本發(fā)明屬于化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一種氧化石墨烯輔助的SERS活性基底表面清潔方法。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)功能的基礎(chǔ)，測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)研究的重要組成部分。了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)對(duì)于認(rèn)識(shí)、利用和改造蛋白質(zhì)都具有十分重要的意義。血清蛋白的濃度長期以來一直被視為健康和疾病的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。它具有結(jié)合和運(yùn)輸內(nèi)源性和外源性物質(zhì)，維持血液膠體滲透壓，清除自由基，抑制血小板聚集和抗凝血等生理功能。與其他蛋白相比，血清白蛋白分子量小、溶解度大、穩(wěn)定性較好且容易較大量、高純度制備。因此血清白蛋白是研究高分子蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、生物學(xué)功能、體內(nèi)代謝、臨床應(yīng)用及遺傳變異等方面的理想蛋白質(zhì)，在生物學(xué)和臨床上均有重要意義。

利用增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)可直接分析水相生物分子的結(jié)構(gòu)狀態(tài)且用量少，與其他方法相比有著明顯的優(yōu)勢(shì)。更多的研究表明利用增強(qiáng)拉曼光譜手段很好地解決了生物化學(xué)、生物物理和分子生物學(xué)中的諸多問題。不僅如此，越來越多的科研人員也已經(jīng)嘗試?yán)迷鰪?qiáng)拉曼光譜技術(shù)的非破壞性和指紋式的分辨能力研究蛋白質(zhì)及其之間的相互作用，并取得了一定的成果。但是其獲得的拉曼光譜的重現(xiàn)性和重復(fù)性不高，主要原因：實(shí)驗(yàn)操作過程繁雜；加入電解質(zhì)和離心過程會(huì)對(duì)基底材料的造成大的團(tuán)聚而不能形成適用于目標(biāo)分子有效的“熱點(diǎn)”。尤其是表面活性劑本身的信號(hào)嚴(yán)重干擾檢測(cè)，且會(huì)屏蔽蛋白質(zhì)與基底的接觸，導(dǎo)致無法測(cè)得蛋白質(zhì)信號(hào)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種氧化石墨烯輔助的SERS活性基底表面清潔方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種氧化石墨烯輔助的SERS活性基底表面清潔方法，包括下列步驟：

將氧化石墨烯溶膠和銀溶膠均勻混合，超聲下加入NaCl溶液，控制NaCl在混合溶液中的最終濃度為0.01～0.05M，銀在混合溶液的最終濃度為0.1～0.5g/L，氧化石墨烯在混合溶液的最終濃度為0.01～0.1g/mL，得到表面增強(qiáng)拉曼光譜的微團(tuán)聚的基底材料；向基底材料中加入HCl溶液調(diào)節(jié)pH值2.5～3.5。

上述步驟中，銀溶膠的制備采用檸檬酸還原法，將硝酸銀和檸檬酸三鈉混合后煮沸5～8min，后降溫至92±2℃加熱50～90min，得到銀溶膠。

上述步驟中，氧化石墨烯溶膠的制備采用兩次氧化法得到氧化石墨烯溶膠。

上述步驟中，向基底材料中加入HCl溶液調(diào)節(jié)pH≈3。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的最大亮點(diǎn)在于超聲條件下依次加入的少量的鹽酸鹽溶液和鹽酸具有協(xié)同效應(yīng)，能降低GO和貴金屬納米粒子表面的帶電層，使得貴金屬納米粒子沉積到GO上，同時(shí)，又能夠快速清潔貴金屬納米材料表面的活性劑檸檬酸根離子，這樣GO代替檸檬酸根離子作為“新型表面活性劑”能夠較好地保持貴金屬納米粒子的穩(wěn)定性，而貴金屬粒子表面裸露出的部分能夠直接與待檢測(cè)的蛋白質(zhì)分子等相作用，從而避免了表面活性劑的干擾，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)等生物分子的免標(biāo)記檢測(cè)。此方法操作簡單，成本低廉和較好的SERS效果等優(yōu)點(diǎn)，為后續(xù)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能及疾病的診斷研究提供了重復(fù)性非常好的方法。

附圖說明

圖1是本發(fā)明制備的改進(jìn)型銀溶膠的TEM圖。

圖2是本發(fā)明制備的改進(jìn)型銀溶膠的UV-vis圖。

圖3是本發(fā)明所述的GO輔助清潔SERS活性基底的TEM圖。

圖4是利用本發(fā)明清潔后的基底材料檢測(cè)牛血清蛋白得到的表面增強(qiáng)拉曼圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍做出更為清楚明確的界定。

