本發(fā)明屬于食品安全檢測技術領域，特別涉及一種乳及乳制品中營養(yǎng)強化劑的超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道離子阱質譜篩查方法。

背景技術：

營養(yǎng)強化劑是指為增強營養(yǎng)成分而加入食品中的天然的或者人工合成的屬于天然營養(yǎng)素范圍的物質，，經過強化處理的食品稱為強化食品。我國規(guī)定允許使用的營養(yǎng)強化劑包括GB14880和GB2760規(guī)定的種類。營養(yǎng)強化劑主要分為維生素類、不和飽和脂肪酸類、核苷與核苷酸類。在乳及乳制品中添加一定量的營養(yǎng)強化劑，能夠平衡營養(yǎng)成分，彌補營養(yǎng)素缺失。近幾年，人們對于乳及乳制品的安全問題越來越關注，外源性風險物質為影響乳及乳制品安全的一個重要方面越來越受到重視。營養(yǎng)強化劑為乳制品中一種常見食品添加物，根據《GB 14880-2012食品營養(yǎng)強化劑使用標準》與5個增補公告，添加維生素、礦物質、核苷與核苷酸、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)強化劑，起到平衡營養(yǎng)成分與彌補營養(yǎng)素缺失的作用。營養(yǎng)強化劑作為一種重要的食品添加劑，已經成為乳及乳制品工業(yè)技術進步和科技創(chuàng)新的重要推動力之一。然而，若強化劑量不適當，則會導致機體營養(yǎng)平衡遭到破壞，甚至因攝食過量引起中毒。

因此，有必要對營養(yǎng)強化劑的使用量進行控制和監(jiān)測。然而，目前用于乳及乳制品中外源性風險物質的高通量、快速檢測方法較少，前處理操作復雜，材料與設備成本高，僅限于幾種或一類化合物的快速檢測。近年來，QuEChERS廣譜提取方法的應用和通過儀器聯(lián)用使得乳及乳制品中外源性風險物質篩查分析技術迅速發(fā)展。本發(fā)明結合理論知識與實際情況，建立了乳及乳制品中甜營養(yǎng)強化劑的色譜質譜聯(lián)用高通量、快速篩查分析方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對上述現(xiàn)狀，提供了一種乳及乳制品中營養(yǎng)強化劑的超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道離子阱質譜篩查方法，該方法的主要優(yōu)勢為分辨率高、定性與定量結果準確、靈敏度高、質量精度高等，可應用于復雜基質的分析。

本發(fā)明是通過下述的技術方案來實現(xiàn)的：

一種乳及乳制品中營養(yǎng)強化劑的超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道離子阱質譜篩查方法，包括以下步驟：

1)利用QuEChERS方法對乳及乳制品的被測物樣品進行提取和凈化，得到被測物樣品的測試溶液；

2)運用超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道離子阱質譜儀對被測物樣品進行篩查，采用電噴霧離子源和Full MS/dd-MS²，F(xiàn)ull MS/vDIA，F(xiàn)ull MS/AIF三種掃描模式，得到被測物樣品完整的一級與二級質譜圖；

3)通過軟件對獲得的一級與二級質譜圖進行處理，提取出被測物樣品中營養(yǎng)強化劑化合物信息；

4)將營養(yǎng)強化劑標準譜庫中的營養(yǎng)強化劑化合物信息與被測物樣品的化合物信息進行比對，通過分析標準物質的色譜質譜信息進行最終判定結構與定量乳及乳制品中營養(yǎng)強化劑的組成。

作為本發(fā)明的進一步改進，步驟1)具體為：稱取已溶解的乳及乳制品于具塞聚苯丙烯離心管中，加入45℃±5℃的水，渦旋充分混勻使試樣完全分散，放入流動水中冷卻；加入體積百分數1％的乙酸-乙腈/水混合溶液，乙腈和水的體積比為84:16，渦旋混合后，加入無水硫酸鎂、陶瓷均質石、無水乙酸鈉，渦旋、振蕩提取處理后，將離心管置于離心機離心，取濾液于進樣小瓶中，加入8mmol/L甲酸銨水溶液及甲醇。

作為本發(fā)明的進一步改進，步驟2)具體為：通過超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道離子阱質譜的全掃描模式獲得一級質譜圖，提取離子流圖進行定量，通過可變的數據非依賴采集vDIA模式掃描得到二級質譜圖。

作為本發(fā)明的進一步改進，步驟3)具體為：通過分析二級質譜圖得到的碎裂片段數據，初步判斷該物質歸屬類別，繼而對該保留時間色譜峰的其他片段信息進行分析，包括質荷比、片段豐度比與同位素豐度比，從而推斷出該物質結構和元素組成。

