本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測D-二聚體(D-Dimer)斑點金滲濾試劑盒及其定量檢測方法。
背景技術(shù)：
D-二聚體是纖維蛋白單體經(jīng)活化因子XIII交聯(lián)后，再經(jīng)纖溶酶水解所產(chǎn)生的一種特異性降解產(chǎn)物，是一個特異性的纖溶過程標記物。D-二聚體來源于纖溶酶溶解的交聯(lián)纖維蛋白凝塊。
在生理狀態(tài)下，機體保持著凝血與纖溶動態(tài)平衡，以保證纖維蛋白及時形成和清除，而人體正常D二聚體的水平一般在200μg/l以下，如果體內(nèi)凝血和纖溶系統(tǒng)雙重激活，D二聚體水平就會升高，因此D二聚體可以作為體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進的分子標志物之一。D二聚體的特異性反映的是有凝血和纖溶過程的這一類疾病的共同病理特點，因此在臨床應(yīng)用十分廣泛。D二聚體作為測定纖溶系統(tǒng)的主要因子，對于診斷與治療纖溶系統(tǒng)疾病及與纖溶系統(tǒng)有關(guān)的疾病以及溶栓治療檢測有著重要的意義，因此D二聚體是深靜脈血栓(DVT)，肺栓塞(PE)，彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)的關(guān)鍵指標。由此可見，血液中D二聚體含量測定對血栓性疾病的早期診斷、病程監(jiān)測以及對溶栓藥物的治療監(jiān)測等都具有重要的臨床意義。
D-二聚體檢測技術(shù)主要有乳膠凝集法、免疫比濁法、膠體金法、免疫熒光法、磁珠免疫法等。乳膠凝集法測量D-二聚體主要為定性，不能夠準確定量樣本中的D-二聚體濃度。免疫比濁法相對操作較為繁瑣且在高濃度抗原存在的情況下易出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，從而影響測量的結(jié)果。膠體金法測試時間較長，精密度較差，且容易受環(huán)境條件的影響。免疫熒光和磁珠免疫法則對儀器的要求較高，不便于臨床推廣和大范圍的使用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
現(xiàn)有的金標免疫檢測在定性檢測應(yīng)用較為廣泛，本發(fā)明提供一種檢測D-二聚體(D-Dimer)斑點免疫金滲濾試劑盒定量檢測方法，斑點免疫金滲濾法是讓待測樣本垂直滲濾過微孔膜(例如：硝酸纖維素膜)，被膜上包被的捕獲探針捕獲，再以同樣方式讓膠體金標探針滲濾過微孔膜，與被捕獲的配體結(jié)合后聚集形成肉眼可見的紅色斑點。
本發(fā)明提供了一種檢測D-二聚體(D-Dimer)斑點免疫金滲濾試劑盒，包括pH值為6.7的預(yù)封閉液、pH值為6.2的洗滌液、膠體金標記D-二聚體抗體、D-二聚體層析器和定標卡；所述預(yù)封閉液包括Triton-100和硼酸鹽緩沖液溶液；所述洗滌液包括牛血清白蛋白和硼酸鹽緩沖液溶液。
優(yōu)選的，所述預(yù)封閉液中Triton-100的濃度為0.6～10％，硼酸鹽緩沖液溶液的濃度為0.5～10mol/L；所述洗滌液中牛血清白蛋白的濃度為0.6～10％，硼酸鹽緩沖液溶液的濃度為0.5～10mol/L。
優(yōu)選的，所述硼酸鹽緩沖液溶液由以下原料配制：Na2B4O7·10H2O 1.0-3.0重量份、H3BO3 0.5-1.5重量份、NaCl 4重量份、KCl 0.1重量份、蒸餾水800ml重量份、牛血清白蛋白5重量份。
