本發(fā)明涉及替米考星技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種禽肉中替米考星檢測方法及檢測卡。
背景技術(shù)：
替米考星是由泰樂菌素的一種水解產(chǎn)物半合成的畜禽專用抗生素，藥用其磷酸鹽，替米考星是20世紀(jì)80年代開發(fā)的半合成大環(huán)內(nèi)酯類畜禽專用抗生素，分子量869.15。將泰樂菌素與3，5－二甲基哌啶反應(yīng)生成替米考星堿，再加磷酸和水即形成磷酸替米考星，它是順反異構(gòu)體的混合物。替米考星是在研究泰樂菌素脫糖后進(jìn)行醛基的胺化反應(yīng)得到的一個活性很好的產(chǎn)物，該胺化反應(yīng)采用以甲酸作催化劑的Wallach反應(yīng)，能獲得收率很高的替米考星。
目前大多數(shù)替米考星檢測都是采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測，但這些方法過于繁瑣，耗時較長，檢測成本較高，不能滿足快速檢測的要求，為此提供一種禽肉中替米考星檢測方法及檢測卡。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
（一）解決的技術(shù)問題
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種禽肉中替米考星檢測方法及檢測卡，解決了檢測耗時長和檢測成本高的問題。
（二）技術(shù)方案
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種禽肉中替米考星檢測卡，檢測卡制作包括如下步驟：
S1，替米考星與卵清蛋白偶聯(lián)物的制備，取20-24mg替米考星、14-16mgN，N’-羧基二咪唑用1.4-1.6ml N,N-二甲基甲酰胺溶解，室溫攪拌反應(yīng)1h，即可得到反應(yīng)液，取卵清蛋白32-40mg，使卵清蛋白充分溶解在3-4ml 50mol/L碳酸鈉溶液中，將反應(yīng)液逐漸緩慢滴加到卵清蛋白溶液中，在室溫中反應(yīng)24-30h，用0.01mol/L PBS透析3天，每天換液3-4次，以出去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，最后以12000r/min離心25-35min，收集上清液，分別進(jìn)行儲存，放于-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>
S2，人工抗原的鑒定，將替米考星、卵清蛋白、替米考星-卵清蛋白偶聯(lián)物用PH7.4的PBS配成0.4-0.6mg/ml的溶液，以0.01mol/L PH7.4PBS調(diào)零，用紫外分光廣度計在波長200-600范圍內(nèi)掃描，得到替米考星、卵清蛋白呵替米考星-卵清蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線，通過顯示出三條不同的吸收曲線，表示替米考星與載體蛋白偶聯(lián)成功；
S3，替米考星單克隆抗體的制備，將替米考星-卵清蛋白偶聯(lián)物注入Balb/c小鼠體內(nèi)，使小鼠進(jìn)行免疫，劑量為140-160μg/只，使其產(chǎn)生抗血清，取免疫Balb/c小鼠細(xì)胞，按8:1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選得到穩(wěn)定分泌替米考星單克隆抗體的替米考星單克隆再叫瘤細(xì)胞株，將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成5X106個/ml的細(xì)胞懸液，在液氨中長期保存，復(fù)蘇時取出凍存管，放入到37℃水浴中速溶，離心取出凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，將雜交瘤細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用辛酸-包河硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行鈍化，得到單克隆抗體，-20℃保存；
S4,羊抗鼠抗抗體的制備，以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；
S5，膠體金的制備，用雙蒸水離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%（質(zhì)量百分含量），取100ml置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高溫、持續(xù)攪拌下加入2-3ml 1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)勻速攪拌加熱至溶液呈透亮的紅色時停止，冷卻至室溫后用去離子水恢復(fù)到原體積，4℃保存，制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物；
S6，替米考星單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備，在磁力攪拌下，用0.2mol/L碳酸鉀調(diào)膠體金的PH值至7.2，按每毫升膠體金溶液中加入24μg的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入上述替米考星單克隆抗體，攪拌均勻，室溫靜置8-12min，加入10%卵清蛋白，使其在膠體金溶液中的終濃度為1%，靜置8-12min，然后在12000r/min，4℃的溫度下離心35-45min，棄掉上層清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩到三次，用體積為初始膠體金1/10的復(fù)溶緩沖液將沉淀重置，放在4℃下備用；