作為本發(fā)明的進一步改進，步驟4)中的標準譜庫是按照以下步驟建立的：

1)配制營養(yǎng)強化劑標準品的標準溶液；

2)運用超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道離子阱質譜儀對營養(yǎng)強化劑標準品的標準溶液進行篩查，采用電噴霧離子源和Full MS/dd-MS²，F(xiàn)ull MS/vDIA，F(xiàn)ull MS/AIF掃描模式，得到標準溶液完整的一級與二級質譜圖；

3)通過軟件對獲得的一級與二級質譜圖進行處理，提取出標準溶液的信息，建立營養(yǎng)強化劑的標準譜庫。

作為本發(fā)明的進一步改進，超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道離子阱質譜儀的色譜條件為：

色譜柱：Accucore C-18 aQ預柱，10mm×2.1mm，1.9μm，Hypersil Gold aQ C-18柱，100mm×2.1mm，1.9μm；柱溫：35-40℃；流動相：A為體積百分數0.1％甲酸與4mmol/L甲酸銨的水溶液，流動相B為體積百分數0.1％甲酸與4mmol/L甲酸銨的甲醇溶液；

梯度洗脫程序：0min，100％A；1min，100％A；7min，0％A；12min，0％A；13min，100％A；13-15min，100％A；流速為300μL/min；進樣量5-10μL；碰撞氣：氬氣；

電噴霧離子化離子源：單一正模式或負模式；鞘氣流速：18-19L/min；鞘氣壓力：275Kpa；輔助氣流速：3-4L/min；毛細管電壓：負離子模式3000V，正離子模式3500V；離子源溫度：230-250℃；毛細管溫度：320-330℃。

作為本發(fā)明的進一步改進，超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道離子阱質譜儀的質譜條件為：

采用Full MS/vDIA掃描模式，一級質譜掃描分辨率為70000FWHM；自動增益控制目標值設定為一百萬；最大注入時間250ms；容許的質量誤差范圍為5ppm；動態(tài)背景扣除10.0s；

二級質譜掃描參數：掃描時間：0-15min；分辨率：17500FWHM；自動增益控制的目標值定為五十萬；最大注入時間120ms；112.80116-487.97169為第一個vDIA，隔離窗口范圍設為25.0Da，Loop Count16；550.50011-850.63654為第二個vDIA，動態(tài)背景扣除10.0s，隔離窗口范圍設為100.0Da，Loop Count16；碰撞能量分別為17.5eV；35.0eV；52.5eV。

相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明先通過QuEChERS方法對乳及乳制品樣品進行提取和凈化，然后采用超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道離子阱質譜法檢測乳及乳制品中營養(yǎng)強化劑，最后通過標準譜庫進行比對，最終判定結構與定量乳及乳制品中營養(yǎng)強化劑的組成。本發(fā)明的篩選方法，可以一次性定量、定性檢測多種物質(23種營養(yǎng)強化劑)，并且具有操作簡單，精度高、分辨率高、定性與定量結果準確、靈敏度高、質量精度高等優(yōu)勢，可應用于復雜基質的分析。尤其是，Q-Orbitrap(超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道離子阱質譜儀)的分辨率高，在確保痕量化合物靈敏度下，分辨率可達7萬；質量精度高，可以使用外標法，無需內標，長時間的質量精度不下降；靈敏度高，檢測離子回旋共振的頻率，并不需要額外的檢測器；動態(tài)范圍寬，達五個數量級；具有快速正負切換掃描模式，極大節(jié)省分析時間，提高分析通量；穩(wěn)定性高，只需一周校正一次；定量能力高，可以和三重四極桿相比較；質量范圍廣，可進行多肽分析；另外，Q-Orbitrap的儀器操作簡便，運行成本低，可應用于復雜基質的分析。結果表明：23種營養(yǎng)強化劑在線性范圍內具有良好的線性關系，相關系數均大于0.99，高(4×CCβ)、中(2×CCβ)、低(1×CCβ)三個添加水平下，基質的加標回收率達到82％-112％，重復實驗6次，其相對標準偏差為0.3％-6.3％。確定限(CCα)和檢測容量(CCβ)分別為0.1μg/kg-1.91μg/kg與0.17μg/kg-3.18μg/kg。

利用優(yōu)化后的QuEChERS方法對乳及乳制品樣品進行提取和凈化，簡單快捷，效率高，可以有效的排除其中雜質對后續(xù)檢測的干擾。

【附圖說明】

圖1為四級桿-軌道離子阱質譜儀Full MS/vDIA掃描模式圖。

【具體實施方式】

本發(fā)明提供了一種乳及乳制品中營養(yǎng)強化劑的超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道離子阱質譜篩查方法，其特征在于：該方法所用到的設備包括超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道離子阱質譜儀。包括以下步驟：