優(yōu)選的，所述膠體金標記D-二聚體抗體按照如下方法制備：
先將質(zhì)量份數(shù)為3％的氯金酸與雙蒸水按體積1∶86配成A液；將質(zhì)量份數(shù)為3％檸檬酸三鈉、質(zhì)量份數(shù)為2.8％鞣酸、質(zhì)量份數(shù)為40mM K2CO3與雙蒸水按體積比6∶0.05～0.98∶0.05～0.98∶16.04～18.99配成B液；再將所述A液加熱到62～69℃，B液加熱到55～58℃，攪拌A液，快速加入B液，繼續(xù)攪拌3分鐘，在5～9分鐘內(nèi)加熱至沸騰，制成膠體金液；
利用0.5M K2CO3調(diào)整所述膠體金液pH值為7.0～7.5；
將D-二聚體抗體原液在2℃下以10000～13000r/min速度離心40分鐘，吸取上清液；將該抗體裝入透析袋，用雙蒸水透析去除鹽分后，裝瓶冷凍，得到D-二聚體抗體；
將所述D-二聚體抗體緩慢加入膠體金液中進行包被，所述D-二聚體抗體與膠體金液的質(zhì)量體積比為0.31～0.39mg：110ml，攪拌25分鐘后，依次加入20～30％迭氮鈉和1～10％牛血清白蛋白，所述迭氮鈉和牛血清白蛋白與所述膠體金液的體積比為500μl：100μl：100ml，攪勻后在4.1～5.0℃，以7000r/min速度下離心20分鐘，去除上清液，沉淀物即為膠體金標記D-二聚體膠體。
優(yōu)選的，所述檸檬酸三鈉、鞣酸、K2C03與雙蒸水的體積比為6：1.2：1.2：19；所述膠體金液中形成直徑為7.8＜D＜9.8nm的膠體金顆粒。所述膠體金顆粒直徑為6～16nm的，該膠體金液顏色由黑→藍→紫→紅色時即成。
優(yōu)選的，所述D-二聚體層析器內(nèi)設(shè)置有直徑為3.5cm的反應(yīng)盒，所述反應(yīng)盒包括盒底和盒蓋兩部分，所述盒蓋頂面中央設(shè)置有一個上表面直徑為0.8cm，下表面直徑為0.4cm的小圓孔；所述反應(yīng)盒內(nèi)墊滿吸水材料，在小圓孔下方和吸水材料上方之間放置一張1.5×1.5cm的包被D-二聚體抗體的硝酸纖維素膜。
優(yōu)選的，所述包被D-二聚體抗體的硝酸纖維素膜按照以下步驟制備：
將所述D-二聚體抗體原液在2℃下以10000～13000r/min速度離心40分鐘，吸取上清液；將所述抗體裝入透析袋，用雙蒸水透析去除鹽分后，超濾濃縮后裝瓶冷凍，得到D-二聚體抗體；
用硼酸鹽緩沖液溶液稀釋上述D-二聚體抗體，得到1.0mg/ml的包被液；
將所述包被液滴加至裁切好的硝酸纖維素膜上，每張膜片0.025ml，將膜片置于烘箱中干燥后即制成包被有D-二聚體抗體的硝酸纖維素膜。
優(yōu)選的，所述定標卡為D-二聚體梯度質(zhì)量濃度溶液所檢測顏色相對應(yīng)的檢測信號值。根據(jù)檢測試紙顯示的信號值，與定標卡信號值比對，即可定量判定其質(zhì)量濃度。
優(yōu)選的，所述梯度質(zhì)量濃度分別為0.1、0.3、1、2.5、5、10mg/L，并且該梯度質(zhì)量濃度檢測的信號值與定標卡相對應(yīng)。
一種檢測D-二聚體斑點免疫金滲濾試劑盒的定量檢測方法，包括以下步驟：
采集血樣5.1～10ml，室溫放置15min-2h，以4000r/min速度離心20min，吸取上清液將血樣混勻，得到待測樣本；
利用移液器準確吸取預(yù)封閉液，點在反應(yīng)盒圓孔內(nèi)硝酸纖維素膜面上；
待預(yù)封閉液滲入后，用移液器準確吸取檢測樣本，點在反應(yīng)盒圓孔內(nèi)硝酸纖維素膜面上；
待檢測樣本滲入后，再向反應(yīng)盒膜面滴加膠體金標記D-二聚體抗體；所述膠體金標記D-二聚體抗體與所述檢測樣本的體積比為1：1.5；