S7，向微孔試劑微孔板中加入100μl替米考星單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，放入冷凍干燥機中，在冷阱溫度為-50℃條件下，預(yù)凍3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到凍干有替米考星單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑，密封保存；
S8，反應(yīng)膜的制備，用磷酸緩沖液將替米考星-卵清蛋白偶聯(lián)物稀釋到10mg/ml，用點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測線，包被量為1.0μg/cm2,,然后用0.01mol/L PH7.4的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠IgG抗體稀釋到160-240μg/ml，用點膜儀將其包被與硝酸纖維膜上的質(zhì)控線，包被量為1.0μg/cm2，將包被好的反應(yīng)膜置于37℃條件下干燥2-3h，備用，將樣品吸收墊置于含0.5%卵清蛋白、PH7.2 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液中浸泡2-3h，37℃烘干2-3h備用；
S9，樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護(hù)膜依次按順序粘貼在底板上，樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜的始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊，保護(hù)膜覆蓋在樣品吸收墊上，為檢測面，上面印有標(biāo)記線，檢測線含有替米考星-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控線含有羊抗鼠抗抗體。
優(yōu)選的，所述復(fù)溶緩沖液含卵清蛋白0.05%-0.35%、吐溫-80 0.02%-0.22%和PH7.2的0.02-0.03mol/L磷酸鹽緩沖液。
優(yōu)選的，所述底板為PVC底板、樣品吸收墊為吸濾紙、反應(yīng)膜為硝酸纖維膜、吸水墊為吸水紙、保護(hù)膜為PE材質(zhì)保護(hù)膜。
優(yōu)選的，所述儀器包括離心機、紫外分光廣度計、培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)基、恒溫電磁攪拌器、冷凍干燥機和點膜儀。
優(yōu)選的，所述復(fù)溶緩沖液含卵清蛋白0.1%-0.3%、吐溫-80 0.05%-0.2%和PH7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液。
一種禽肉中替米考星檢測方法，滴加待檢禽肉中樣品溶液180-220μl到微孔試劑中，攪拌均勻后，在室溫中培育4-6min，將檢測卡標(biāo)有標(biāo)記線的一端向下插入培育的微孔試劑中，在室溫培育4-6min，觀察結(jié)果，替米考星在樣本中的含量高于或等于檢測卡對其的最低檢測限時，替米考星單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物與替米考星結(jié)合，金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合位點唄封閉，從而在檢測線上因為競爭反應(yīng)，不會與替米考星-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶，陰性樣板在檢測過程中由于缺少抗原抗體競爭反應(yīng)，將會在檢測線和質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，陽性：質(zhì)控線顯示一條紅色條帶，而檢測線不顯色，檢測卡以顯示紅色線一條，判定為陽性，陰性：質(zhì)控線顯示一條紅色條帶，檢測線同時也顯示出一條紅色條帶，檢測卡以顯示紅色線兩條，判定為陰性，當(dāng)質(zhì)控線不顯示紅色條帶，則無論檢測線顯示出紅色與否，都判定檢測卡為無效。
（三）有益效果
本發(fā)明提供了一種禽肉中替米考星檢測方法及檢測卡，具備以下有益效果：
（1）該禽肉中替米考星檢測方法及檢測卡，通過將所需的大部分原料整合到檢測卡上，通過檢測卡插入進(jìn)微孔試劑中進(jìn)行檢測，大大縮短了檢樣時間，且樣品無需特殊處理，等待4-6mim即可得出結(jié)果，檢測過程無需特殊儀器輔助，普通人員均可操作，不需要專業(yè)培訓(xùn)，極易使用。
（2）該禽肉中替米考星檢測方法及檢測卡，建構(gòu)簡單，生產(chǎn)成本低廉，檢測準(zhǔn)確率高，從而可以極大的提高青霉素的檢測率，以及節(jié)約檢測成本。
具體實施方式
基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
本發(fā)明提供一種技術(shù)方案：一種禽肉中替米考星檢測方法及檢測卡，包括儀器包括離心機、紫外分光廣度計、培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)基、恒溫電磁攪拌器、冷凍干燥機和點膜儀，檢測卡制作包括如下步驟：
S1，替米考星與卵清蛋白偶聯(lián)物的制備，取20-24mg替米考星、14-16mgN，N’-羧基二咪唑用1.4-1.6ml N,N-二甲基甲酰胺溶解，室溫攪拌反應(yīng)1h，即可得到反應(yīng)液，取卵清蛋白32-40mg，使卵清蛋白充分溶解在3-4ml 50mol/L碳酸鈉溶液中，將反應(yīng)液逐漸緩慢滴加到卵清蛋白溶液中，在室溫中反應(yīng)24-30h，用0.01mol/L PBS透析3天，每天換液3-4次，以出去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，最后以12000r/min離心25-35min，收集上清液，分別進(jìn)行儲存，放于-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>