首先，配制基質溶液和標準溶液；利用已優(yōu)化的QuEChERS方法對乳及乳制品樣品進行提取和凈化；

其次，運用超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道離子阱質譜(Q-Orbitrap)進行篩查，采用電噴霧離子源(ESI)和全掃描/數據依賴采集(Full MS/dd-MS²)，全掃描/可變的數據非依賴采集(Full MS/vDIA)，全掃描/全離子碎裂采集(Full MS/AIF)三種掃描模式，得到完整的一級與二級質譜圖。

再次，運用Exact Finder 2.5軟件對獲得的一級與二級質譜圖進行處理，提取出化合物信息。

最后，將已建立營養(yǎng)強化劑譜庫中的信息與被測物的信息進行比對，包括提取流色譜的保留時間，分子離子峰與其碎裂離子峰豐度比，分子離子峰與碎裂離子峰的精確質量數，分子離子峰與同位素離子峰豐度比，確證乳及乳制品中營養(yǎng)強化劑的組成。

下面結合附圖，對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細闡述，但本發(fā)明不限于該實施例。為了使公眾對本發(fā)明有徹底的了解，在以下本發(fā)明優(yōu)選實施例中詳細說明具體的細節(jié)。

1.色譜質譜分析條件

主要儀器：美國Thermo Fisher Scientific公司的超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道離子阱質譜，配有電噴霧離子源。

(1)色譜條件

色譜柱：Accucore C-18 aQ預柱(10mm×2.1mm，1.9μm，美國Thermo Fisher Scientific公司)，Hypersil Gold aQ C-18柱(100mm×2.1mm，1.9μm，美國Thermo Fisher Scientific公司)；柱溫：35℃；流動相：A為0.1％(v/v)甲酸與4mmol/L甲酸銨水溶液，流動相B為0.1％(v/v)甲酸與4mmol/L甲酸銨甲醇溶液。梯度洗脫程序：0min，100％A；1min，100％A；7min，0％A；12min，0％A；13min，100％A，13-15min，100％A；流速為300μL/min；進樣量5μL；碰撞氣：高純氬氣(純度≥99.999％)。電噴霧離子化(ESI)離子源：單一正模式或負模式；鞘氣流速：18L/min；鞘氣壓力：275Kpa；輔助氣流速：3L/min；毛細管電壓：負離子模式3000V，正離子模式3500V；離子源溫度：50℃；毛細管溫度：320℃。

(2)質譜條件

采用Full MS/vDIA掃描模式。一級質譜掃描分辨率為70000FWHM；自動增益控制目標值設定為一百萬；最大注入時間250ms；容許的質量誤差范圍為5ppm；動態(tài)背景扣除10.0s。

二級質譜掃描參數：掃描時間，0-15min；分辨率：17500FWHM；自動增益控制的目標值定為五十萬；最大注入時間120ms；112.80116-487.97169為第一個vDIA，隔離窗口范圍設為25.0Da，Loop Count16；550.50011-850.63654為第二個vDIA，動態(tài)背景扣除10.0s，隔離窗口范圍設為100.0Da，Loop Count16。碰撞能量分別為17.5eV；35.0eV；52.5eV。

表1列出了23種營養(yǎng)強化劑標準物質的電離模式與保留時間等信息；表2列出了23種營養(yǎng)強化劑標準數據庫部分內容。

表1 23種營養(yǎng)強化劑標準物質信息

表2 23種營養(yǎng)強化劑超高效液相色譜/四級桿-軌道離子阱質譜參數

2.溶液配制

(1)標準溶液的配制

分別稱取適量的營養(yǎng)強化劑標準品10mg(精確至0.1mg)，置于10mL于容量瓶內，依據標準物質在不同溶劑(甲醇、乙腈和甲苯)中溶解度與測定需要，選用合適的溶劑溶解，定容至10mL，配制成單一化合物標準儲備液，于-20℃避光保存。移取單一化合物標準儲備液于100mL容量瓶中，用甲醇-水溶液(1:1，v/v)稀釋并定容至刻度，配制相應濃度的標準物質混合工作溶液?；鞓斯ぷ饕河谧厣荛]瓶-20℃避光保存。

