本發(fā)明屬于農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域，涉及煙草及煙草制品中馬來(lái)酰肼殘留量的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
馬來(lái)酰肼又名抑芽單，是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，煙草生產(chǎn)中常用其抑制煙草側(cè)芽生長(zhǎng)，國(guó)外應(yīng)用比較廣泛。由于其在煙草大田生長(zhǎng)期的長(zhǎng)期多次施用，從而會(huì)導(dǎo)致其在初烤煙葉中的殘留, 煙葉中馬來(lái)酰肼的殘留會(huì)對(duì)吸煙者產(chǎn)生健康風(fēng)險(xiǎn)，國(guó)際煙草科學(xué)研究合作中心（CORESTA）將其納入煙草農(nóng)藥指導(dǎo)性殘留限量名單118名單）。
煙草中馬來(lái)酰肼殘留量的分析方法主要有分光光度法（ISO4876-1980），高效液相色譜法（HPLC，YC/T405.5-2011）、氣相色譜法（GC）和膠束液相色譜（MLC），煙草行業(yè)目前應(yīng)用較為廣泛的測(cè)定煙草中馬來(lái)酰肼殘留量的方法為HPLC-UV法（YC/T405.5-2011），此方法選取紫外檢測(cè)器，靈敏度較低，方法的前處理非常復(fù)雜，且選取的是外標(biāo)法定量，方法的準(zhǔn)確度相對(duì)較低，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性檢出現(xiàn)象。因此，準(zhǔn)確定量分析煙草及煙草制品中馬來(lái)酰肼具有較為重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
鑒于此，本發(fā)明目的在于提供一種準(zhǔn)確定量檢測(cè)馬來(lái)酰肼的方法，特別是測(cè)定煙草及煙草制品中馬來(lái)酰肼的方法。
發(fā)明人通過(guò)長(zhǎng)期的探索和嘗試，以及多次的實(shí)驗(yàn)和努力，不斷的改革創(chuàng)新，為解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是，提供一種煙草及煙草制品中馬來(lái)酰肼截留量的檢測(cè)方法，所述煙草及煙草制品包括煙葉和卷煙煙絲，包括以下步驟：
步驟a）配制標(biāo)準(zhǔn)溶液；
準(zhǔn)確稱取馬來(lái)酰肼標(biāo)準(zhǔn)品, 精確至0.0001g，用超純水溶解定容，制得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；
稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液得到標(biāo)準(zhǔn)工作液，儲(chǔ)存于棕色玻璃瓶中，冷凍保存?zhèn)溆茫?/p>
用超純水準(zhǔn)確配置氘代內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于棕色玻璃瓶中，冷凍保存；
取一定量的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用超純水稀釋定容，制得內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液；
標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液冷藏保存；
步驟b）鹽酸回流提?。?/p>
稱取試樣于圓底燒瓶中，加入鹽酸提取液，再加入內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液；將圓底燒瓶放置于加熱套或者油浴鍋中，圓底燒瓶上安裝球形冷凝管，加熱回流；控制回流速度，使蒸汽升至球形冷凝管第二球處，回流穩(wěn)定后開(kāi)始計(jì)時(shí)；
步驟c）分散固相萃取純化；
從圓底燒瓶中移取上清液于旋蓋離心管中，分別向離心管中加入N-丙基乙二胺吸附劑，漩渦振蕩混合，吸取上清液經(jīng)有機(jī)相濾膜過(guò)濾后用超純水稀釋定容待測(cè)；
步驟d）UPLC-MS/MS分析測(cè)定；
分別對(duì)前述工作液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，并對(duì)各標(biāo)樣峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值（y）和其濃度（x）進(jìn)行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；
色譜條件：Atiantis UPLC HSS T3超高效液相色譜柱，柱長(zhǎng)100 mm，內(nèi)徑2.1mm，粒徑1.8μm；流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液，流動(dòng)相B：體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸乙腈溶液；流速0.45 mL/min；柱溫45 °C；進(jìn)樣量2 μL；
梯度洗脫條件：0~2min，100%A~100%A；2~2.8min，100%A~30%A；2.8~3.0min，30%A~20%A；3.0~4.0min，20%A~5%A；4~6min，5%A~5%A；6~6.1min，5%A~100%A；6.1~8min，100%A~100%A；
質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，噴霧電壓（IS）：3.0 kV；離子化溫度500 ℃；霧化氣流量：800 L/Hr； 錐孔氣(cone)流量50 L/Hr； 碰撞氣流量為0.15 ml/min； 碰撞氣為氬氣，其余氣體為氮?dú)猓?駐留時(shí)間為100 msec，正離子MRM模式采集。
