)氣口3、透光培養(yǎng)缸4、透光孔板5、保濕波浪海綿6、培養(yǎng)缸上方開(kāi)口7、透光玻璃蓋8組成。其特征在于：透光培養(yǎng)缸4分別與透光玻璃蓋8和LED燈管1相連，透光培養(yǎng)缸4左右兩側(cè)分別開(kāi)有進(jìn)氣口3和出氣口2，并在透光培養(yǎng)缸4內(nèi)部與保濕波浪海綿6連接，保濕波浪海綿6與透光孔板5連接，透光玻璃蓋8下方透光且上部有適當(dāng)培養(yǎng)缸上方開(kāi)口7，透光培養(yǎng)缸4長(zhǎng)為90cm，寬為40cm，高為30cm，設(shè)置在透光培養(yǎng)缸4上方的可控式LED燈管1，設(shè)置在透光培養(yǎng)缸4底部的可吸水保濕波浪海綿6，以及設(shè)置在左側(cè)右下方的進(jìn)氣口3和右側(cè)左上方的出氣口2，實(shí)驗(yàn)用的透光孔板5。透光培養(yǎng)缸4為立方形，材質(zhì)為鈉鈣硅酸鹽玻璃，厚度為3.5cm，透光率不低于86％，表面平滑，在透光培養(yǎng)缸4的右側(cè)左上方和左側(cè)右下方分別開(kāi)有一個(gè)出氣口2和進(jìn)氣口3，對(duì)于二氧化碳培養(yǎng)缸而言，出氣口2與進(jìn)氣口3的設(shè)置，應(yīng)位于左右兩側(cè)的對(duì)角線位置，由于二氧化碳密度較空氣大(在標(biāo)準(zhǔn)狀況下，空氣的平均密度為1.294g·L^-1，二氧化碳的為1.429g·L^-1)，因此須保證出氣口2在上，進(jìn)氣口3在下，(空氣培養(yǎng)缸則無(wú)需嚴(yán)格要求出氣口和進(jìn)氣口的上下位置關(guān)系)，出氣口和進(jìn)氣口的直徑為0.7或0.8或0.9cm，這樣可以使培養(yǎng)缸內(nèi)的二氧化碳濃度保持穩(wěn)定，透光培養(yǎng)缸4上方開(kāi)一個(gè)直徑12cm的圓形孔，在上端中間區(qū)域加蓋一個(gè)邊長(zhǎng)25cm的透光玻璃蓋8，蓋上透光玻璃蓋8之后通氣須保證密封性良好，通氣導(dǎo)管為硅膠管10，硅膠管10上部接入過(guò)濾器9，過(guò)濾器9為35mm的針頭式過(guò)濾器，內(nèi)部為孔徑0.22μm的混合纖維酯微孔濾膜，該部件為微藻提供一個(gè)穩(wěn)定的氣體環(huán)境。透光培養(yǎng)缸4底部放置波浪型吸水保濕海綿6，材質(zhì)為聚氨酯，具有高吸水及高回彈性能，設(shè)置可以保證透光培養(yǎng)缸4內(nèi)的濕度，有效防止孔板中的藻液蒸發(fā)。此外，透光培養(yǎng)缸4上安置LED燈管1，可保證孔板表面接受到的光照強(qiáng)度在50μmol·m^-2·s^-1。補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)比較三株微藻在該發(fā)明裝置和小型光生物反應(yīng)器在高濃度二氧化碳條件下的生長(zhǎng)力及耐受力，結(jié)果顯示三株微藻在同等條件下的生長(zhǎng)及耐受力趨勢(shì)保持一致，進(jìn)一步表明基于十二孔板實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)藻株生長(zhǎng)及耐受力的有效性。

實(shí)施例3：

根據(jù)圖1可知，一種應(yīng)用于微藻快速擴(kuò)培的小型光生物反應(yīng)器裝置，它由過(guò)濾器9、通氣導(dǎo)管10(4－8個(gè))、六通式氣體分流裝置11、打孔膠塞12(4－8個(gè))、玻璃管13(4－8個(gè))、透光玻璃管14(4－8個(gè))、六孔架子15組成。其特征在于：透光玻璃管14分別與打孔膠塞12和六孔架子15連接，打孔膠塞12與玻璃管13連接，玻璃管13與通氣導(dǎo)管10連接，六通式氣體分流裝置11上端和下端分別與通氣導(dǎo)管10連接，上端的通氣導(dǎo)管10連接過(guò)濾器9，還包括100ml透光玻璃管14，還包括設(shè)置在透光玻璃管14瓶口的打孔膠塞12、設(shè)置在透光玻璃管內(nèi)部的通氣玻璃管13、穩(wěn)定透光玻璃管的六孔架子15、上部的六通式氣體分流裝置11以及通氣導(dǎo)管10。根據(jù)圖1可知其連接關(guān)系：透光玻璃管14為圓柱形，材質(zhì)為樹(shù)脂玻璃，直徑約4cm，高度為15cm，高度與直徑的比值為5之間，玻璃厚度為0.2cm，透光玻璃管14共6個(gè)。每個(gè)透光玻璃管14連接著打孔膠塞12，安置在六孔架子15，構(gòu)成微藻的培養(yǎng)裝置。每個(gè)打孔膠塞12連接著上口接通氣導(dǎo)管10的通氣玻璃管13，通氣導(dǎo)管相應(yīng)對(duì)接六通式氣體分流裝置11的通氣閥門(mén)，六通式氣體分流裝置11上接通氣導(dǎo)管10，通氣導(dǎo)管10與過(guò)濾器1連接，通氣導(dǎo)管10為硅膠管，通氣導(dǎo)管10上部接入過(guò)濾器1為40mm的針頭式過(guò)濾器，內(nèi)部為孔徑0.22μm的混合纖維酯微孔濾膜。該通氣裝置為穩(wěn)定性的可控式六通通氣裝置，材質(zhì)為不銹鋼，可控裝置為把手式開(kāi)關(guān)，通氣量大小可控，構(gòu)成微藻培養(yǎng)的通氣裝置。該裝置主要由培養(yǎng)部件和通氣部件兩個(gè)部分組成，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，操作方法與傳統(tǒng)的柱狀光合生物反應(yīng)器一致，優(yōu)點(diǎn)在于小體積培養(yǎng)，通氣穩(wěn)定可控，可應(yīng)用于大批量的藻株生長(zhǎng)性能評(píng)價(jià)及藻株生長(zhǎng)參數(shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。