待D-二聚體抗體標記膠體金滲入后，再向反應(yīng)盒膜面上滴加洗滌液；所述洗滌液與所述檢測樣本的體積比為1：1.5；
觀察反應(yīng)盒膜面，待洗滌液完全滲入膜面后，檢測D-二聚體層析器信號值，通過儀器結(jié)合定標卡信息計算檢測樣本D-二聚體濃度，可定量判定其質(zhì)量濃度。
D-二聚體(D-Dimer)斑點金滲濾試劑盒具有檢測時間短，精密度好，對儀器和環(huán)境的要求較低，便于臨床推廣應(yīng)用等優(yōu)點。
本發(fā)明提供了一種檢測D-二聚體斑點免疫金滲濾試劑盒及其定量檢測方法，包括pH值為6.7的預(yù)封閉液、pH值為6.2的洗滌液、膠體金標記D-二聚體抗體、D-二聚體層析器和定標卡；所述預(yù)封閉液包括Triton-100和硼酸鹽緩沖液溶液；所述洗滌液包括牛血清白蛋白和硼酸鹽緩沖液溶液。本發(fā)明斑點免疫金滲濾法以親和層析原理為基礎(chǔ)，采用硝酸纖維素膜為固相載體，以吸附在硝酸纖維素上的抗體為固相，以人血中抗原以及抗體標記膠體金為液相，并同時以抗體標記膠體金作為探針和指示劑，而建立起來的一種新型的免疫檢測方法。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，膠體金顆粒的表面帶負電荷與D-二聚體抗體蛋白分子的正電荷基團因靜電作用形成牢固的結(jié)合，同時金顆粒又有高電子密度的特性，當被金顆粒標記的抗體與相應(yīng)的抗原配體結(jié)合，金顆粒在抗體配體位點大量聚集時，便形成肉眼可見的紅色斑點。本發(fā)明的D-二聚體抗體斑點金滲濾試劑盒具有檢測時間短，精密度好，對儀器和環(huán)境的要求較低，便于臨床推廣應(yīng)用等優(yōu)點。
具體實施方式
為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明優(yōu)選實施方案進行描述，但是應(yīng)當理解，這些描述只是為進一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點，而不是對本發(fā)明權(quán)利要求的限制。
本發(fā)明實施例公開了一種檢測D-二聚體(D-Dimer)斑點免疫金滲濾試劑盒，包括pH值為6.7的預(yù)封閉液、pH值為6.2的洗滌液、膠體金標記D-二聚體抗體、D-二聚體層析器和定標卡；其中，所述預(yù)封閉液中Triton-100的濃度為0.6～10％、硼酸鹽緩沖液溶液的濃度為0.5～10mol/L；所述洗滌液中牛血清白蛋白(BSA)的濃度為0.6～10％％、硼酸鹽緩沖液溶液的濃度為0.5～10mol/L。
作為優(yōu)選方案，所述硼酸鹽緩沖液溶液由Na2B4O7·10H2O 1.0-3.0重量份、H3BO3 0.5-1.5重量份、NaCl 4重量份、KCl 0.1重量份、蒸餾水800ml重量份、牛血清白蛋白5重量份。
作為優(yōu)選方案，所述膠體金標記D-二聚體抗體按以下步驟制備而成：
(1)膠體金的制備以質(zhì)量分數(shù)分別為3％氯金酸、3％檸檬酸三鈉、2.8％鞣酸、40mM K2CO3及雙蒸水為原料，先將3％氯金酸與雙蒸水按體積1∶86配成A液；將3％檸檬酸三鈉、2.8％鞣酸、40mMK2CO3與雙蒸水按體積比6∶0.05～0.98∶0.05～0.98∶16.04～18.99配成B液；再將所述A液加熱到62～69℃，B液加熱到55～58℃，攪拌A液，快速加入B液，繼續(xù)攪拌3分鐘，在5～9分鐘內(nèi)加熱至沸騰，制成膠體金液，該膠體金液顏色由黑→藍→紫→紅色時，制成直徑為8～12nm的膠體金顆粒；