根據(jù)本發(fā)明煙草及煙草制品中馬來(lái)酰肼殘留量的檢測(cè)方法的一個(gè)具體實(shí)施方式，所述步驟a）中，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液為氘代內(nèi)標(biāo)，所述氘代內(nèi)標(biāo)為馬來(lái)酰肼-d2。
根據(jù)本發(fā)明煙草及煙草制品中馬來(lái)酰肼殘留量的檢測(cè)方法的一個(gè)具體實(shí)施方式，所述步驟b）中，稱取試樣的重量為5g，精確到0.01g。
根據(jù)本發(fā)明煙草及煙草制品中馬來(lái)酰肼殘留量的檢測(cè)方法的一個(gè)具體實(shí)施方式，所述步驟b）中，圓底燒瓶中加入鹽酸提取液體積為50mL,濃度為4mol/L，加入氘代內(nèi)標(biāo)體積為250 μL，濃度為0.2 mg/mL。
根據(jù)本發(fā)明煙草及煙草制品中馬來(lái)酰肼殘留量的檢測(cè)方法的一個(gè)具體實(shí)施方式，所述步驟b）中，加熱套的溫度為180℃。
根據(jù)本發(fā)明煙草及煙草制品中馬來(lái)酰肼殘留量的檢測(cè)方法的一個(gè)具體實(shí)施方式，所述步驟b）中，油浴鍋的溫度為150℃。
根據(jù)本發(fā)明煙草及煙草制品中馬來(lái)酰肼殘留量的檢測(cè)方法的一個(gè)具體實(shí)施方式，所述步驟b）中，加熱回流的時(shí)間為1h。
根據(jù)本發(fā)明煙草及煙草制品中馬來(lái)酰肼殘留量的檢測(cè)方法的一個(gè)具體實(shí)施方式，步驟c）中，所述離心管的體積為2 mL，加入PSA吸附劑的質(zhì)量為25mg。
根據(jù)本發(fā)明煙草及煙草制品中馬來(lái)酰肼殘留量的檢測(cè)方法的一個(gè)具體實(shí)施方式，所述步驟c）中，渦旋振蕩速率為2000 r/m，時(shí)間為2 min。
根據(jù)本發(fā)明煙草及煙草制品中馬來(lái)酰肼殘留量的檢測(cè)方法的一個(gè)具體實(shí)施方式，所述步驟d）中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.001X+0.0022，相關(guān)系數(shù)r=0.9995。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案中的一個(gè)技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn)：
a)本發(fā)明針對(duì)煙草抑芽劑馬來(lái)酰肼，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC–MS/MS），建立UPLC–MS/MS快速分析煙草及煙草制品中馬來(lái)酰肼殘留量的方法。選取的串聯(lián)質(zhì)譜，分離度和靈敏度都明顯高于標(biāo)準(zhǔn)方法（YC/T 405.5-2011）的紫外檢測(cè)器。
b)發(fā)明人在實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程中，嘗試了不同的萃取方式以及不同的萃取材料以及加入量，最終得到一個(gè)優(yōu)化的萃取方案。
c)發(fā)明人在實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程中，嘗試了多種UPLC和HPLC色譜柱，包括UPLC HSS T3，UPLC BEH Shield RP18，Hypercarb Porous Graphitic Carbon和Atlantis dC18等，最終選擇了UPLC HSS T3柱，配合本發(fā)明的流動(dòng)相體系，能夠獲得更好的分離度與峰形。
d)發(fā)明人嘗試了多種不同的流動(dòng)相體系，最終確定了0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈體系與UPLC HSS T3柱配合，能夠獲得更好的分離度與峰形。
e)發(fā)明人選用了適當(dāng)?shù)奶荻认疵摮绦蚴沟盟鑫宸N馬來(lái)酰肼完全分離，整個(gè)梯度洗脫時(shí)間為8 min，與標(biāo)準(zhǔn)方法相比顯著縮短了分析時(shí)間(20 min)。
附圖說(shuō)明
圖1是本發(fā)明樣品的選擇離子流色譜圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合一個(gè)具體實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。
1、試劑和儀器
馬來(lái)酰肼和馬來(lái)酰肼-d2標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)自于Labor Dr. Ehrenstorfer-Schafers（化學(xué)純度：≥98.5%，Augsburg，德國(guó)），甲酸 (HPLC級(jí)，德國(guó)Sigma公司)；甲醇，乙腈（色譜純，美國(guó)Thermo-Fisher公司），鹽酸（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司），N-丙基乙二胺（PSA）購(gòu)自安捷倫公司（美國(guó)），水為超純水。
超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Xevo TQ，美國(guó)Waters公司)，配備電噴霧電離源（ESI）；渦旋振蕩器（VtexMixer 230VeU，美國(guó)Labnet公司）。
2、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
準(zhǔn)確稱取10 mg的馬來(lái)酰肼標(biāo)準(zhǔn)品，精確至0.0001g, 用超純水溶解定容至10 mL，制得1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20℃保存。取一定量的所述標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用超純水稀釋定容，制得200 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。