S2，人工抗原的鑒定，將替米考星、卵清蛋白、替米考星-卵清蛋白偶聯(lián)物用PH7.4的PBS配成0.4-0.6mg/ml的溶液，以0.01mol/L PH7.4PBS調(diào)零，用紫外分光廣度計在波長200-600范圍內(nèi)掃描，得到替米考星、卵清蛋白呵替米考星-卵清蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線，通過顯示出三條不同的吸收曲線，表示替米考星與載體蛋白偶聯(lián)成功；
S3，替米考星單克隆抗體的制備，將替米考星-卵清蛋白偶聯(lián)物注入Balb/c小鼠體內(nèi)，使小鼠進(jìn)行免疫，劑量為140-160μg/只，使其產(chǎn)生抗血清，取免疫Balb/c小鼠細(xì)胞，按8:1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選得到穩(wěn)定分泌替米考星單克隆抗體的替米考星單克隆再叫瘤細(xì)胞株，將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成5X106個/ml的細(xì)胞懸液，在液氨中長期保存，復(fù)蘇時取出凍存管，放入到37℃水浴中速溶，離心取出凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，將雜交瘤細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用辛酸-包河硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行鈍化，得到單克隆抗體，-20℃保存；
S4,羊抗鼠抗抗體的制備，以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；
S5，膠體金的制備，用雙蒸水離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%（質(zhì)量百分含量），取100ml置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高溫、持續(xù)攪拌下加入2-3ml 1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)勻速攪拌加熱至溶液呈透亮的紅色時停止，冷卻至室溫后用去離子水恢復(fù)到原體積，4℃保存，制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物；
S6，替米考星單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備，在磁力攪拌下，用0.2mol/L碳酸鉀調(diào)膠體金的PH值至7.2，按每毫升膠體金溶液中加入24μg的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入上述替米考星單克隆抗體，攪拌均勻，室溫靜置8-12min，加入10%卵清蛋白，使其在膠體金溶液中的終濃度為1%，靜置8-12min，然后在12000r/min，4℃的溫度下離心35-45min，棄掉上層清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩到三次，復(fù)溶緩沖液含卵清蛋白0.05%-0.35%、吐溫-80 0.02%-0.22%和PH7.2的0.02-0.03mol/L磷酸鹽緩沖液，復(fù)溶緩沖液含卵清蛋白0.1%-0.3%、吐溫-80 0.05%-0.2%和PH7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液，用體積為初始膠體金1/10的復(fù)溶緩沖液將沉淀重置，放在4℃下備用；
S7，向微孔試劑微孔板中加入100μl替米考星單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，放入冷凍干燥機中，在冷阱溫度為-50℃條件下，預(yù)凍3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到凍干有替米考星單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑，密封保存；
S8，反應(yīng)膜的制備，用磷酸緩沖液將替米考星-卵清蛋白偶聯(lián)物稀釋到10mg/ml，用點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測線，包被量為1.0μg/cm2,,然后用0.01mol/L PH7.4的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠IgG抗體稀釋到160-240μg/ml，用點膜儀將其包被與硝酸纖維膜上的質(zhì)控線，包被量為1.0μg/cm2，將包被好的反應(yīng)膜置于37℃條件下干燥2-3h，備用，將樣品吸收墊置于含0.5%卵清蛋白、PH7.2 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液中浸泡2-3h，37℃烘干2-3h備用；
S9，樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護(hù)膜依次按順序粘貼在底板上，樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜的始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊，保護(hù)膜覆蓋在樣品吸收墊上，為檢測面，上面印有標(biāo)記線，檢測線含有替米考星-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控線含有羊抗鼠抗抗體，底板為PVC底板、樣品吸收墊為吸濾紙、反應(yīng)膜為硝酸纖維膜、吸水墊為吸水紙、保護(hù)膜為PE材質(zhì)保護(hù)膜。