(2)利用0.5M K2CO3調(diào)整所述膠體金液pH值為7.0～7.5后備用；
(3)D-二聚體抗體的制備與透析，將抗體在2℃下以10000～13000r/min速度離心40分鐘，吸取上清液；將該抗原裝入透析袋，用雙蒸水透析去除鹽分后，裝瓶冷凍，備用；
(4)D-二聚體抗體標記膠體金，將步驟(3)中D-二聚體抗原0.31～0.39mg，緩慢加入步驟(2)制備的110ml膠體金液中進行包被，攪拌15分鐘后，依次加入20～30％的迭氮鈉500μl、1～10％的牛血清白蛋白100μl，攪勻后在4.1～5.0℃，以7000r/min速度下離心20分鐘，去除上清液，即成D-二聚體抗體標記膠體金。
作為優(yōu)選方案，配制膠體金A液配方同上，所述配制膠體金B(yǎng)液的組分為3％檸檬酸三鈉6.0ml、2.8％鞣酸1.2ml、40mM K2C031.2ml與雙蒸水19ml；制成的膠體金顆粒直徑為7.8＜D＜9.8nm；膠體金液pH值調(diào)為6.8；膠體金液與D-二聚體抗原的體積重量比為100ml∶0.30mg。
作為優(yōu)選方案，所述D-二聚體層析器設(shè)置有反應(yīng)盒，直徑為3.5cm的塑料小盒，分盒底和盒蓋兩部分，盒蓋頂面中央有一個上部直徑為0.8cm、下部直徑為0.4cm的小圓孔，盒內(nèi)墊滿吸水材料，在小圓孔下方和吸水材料上方之間放置一張1.5×1.5cm的包被有D-二聚體抗體的硝酸纖維素膜，合緊盒蓋即組成反應(yīng)盒。可避免大部分待測樣本和標記探針從斑點以外的非相關(guān)區(qū)域流失，影響檢測靈敏度，可以使得該技術(shù)在臨床檢驗中廣泛使用。
作為優(yōu)選方案，所述包被D-二聚體抗體的硝酸纖維素膜按以下步驟制備而成：
(1)抗體的純化，D-二聚體包被抗體的純化與透析，將抗體原液在2℃下以10000～13000r/min速度離心40分鐘，吸取上清液即為D-二聚體抗體；將該抗體裝入透析袋，用雙蒸水透析去除鹽分后，超濾濃縮后裝瓶冷凍，備用；
(2)用硼酸鹽緩沖液溶液稀釋上述抗體，得到1.0mg/ml的包被液；
(3)將包被液滴加至裁切好的硝酸纖維素膜上，每張膜片0.025ml，將膜片置于烘箱中干燥后即制成包被有D-二聚體抗體的硝酸纖維素膜。
作為優(yōu)選方案，所述定標卡為D-二聚體梯度質(zhì)量濃度溶液所檢測信號值相對應(yīng)。根據(jù)檢測試紙顯示的信號值，與定標卡信號值比對，即可定量判定其質(zhì)量濃度。
作為優(yōu)選方案，所述梯度質(zhì)量濃度分別為0.1、0.3、1、2.5、5、10mg/L，并且該梯度質(zhì)量濃度檢測的信號與定標卡相對應(yīng)。
更進一步的，本發(fā)明還提供一種檢測D-二聚體(D-Dimer)斑點金滲濾試劑盒的定量檢測方法，按以下步驟操作：
(1)待檢人血漿的采集：用檸檬酸鈉抗凝的真空采血管采集血樣5.1～10ml，混勻，置室溫放置15min-2h，以4000r/min速度離心20min，吸取上清液為待測樣本，冷凍備用；
(2)預(yù)封閉液加樣：用移液器準確吸取預(yù)封閉液，點在反應(yīng)盒圓孔內(nèi)硝酸纖維素膜面上；
(3)檢測樣本加樣：待預(yù)封閉液完全滲入后，用移液器準確吸取檢測樣本，點在反應(yīng)盒圓孔內(nèi)硝酸纖維素膜面上；
(4)滴加D-二聚體抗體標記膠體金：待檢測樣本滲入后，再往反應(yīng)盒膜面滴加D-二聚體抗體，所述膠體金標記D-二聚體抗體與所述檢測樣本的體積比為1：1.5；