(2)基質匹配溶液的配制

移取12份各5mL乳及乳制品空白樣品(實驗前測定)提取液于10mL容量瓶中，運用真空氮氣吹干儀吹至近干，分別加入1000μg/L的營養(yǎng)強化劑標準品混合溶液10μL、20μL、40μL、80μL、100μL、200μL、400μL、800μL、1000μL、2000μL、4000μL、5000μL于容量瓶中，各加入甲醇5mL，用8mmol/L甲酸銨水溶液稀釋并定容至刻度，配制成1μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、80μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、500μg/L相應的基質匹配標準溶液。基質匹配標準溶液應現(xiàn)用現(xiàn)配。

3.樣品的前處理

稱取已溶解的嬰幼兒配方乳粉1.5g(精確到0.01g)于50mL具塞聚苯丙烯離心管中，加入10mL 45℃±5℃的水，渦旋充分混勻使試樣完全分散，放入流動水中冷卻。加入10mL 1％(v/v)乙酸-乙腈/水(84:16，v/v)混合溶液，渦旋混合30s。加入6.0g無水硫酸鎂、陶瓷均質石、1.45g無水乙酸鈉，渦旋30s，振蕩提取1min。將離心管置于離心機，溫度設定為4℃，以10000r/min離心5min，取200μL濾液于2mL進樣小瓶中，加入500μL 8mmol/L甲酸銨水溶液及300μL甲醇。運用超高效液相色譜-四級桿-軌道離子阱質譜進行測定。

4.分析結果

(1)方法的建立

運用超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道離子阱質譜進行篩查，采用電噴霧離子源和Full MS/dd-MS²，F(xiàn)ull MS/vDIA，F(xiàn)ull MS/AIF掃描模式，通過超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道離子阱質譜的全掃描模式獲得一級譜圖，提取離子流圖進行定量，通過可變的數據非依賴采集vDIA模式掃描得到二級譜圖。二級掃描在全掃描的基礎上得到了更具針對性的碎裂片段數據，即可初步判斷該物質歸屬類別，繼而對該保留時間色譜峰的其他片段信息進行分析，包括質荷比、片段豐度比與同位素豐度比，從而推斷出該物質結構和元素組成。將該物質推斷的片段斷裂途徑與已建立的營養(yǎng)強化劑標準信息譜庫中歸屬類的其他化合物斷裂途徑比對，判斷該化合物的分子式與結構式，通過分析標準物質的色譜質譜信息進行最終判定與定量。

(2)方法學驗證

a方法的標準曲線、線性范圍及相關系數

配制23種營養(yǎng)強化劑系列混合標準物質溶液，濃度為0.1μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、4μg/kg、8μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、40μg/kg、80μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、400μg/kg、500μg/kg。結果表明，檢測方法中23種營養(yǎng)強化劑在其相應的濃度范圍內，相關系數(r²)均大于0.99，呈良好的線性關系。

b方法的定量下限、加標回收率與精密度

CCα的測定采用校準曲線法，CCα等于能觀察到響應時縱坐標軸上的濃度值加對應的重現(xiàn)性標準偏差的2.33倍。CCβ為CCα的值加CCα取值時重現(xiàn)性標準偏差的1.64倍。確定限(CCα)和檢測容量(CCβ)分別為0.1μg/kg-1.91μg/kg與0.17μg/kg-3.18μg/kg。

精密度通過統(tǒng)計6次平行實驗回收率結果的相對標準偏差得到，將待測物提取凈化后，運用四級桿-軌道離子阱質譜檢測，計算23種營養(yǎng)強化劑的平均回收率與相對標準偏差。回收率與相對標準偏差結果分別為82％-112％和0.3％-6.3％，所建立的方法準確性和精密度良好。下述表3列出了巴氏殺菌乳中營養(yǎng)強化劑的方法學參數。

表3嬰幼兒配方乳粉中營養(yǎng)強化劑的線性范圍、確定限、檢測容量、相關系數、平均回收率及精密度(n＝6)