準(zhǔn)確配置1.0 mg/mL馬來(lái)酰肼-d2內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。取一定量的所述內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用超純水稀釋定容，制得200 μg/mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。所有的工作液于冰箱-20℃保存，使用前將其恢復(fù)到室溫。
3、加熱回流萃取
稱取5 g試樣于容積為250mL的圓底燒瓶中，精確至0.01g。加入50 mL鹽酸提取液，加入250μL 200μg/mL氘代內(nèi)標(biāo)，適當(dāng)振搖或超聲，使煙末分散與鹽酸溶液混合均勻。將燒瓶放置于加熱套或者油浴鍋中，裝上球形冷凝管，加熱回流?？刂苹亓魉俣?，使蒸汽升至球形冷凝管第二球處，回流穩(wěn)定后開(kāi)始計(jì)時(shí)，回流1小時(shí)。作為優(yōu)選，將加熱套溫度設(shè)置為180℃，或者油浴鍋溫度設(shè)置為150℃，當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際回流情況作相應(yīng)調(diào)整?；亓鹘Y(jié)束后，關(guān)閉加熱套或油浴鍋電源，冷卻至室溫。
4、分散固相萃取凈化
移取1mL上清液于旋蓋離心管，加入25mgPSA吸附劑，漩渦振蕩混合2 min，2000 r/m，吸取上清液經(jīng)水機(jī)相濾膜過(guò)濾，移取500μL濾液，并用超純水稀釋定容到1mL后待測(cè)。
5、LC-MS/MS條件
色譜條件：Atiantis UPLC HSS T3超高效液相色譜柱，柱長(zhǎng)100 mm，內(nèi)徑2.1mm，粒徑1.8 μm；流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液；流動(dòng)相B：體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸乙腈溶液；流速0.45 mL/min；柱溫45 °C；進(jìn)樣量2 μL；
梯度洗脫條件：0~2min，100%A~100%A；2~2.8min，100%A~30%A；2.8~3.0min，30%A~20%A；3.0~4.0min，20%A~5%A；4~6min，5%A~5%A；6~6.1min，5%A~100%A；6.1~8min，100%A~100%A；
質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，噴霧電壓（IS）：3.0 kV；離子化溫度500 ℃；霧化氣流量：800 L/Hr; 錐孔氣(cone)流量50 L/Hr; 碰撞氣流量為0.15 ml/min; 碰撞氣為氬氣，其余氣體為氮?dú)? 駐留時(shí)間為100 msec，正離子MRM模式采集。監(jiān)測(cè)離子對(duì)及其相應(yīng)的碰撞能量（CE）見(jiàn)表1。
表 1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下馬來(lái)酰肼及其內(nèi)標(biāo)的部分質(zhì)譜參數(shù)
注：*為定量離子對(duì)。
4、標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限
分別移取標(biāo)準(zhǔn)工作液5μL，12.5μL，50μL，125μL，250μL和500μL標(biāo)準(zhǔn)工作液到7個(gè)10mL棕色容量瓶中，每個(gè)容量瓶移入25μL內(nèi)標(biāo)工作液（200μg/mL），配制成溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線?；|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制方法為分別移取500μL每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液于7個(gè)1.8mL旋蓋色譜瓶，加入500μL空白煙葉樣品萃取液，用超純水定容至1mL，馬來(lái)酰肼的線性范圍50ng/mL-5000ng/mL。分別對(duì)這些標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，并對(duì)各標(biāo)樣峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值（y）和其濃度（x）進(jìn)行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.001X+0.0022，相關(guān)系數(shù)r=0.9995。以3倍信噪比確定方法的檢出限，各種煙葉基質(zhì)中馬來(lái)酰肼的LOD范圍為0.624-987 ng/mL。
5、方法的回收率
選取不含馬來(lái)酰肼的煙葉樣品，向煙葉樣品中添加的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按照“樣品的提取和凈化”的方法處理樣品后上機(jī)檢測(cè)，然后計(jì)算樣品中馬來(lái)酰肼的回收率。每個(gè)水平測(cè)5次，得出馬來(lái)酰肼平均回收率在105.9－111.8％之間，RSD范圍為3.3%-9.1%。
本實(shí)施例對(duì)煙草中馬來(lái)酰肼殘留進(jìn)行快速分析，采用加熱回流法提取煙葉中的馬來(lái)酰肼，基質(zhì)分散固相萃取法凈化，氘代內(nèi)標(biāo)定量，UPLC-MS/MS分析檢測(cè)，總分析時(shí)間為8 min。建立的方法分析時(shí)間短，靈敏度高。