(5)待D-二聚體抗體標記膠體金滲入后，再往反應(yīng)盒膜面上滴加洗滌液；所述洗滌液與所述檢測樣本的體積比為1：1.5；
(6)檢測并記錄結(jié)果：觀察反應(yīng)盒膜面，待洗滌液完全滲入膜面后，檢測D-二聚體層析器信號值，通過儀器結(jié)合定標卡信息計算檢測樣本D-二聚體濃度，即可定量判定其質(zhì)量濃度。
從以上方案可以看出，本發(fā)明簡單便捷，根據(jù)D-二聚體層析器顯示的顏色，與對應(yīng)批次定標信息，即可定量待檢測物質(zhì)的質(zhì)量濃度。
為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的技術(shù)方案進行詳細說明，本發(fā)明的保護范圍不受以下實施例的限制。
本發(fā)明實施例采用的原料和化學(xué)試劑均為市購。
實施例1
一種檢測D-二聚體(D-Dimer)斑點免疫金滲濾試劑盒，包括pH值為6.7的預(yù)封閉液、pH值為6.2的洗滌液、膠體金標記D-二聚體抗體、D-二聚體層析器和定標卡；其中，所述預(yù)封閉液中Triton-100的濃度為1.5％、硼酸鹽緩沖液溶液的濃度為1.5mol/L；所述洗滌液中牛血清白蛋白(BSA)的濃度為1.5％、硼酸鹽緩沖液溶液的濃度為1.5mol/L。所述硼酸鹽緩沖液溶液由Na2B4O7·10H2O 2.0重量份、H3BO3 1.0重量份、NaCl 4.0重量份、KCl 0.1重量份、蒸餾水800ml重量份、牛血清白蛋白5重量份。
所述D-二聚體層析器設(shè)置有反應(yīng)盒，直徑為3.5cm的塑料小盒，分盒底和盒蓋兩部分，盒蓋頂面中央有一個上部直徑為0.8cm、下部直徑為0.4cm的小圓孔，盒內(nèi)墊滿吸水材料，在小圓孔下方和吸水材料上方之間放置一張1.5×1.5cm的包被有D-二聚體抗體的硝酸纖維素膜。所述包被D-二聚體抗體的硝酸纖維素膜按以下步驟制備而成：
(1)抗體的純化，D-二聚體包被抗體的純化與透析，將抗體原液在2℃下以11000r/min速度離心40分鐘，吸取上清液即為D-二聚體抗體；將該抗體裝入透析袋，用雙蒸水透析去除鹽分后，超濾濃縮后裝瓶冷凍，備用；
(2)用硼酸鹽緩沖液溶液稀釋上述抗體，得到1.0mg/ml的包被液；
(3)將包被液滴加至裁切好的硝酸纖維素膜上，每張膜片0.025ml，將膜片置于烘箱中干燥后即制成包被有D-二聚體抗體的硝酸纖維素膜。
所述膠體金標記D-二聚體抗體按以下步驟制備而成：
(1)膠體金的制備以質(zhì)量分數(shù)分別為3％氯金酸、3％檸檬酸三鈉、2.8％鞣酸、40mM K2CO3及雙蒸水為原料，先將3％氯金酸與雙蒸水按體積1∶86配成A液；將3％檸檬酸三鈉、2.8％鞣酸、40mMK2CO3與雙蒸水按體積比6∶0.05～0.98∶0.05～0.98∶16.04～18.99配成B液；再將所述A液加熱到64℃，B液加熱到56.5℃，攪拌A液，快速加入B液，繼續(xù)攪拌3分鐘，在7分鐘內(nèi)加熱至沸騰，制成膠體金液，該膠體金液顏色由黑→藍→紫→紅色時，制成直徑為10nm的膠體金顆粒；
(2)利用0.4M K2CO3調(diào)整所述膠體金液pH值為7.2后備用；
(3)D-二聚體抗體的制備與透析，將抗體在2℃下以11000r/min速度離心40分鐘，吸取上清液；將該抗原裝入透析袋，用雙蒸水透析去除鹽分后，裝瓶冷凍，備用；
(4)D-二聚體抗體標記膠體金，將步驟(3)D-二聚體抗原0.35mg，緩慢加入步驟(2)制備的110ml膠體金液中進行包被，攪拌15分鐘后，依次加入25％的迭氮鈉500μl、5％的牛血清白蛋白100μl，攪勻后在4.5℃，以7000r/min速度下離心20分鐘，去除上清液，即成D-二聚體抗體標記膠體金。