本發(fā)明的篩查對象為196個批次巴氏殺菌乳、超高溫瞬時滅菌乳、含乳飲料、發(fā)酵乳、稀奶油和嬰幼兒配方乳粉。

圖1為可變的數據非依賴采集Variable Data Independent Acquisition(vDIA)，在非依賴采集模式的基礎上進行改進，根據目標物質所分布的質荷比范圍，調整各個“窗口”的大小，同時滿足選擇性與掃描速度的要求。一個循環(huán)包括1次全掃描和20個通道的碎片掃描，因待分析物質中95％以上的質荷比分布于87.0-500.0，第一個vDIA掃描通過信息列表將質荷比87.80116-512.97169設定為以下16個通道：112.80116、137.81253、162.82390、187.83527、212.84663、237.85800、262.86937、287.88074、312.89211、337.90348、362.91485、387.92622、412.93758、437.94895、462.96032、487.97169。隔離窗口范圍(Isolation Window)設為25.0Da，112.80116掃描范圍為質荷比87.80116-137.80116(112.80116±25.0)。其他5％待分析化合物質荷比分布于500.0-900.0，第二個vDIA掃描通過信息列表將質荷比500.50011-900.97169設定為以下4個通道：550.50011、650.54559、750.59106、850.63654，隔離窗口范圍(IsolationWindow)設為100.0Da。Full MS/Variable Data Independent Acquisition掃描的本質為將全掃描的部分時間用于碎裂片段掃描，1.8s完成一次掃描循環(huán)，1個循環(huán)得到一張分子離子全掃圖，20張碎裂片段掃描圖，此模式不丟失質譜信息，全掃描與二級碎裂片段均形成輪廓圖用于定性與定量，且信息列表不需要根據待分析物進行調整，即質譜條件一致，樣品經一次進樣測定后可運用分析軟件針對不同待分析物多次分析，數據易溯源，有更好的數據完整性與通量。

本發(fā)明在實驗中采用一針進樣方式完成篩查過程中的篩選、確證、定量以滿足高通量、快速分析的監(jiān)控要求。篩選過程中，峰面積閾值設定為可變的數據非依賴采集掃描模式對分子離子峰碎裂閾值的響應強度8.3×10⁴，信噪比設定為國家標準中乳及乳制品中相關外源性物質質譜法測定的定量限規(guī)定值10，勾選已建立的乳及乳制品中營養(yǎng)強化劑標準數據庫，保留時間提取窗口設定為保留時間±3倍保留時間漂移標準偏差。提取色譜峰質荷比允許最大質量偏差設定為3ppm。當運用設定的保留時間與質荷比質量偏差提取窗口提取到響應強度大于等于8.3×10⁴色譜峰時，樣品初步判斷為陽性樣品，進行下一步確證工作，若在上述條件下沒有提取到色譜峰，初步判斷樣品為陰性。將初步判斷為陰性的樣品進行特征斷裂片段的提取與分析，對未知目標物質進行篩查分析，進而得出結論。確證工作主要通過同位素離子峰信息與二級碎裂片段豐度比兩個方面進行，并解決了同分異構體色譜共流出的確證難點，將具有M+1特征的¹³C，與具有M+2特征的³⁴S、⁸¹Br、³⁷Cl的同位素離子峰豐度比應用于確證步驟。

目前對于乳及乳制品中營養(yǎng)強化劑高通量快速篩查技術的研究仍為空白。用于乳及乳制品中營養(yǎng)強化劑殘留的高通量、快速檢測方法較少，前處理操作復雜，材料與設備成本高，僅限于幾種或一類化合物的快速檢測，多殘留快速分析時往往根據化合物的結構特點將化合物分組后檢測。近年來，QuEChERS廣譜提取方法的應用和通過儀器聯(lián)用使得乳及乳制品中外源性風險物質篩查分析技術迅速發(fā)展。本文針對上述現(xiàn)狀，運用高分辨質譜四級桿靜電場軌道離子阱質譜，并結合化學計量學對QuEChERS前處理條件優(yōu)化與定量數據分析，針對與人們生活息息相關的巴氏殺菌乳、超高溫瞬時滅菌乳、稀奶油、發(fā)酵乳與嬰幼兒配方乳粉，建立了外源性風險物質色譜質譜聯(lián)用高通量、快速篩查分析方法。

以乳及乳制品復雜基質為模型，建立了外源性風險物質已知目標物質篩查分析方法。以系統(tǒng)的方法學參數考察方案-歐盟標準2002/657/EC與SANCO/12571/2013，對運用超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道離子阱質譜，建立的乳及乳制品中營養(yǎng)強化劑的篩查分析方法進行考核，所有庫內潛在目標化合物在線性范圍內具有良好的線性關系，相關系數均大于0.99，高、中、低三個添加水平下，回收率達到82％-112％，重復實驗6次，其相對標準偏差為0.3％-6.3％。確定限(CCα)和檢測容量(CCβ)分別為0.1μg/kg-1.91μg/kg與0.17μg/kg-3.18μg/kg，優(yōu)于中國、日本、美國和歐盟等國家和有關國際組織規(guī)定的限量要求，靈敏度與精確度較國標方法提高5倍以上。

以上僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非僅限于本發(fā)明的實施范圍，凡依本發(fā)明專利范圍的內容所做的等效變化和修飾，都應為本發(fā)明的技術范疇。