一種禽肉中替米考星檢測方法，檢測方法包括如下步驟：滴加待檢禽肉中樣品溶液180-220μl到微孔試劑中，攪拌均勻后，在室溫中培育4-6min，將檢測卡標(biāo)有標(biāo)記線的一端向下插入培育的微孔試劑中，在室溫培育4-6min，觀察結(jié)果，替米考星在樣本中的含量高于或等于檢測卡對其的最低檢測限時，替米考星單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物與替米考星結(jié)合，金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合位點唄封閉，從而在檢測線上因為競爭反應(yīng)，不會與替米考星-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶，陰性樣板在檢測過程中由于缺少抗原抗體競爭反應(yīng)，將會在檢測線和質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，陽性：質(zhì)控線顯示一條紅色條帶，而檢測線不顯色，檢測卡以顯示紅色線一條，判定為陽性，陰性：質(zhì)控線顯示一條紅色條帶，檢測線同時也顯示出一條紅色條帶，檢測卡以顯示紅色線兩條，判定為陰性，當(dāng)質(zhì)控線不顯示紅色條帶，則無論檢測線顯示出紅色與否，都判定檢測卡為無效。
實施例1
一種禽肉中替米考星檢測方法，檢測方法包括如下步驟：
滴加待檢禽肉中樣品溶液180μl到微孔試劑中，攪拌均勻后，在室溫中培育4min，將檢測卡標(biāo)有標(biāo)記線的一端向下插入培育的微孔試劑中，在室溫培育4min，觀察結(jié)果，替米考星在樣本中的含量高于或等于檢測卡對其的最低檢測限時，替米考星單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物與替米考星結(jié)合，金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合位點唄封閉，從而在檢測線上因為競爭反應(yīng)，不會與替米考星-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶，陰性樣板在檢測過程中由于缺少抗原抗體競爭反應(yīng)，將會在檢測線和質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，陽性：質(zhì)控線顯示一條紅色條帶，而檢測線不顯色，檢測卡以顯示紅色線一條，判定為陽性，陰性：質(zhì)控線顯示一條紅色條帶，檢測線同時也顯示出一條紅色條帶，檢測卡以顯示紅色線兩條，判定為陰性，當(dāng)質(zhì)控線不顯示紅色條帶，則無論檢測線顯示出紅色與否，都判定檢測卡為無效。
實施例2
一種禽肉中替米考星檢測方法，檢測方法包括如下步驟：
滴加待檢禽肉中樣品溶液200μl到微孔試劑中，攪拌均勻后，在室溫中培育5min，將檢測卡標(biāo)有標(biāo)記線的一端向下插入培育的微孔試劑中，在室溫培育5min，觀察結(jié)果，替米考星在樣本中的含量高于或等于檢測卡對其的最低檢測限時，替米考星單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物與替米考星結(jié)合，金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合位點唄封閉，從而在檢測線上因為競爭反應(yīng)，不會與替米考星-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶，陰性樣板在檢測過程中由于缺少抗原抗體競爭反應(yīng)，將會在檢測線和質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，陽性：質(zhì)控線顯示一條紅色條帶，而檢測線不顯色，檢測卡以顯示紅色線一條，判定為陽性，陰性：質(zhì)控線顯示一條紅色條帶，檢測線同時也顯示出一條紅色條帶，檢測卡以顯示紅色線兩條，判定為陰性，當(dāng)質(zhì)控線不顯示紅色條帶，則無論檢測線顯示出紅色與否，都判定檢測卡為無效。
實施例3
一種禽肉中替米考星檢測方法，檢測方法包括如下步驟：
滴加待檢禽肉中樣品溶液220μl到微孔試劑中，攪拌均勻后，在室溫中培育6min，將檢測卡標(biāo)有標(biāo)記線的一端向下插入培育的微孔試劑中，在室溫培育6min，觀察結(jié)果，替米考星在樣本中的含量高于或等于檢測卡對其的最低檢測限時，替米考星單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物與替米考星結(jié)合，金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合位點唄封閉，從而在檢測線上因為競爭反應(yīng)，不會與替米考星-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶，陰性樣板在檢測過程中由于缺少抗原抗體競爭反應(yīng)，將會在檢測線和質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，陽性：質(zhì)控線顯示一條紅色條帶，而檢測線不顯色，檢測卡以顯示紅色線一條，判定為陽性，陰性：質(zhì)控線顯示一條紅色條帶，檢測線同時也顯示出一條紅色條帶，檢測卡以顯示紅色線兩條，判定為陰性，當(dāng)質(zhì)控線不顯示紅色條帶，則無論檢測線顯示出紅色與否，都判定檢測卡為無效。
綜上所述，該禽肉中替米考星檢測方法及檢測卡，陽性：質(zhì)控線顯示一條紅色條帶，而檢測線不顯色，檢測卡以顯示紅色線一條，判定為陽性，陰性：質(zhì)控線顯示一條紅色條帶，檢測線同時也顯示出一條紅色條帶，檢測卡以顯示紅色線兩條，判定為陰性，當(dāng)質(zhì)控線不顯示紅色條帶，則無論檢測線顯示出紅色與否，都判定檢測卡為無效。
需要說明的是，在本文中，諸如第一和第二等之類的關(guān)系術(shù)語僅僅用來將一個實體或者操作與另一個實體或操作區(qū)分開來，而不一定要求或者暗示這些實體或操作之間存在任何這種實際的關(guān)系或者順序。而且，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。在沒有更多限制的情況下。由語句“包括一個......限定的要素，并不排除在包括所述要素的過程、方法、物品或者設(shè)備中還存在另外的相同要素”。
盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。