所述定標卡為D-二聚體梯度質(zhì)量濃度分別為0.1、0.3、1、2.5、5、10mg/L，并且該梯度質(zhì)量濃度檢測的信號與定標卡相對應(yīng)。
更進一步的，本發(fā)明還提供一種檢測D-二聚體(D-Dimer)斑點金滲濾試劑盒的定量檢測方法，按以下步驟操作：
(1)待檢人血漿的采集：用檸檬酸鈉抗凝的真空采血管采集血樣7ml，混勻，置室溫放置1h，以4000r/min速度離心20min，吸取上清液為待測樣本，冷凍備用；
(2)預(yù)封閉液加樣：用移液器準確吸取預(yù)封閉液，點在反應(yīng)盒圓孔內(nèi)硝酸纖維素膜面上；
(3)檢測樣本加樣：待預(yù)封閉液完全滲入后，用移液器準確吸取檢測樣本，點在反應(yīng)盒圓孔內(nèi)硝酸纖維素膜面上；
(4)滴加D-二聚體抗體標記膠體金：待檢測樣本滲入后，再往反應(yīng)盒膜面滴加D-二聚體抗體，所述膠體金標記D-二聚體抗體與所述檢測樣本的體積比為1：1.5；
(5)待D-二聚體抗體標記膠體金滲入后，再往反應(yīng)盒膜面上滴加洗滌液；所述洗滌液與所述檢測樣本的體積比為1：1.5；
(6)檢測并記錄結(jié)果：觀察反應(yīng)盒膜面，待洗滌液完全滲入膜面后，檢測D-二聚體層析器信號值，通過儀器結(jié)合定標卡信息計算檢測樣本D-二聚體濃度，即可定量判定其質(zhì)量濃度。
實施例2
一種檢測D-二聚體(D-Dimer)斑點免疫金滲濾試劑盒，包括pH值為6.7的預(yù)封閉液、pH值為6.2的洗滌液、膠體金標記D-二聚體抗體、D-二聚體層析器和定標卡；其中，所述預(yù)封閉液中Triton-100的濃度為0.6％、硼酸鹽緩沖液溶液的濃度為0.5mol/L；所述洗滌液中牛血清白蛋白(BSA)的濃度為0.6％、硼酸鹽緩沖液溶液的濃度為0.5mol/L。所述硼酸鹽緩沖液溶液由Na2B4O7·10H2O 1.0重量份、H3BO3 0.5重量份、NaCl 4.0重量份、KCl 0.1重量份、蒸餾水800ml重量份、牛血清白蛋白5重量份。
所述D-二聚體層析器設(shè)置有反應(yīng)盒，直徑為3.5cm的塑料小盒，分盒底和盒蓋兩部分，盒蓋頂面中央有一個上部直徑為0.8cm、下部直徑為0.4cm的小圓孔，盒內(nèi)墊滿吸水材料，在小圓孔下方和吸水材料上方之間放置一張1.5×1.5cm的包被有D-二聚體抗體的硝酸纖維素膜。所述包被D-二聚體抗體的硝酸纖維素膜按以下步驟制備而成：
(1)抗體的純化，D-二聚體包被抗體的純化與透析，將抗體原液在2℃下以10000r/min速度離心40分鐘，吸取上清液即為D-二聚體抗體；將該抗體裝入透析袋，用雙蒸水透析去除鹽分后，超濾濃縮后裝瓶冷凍，備用；
(2)用硼酸鹽緩沖液溶液稀釋上述抗體，得到1.0mg/ml的包被液；
(3)將包被液滴加至裁切好的硝酸纖維素膜上，每張膜片0.025ml，將膜片置于烘箱中干燥后即制成包被有D-二聚體抗體的硝酸纖維素膜。
所述膠體金標記D-二聚體抗體按以下步驟制備而成：
(1)膠體金的制備以質(zhì)量分數(shù)分別為3％氯金酸、3％檸檬酸三鈉、2.8％鞣酸、40mM K2CO3及雙蒸水為原料，先將3％氯金酸與雙蒸水按體積1∶86配成A液；將3％檸檬酸三鈉、2.8％鞣酸、40mMK2CO3與雙蒸水按體積比6∶0.05～0.98∶0.05～0.98∶16.04～18.99配成B液；再將所述A液加熱到62℃，B液加熱到55℃，攪拌A液，快速加入B液，繼續(xù)攪拌3分鐘，在5分鐘內(nèi)加熱至沸騰，制成膠體金液，該膠體金液顏色由黑→藍→紫→紅色時，制成直徑為8nm的膠體金顆粒；
(2)利用0.4M K2CO3調(diào)整所述膠體金液pH值為7.0后備用；
(3)D-二聚體抗體的制備與透析，將抗體在2℃下以10000r/min速度離心40分鐘，吸取上清液；將該抗原裝入透析袋，用雙蒸水透析去除鹽分后，裝瓶冷凍，備用；
(4)D-二聚體抗體標記膠體金，將步驟(3)D-二聚體抗原0.31mg，緩慢加入步驟(2)制備的110ml膠體金液中進行包被，攪拌15分鐘后，依次加入20％的迭氮鈉500μl、1％的牛血清白蛋白100μl，攪勻后在4.1℃，以7000r/min速度下離心20分鐘，去除上清液，即成D-二聚體抗體標記膠體金。
所述定標卡為D-二聚體梯度質(zhì)量濃度分別為0.1、0.3、1、2.5、5、10mg/L，并且該梯度質(zhì)量濃度檢測的信號與定標卡相對應(yīng)。
更進一步的，本發(fā)明還提供一種檢測D-二聚體(D-Dimer)斑點金滲濾試劑盒的定量檢測方法，按以下步驟操作：
(1)待檢人血漿的采集：用檸檬酸鈉抗凝的真空采血管采集血樣5.1ml，混勻，置室溫放置15min，以4000r/min速度離心20min，吸取上清液為待測樣本，冷凍備用；
(2)預(yù)封閉液加樣：用移液器準確吸取預(yù)封閉液，點在反應(yīng)盒圓孔內(nèi)硝酸纖維素膜面上；
(3)檢測樣本加樣：待預(yù)封閉液完全滲入后，用移液器準確吸取檢測樣本，點在反應(yīng)盒圓孔內(nèi)硝酸纖維素膜面上；
(4)滴加D-二聚體抗體標記膠體金：待檢測樣本滲入后，再往反應(yīng)盒膜面滴加D-二聚體抗體，所述膠體金標記D-二聚體抗體與所述檢測樣本的體積比為1：1.5；
(5)待D-二聚體抗體標記膠體金滲入后，再往反應(yīng)盒膜面上滴加洗滌液；所述洗滌液與所述檢測樣本的體積比為1：1.5；
(6)檢測并記錄結(jié)果：觀察反應(yīng)盒膜面，待洗滌液完全滲入膜面后，檢測D-二聚體層析器信號值，通過儀器結(jié)合定標卡信息計算檢測樣本D-二聚體濃度，即可定量判定其質(zhì)量濃度。
實施例3
一種檢測D-二聚體(D-Dimer)斑點免疫金滲濾試劑盒，包括pH值為6.7的預(yù)封閉液、pH值為6.2的洗滌液、膠體金標記D-二聚體抗體、D-二聚體層析器和定標卡；其中，所述預(yù)封閉液中Triton-100的濃度為10％、硼酸鹽緩沖液溶液的濃度為10mol/L；所述洗滌液中牛血清白蛋白(BSA)的濃度為10％、硼酸鹽緩沖液溶液的濃度為10mol/L。所述硼酸鹽緩沖液溶液由Na2B4O7·10H2O 3.0重量份、H3BO3 1.5重量份、NaCl 4.0重量份、KCl 0.1重量份、蒸餾水800ml重量份、牛血清白蛋白5重量份。
所述D-二聚體層析器設(shè)置有反應(yīng)盒，直徑為3.5cm的塑料小盒，分盒底和盒蓋兩部分，盒蓋頂面中央有一個上部直徑為0.8cm、下部直徑為0.4cm的小圓孔，盒內(nèi)墊滿吸水材料，在小圓孔下方和吸水材料上方之間放置一張1.5×1.5cm的包被有D-二聚體抗體的硝酸纖維素膜。所述包被D-二聚體抗體的硝酸纖維素膜按以下步驟制備而成：
(1)抗體的純化，D-二聚體包被抗體的純化與透析，將抗體原液在2℃下以13000r/min速度離心40分鐘，吸取上清液即為D-二聚體抗體；將該抗體裝入透析袋，用雙蒸水透析去除鹽分后，超濾濃縮后裝瓶冷凍，備用；
(2)用硼酸鹽緩沖液溶液稀釋上述抗體，得到1.0mg/ml的包被液；
(3)將包被液滴加至裁切好的硝酸纖維素膜上，每張膜片0.025ml，將膜片置于烘箱中干燥后即制成包被有D-二聚體抗體的硝酸纖維素膜。
所述膠體金標記D-二聚體抗體按以下步驟制備而成：
(1)膠體金的制備以質(zhì)量分數(shù)分別為3％氯金酸、3％檸檬酸三鈉、2.8％鞣酸、40mM K2CO3及雙蒸水為原料，先將3％氯金酸與雙蒸水按體積1∶86配成A液；將3％檸檬酸三鈉、2.8％鞣酸、40mMK2CO3與雙蒸水按體積比6∶0.05～0.98∶0.05～0.98∶16.04～18.99配成B液；再將所述A液加熱到69℃，B液加熱到58℃，攪拌A液，快速加入B液，繼續(xù)攪拌3分鐘，在9分鐘內(nèi)加熱至沸騰，制成膠體金液，該膠體金液顏色由黑→藍→紫→紅色時，制成直徑為12nm的膠體金顆粒；
(2)利用0.4M K2CO3調(diào)整所述膠體金液pH值為7.5后備用；
(3)D-二聚體抗體的制備與透析，將抗體在2℃下以133000r/min速度離心40分鐘，吸取上清液；將該抗原裝入透析袋，用雙蒸水透析去除鹽分后，裝瓶冷凍，備用；
(4)D-二聚體抗體標記膠體金，將步驟(3)D-二聚體抗原0.39mg，緩慢加入步驟(2)制備的110ml膠體金液中進行包被，攪拌15分鐘后，依次加入30％的迭氮鈉500μl、10％的牛血清白蛋白100μl，攪勻后在5.0℃，以7000r/min速度下離心20分鐘，去除上清液，即成D-二聚體抗體標記膠體金。
所述定標卡為D-二聚體梯度質(zhì)量濃度分別為0.1、0.3、1、2.5、5、10mg/L，并且該梯度質(zhì)量濃度檢測的信號與定標卡相對應(yīng)。
更進一步的，本發(fā)明還提供一種檢測D-二聚體(D-Dimer)斑點金滲濾試劑盒的定量檢測方法，按以下步驟操作：
(1)待檢人血漿的采集：用檸檬酸鈉抗凝的真空采血管采集血樣10ml，混勻，置室溫放置2h，以4000r/min速度離心20min，吸取上清液為待測樣本，冷凍備用；
(2)預(yù)封閉液加樣：用移液器準確吸取預(yù)封閉液，點在反應(yīng)盒圓孔內(nèi)硝酸纖維素膜面上；
(3)檢測樣本加樣：待預(yù)封閉液完全滲入后，用移液器準確吸取檢測樣本，點在反應(yīng)盒圓孔內(nèi)硝酸纖維素膜面上；
(4)滴加D-二聚體抗體標記膠體金：待檢測樣本滲入后，再往反應(yīng)盒膜面滴加D-二聚體抗體，所述膠體金標記D-二聚體抗體與所述檢測樣本的體積比為1：1.5；
(5)待D-二聚體抗體標記膠體金滲入后，再往反應(yīng)盒膜面上滴加洗滌液；所述洗滌液與所述檢測樣本的體積比為1：1.5；
(6)檢測并記錄結(jié)果：觀察反應(yīng)盒膜面，待洗滌液完全滲入膜面后，檢測D-二聚體層析器信號值，通過儀器結(jié)合定標卡信息計算檢測樣本D-二聚體濃度，即可定量判定其質(zhì)量濃度。
實施例4
實施例4與實施例3、實施例1和實施例2的區(qū)別在于，在膠體金標記D-二聚體抗體的制備步驟中，配制膠體金A液配方同上，所述配制膠體金B(yǎng)液的組分與含量為3％檸檬酸三鈉6.0ml、2.8％鞣酸0.05ml、40mM K2C030.05ml與雙蒸水16.04ml；制成的膠體金顆粒直徑為8.1＜D＜9.3nm；膠體金液pH值調(diào)為6.7；膠體金液與D-二聚體抗體的體積重量比為100ml∶0.30mg。
以上實施方式和實施例均需根據(jù)具體情況適度調(diào)節(jié)溫度和蒸餾水的使用量，本說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
對所公開的實施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。