本發(fā)明的機(jī)理是：在超聲條件下，依次加入的少量的鹽酸鹽溶液和鹽酸具有協(xié)同效應(yīng)，能降低GO和貴金屬納米粒子表面的帶電層，使得貴金屬納米粒子沉積到GO上，同時(shí)，又能夠快速清潔貴金屬納米材料表面的活性劑檸檬酸根離子，這樣GO代替檸檬酸根離子作為“新型表面活性劑”能夠較好地保持貴金屬納米粒子的穩(wěn)定性，而貴金屬粒子表面裸露出的部分能夠直接與待檢測(cè)的蛋白質(zhì)分子等相作用，從而避免了表面活性劑的干擾，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)等生物分子的免標(biāo)記檢測(cè)。

本發(fā)明所述的氧化石墨烯輔助的SERS活性基底表面清潔方法，包括如下步驟：

1)改進(jìn)型銀溶膠的合成：本方法是對(duì)Lee和Meisel的合成方法的改進(jìn)；具體過程是：電熱套加熱盛有220mL去離子水的三口燒瓶，待溶液沸騰后用移液槍移取1.5mL濃度為30mg/mL的AgNO₃溶液至燒瓶中，等待溶液重新沸騰后，快速加入4.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的新制的檸檬酸鈉溶液，劇烈攪拌回流，5分鐘后，溶液顏色由無色變?yōu)闇\黃色，快速加入20mL 20℃蒸餾水，控制電熱套溫度，使溶液內(nèi)溫度為92±2℃，繼續(xù)回流反應(yīng)1h，冷卻后定容至250mL，最后所得溶液為橙綠色,記為改進(jìn)AgNPs，其TEM圖和UV-vis圖分別見圖1和圖2。從Ag的UV-Vis譜圖可以看出改進(jìn)型銀溶膠只在419nm處有一個(gè)強(qiáng)的吸收峰，是銀顆粒表面等離子共振產(chǎn)生的，峰型尖銳，說明銀納米粒子尺寸和形貌比較均勻。從TEM可以看出，改進(jìn)法制備的AgNPs顆粒形貌比較均勻，呈球形或類球形，沒有棒狀銀存在，尺寸在30-40nm之間，分散性良好。

2)采用改進(jìn)的Hummers法制備GO：兩次氧化法。首先將石墨粉過400目的篩子。預(yù)氧化：將10g K₂S₂O₈和10g P₂O₅加入到3L三口燒瓶中，在1min內(nèi)快速加入60mL濃硫酸，不斷攪拌并加熱至80℃。待燒瓶內(nèi)白煙消失后，用鑰匙緩慢加入過篩的石墨粉20g(前5g非常緩慢)，加熱攪拌6h，反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，抽濾洗滌至pH為7左右；得到蓬松狀的濾餅，濾餅在室溫下干燥一夜。二次氧化：將460mL濃硫酸加入到3L三口燒瓶中，并處于0℃冰浴環(huán)境下，緩慢加入濾餅，保持溫度小于20℃，攪拌1h，使濾餅均勻擴(kuò)散。然后緩慢加入60g KMnO₄，每次小半勺，每次間隔6s。加入完成后，升溫至35℃，反應(yīng)2h，溶液開始逐漸變粘稠。分多次加入920mL的蒸餾水，然后快速升溫至98℃，攪拌15min，轉(zhuǎn)移溶液至5L的燒杯中，在攪拌下加入50mL 30％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的H₂O₂，然后加入2.8L的去離子水終止反應(yīng)，所得溶液為亮黃色。抽濾，用稀鹽酸(V_HCl:V_H2O＝1:10)洗滌；然后再用去離子水洗滌至用BaCl₂溶液檢驗(yàn)濾液無白色沉淀為止(檢測(cè)SO₄^2-)，得到的濾餅用蒸餾水溶解后，用透析膜透析，每天更換清水，直至pH為7。將透析好的氧化石墨烯配制成一定濃度的溶液，在大功率超聲儀下振蕩3h，使得石墨烯片碎化為小片。最后通過紫外-可見光譜儀測(cè)試吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，將石墨烯濃度定量至0.5mg/mL，備用。

3)GO輔助清潔SERS活性基底：a.分別取2mL的銀溶膠和0.2mL的氧化石墨烯，在容量為10mL的試劑瓶中均勻混合，超聲條件下加入0.1mL濃度為0.55M的NaCl溶液，向微團(tuán)聚懸浮性基底材料中加入HCl，在GO輔助的條件下實(shí)現(xiàn)SERS活性基底表面快速清潔(溶液最終pH在2.5～3.5之間)，得到清潔后的基底材料，其TEM圖見圖3?？梢钥闯?，加入的少量的鹽酸鹽溶液和鹽酸具有協(xié)同效應(yīng)，不僅能清潔納米銀顆粒表面的活性劑檸檬酸根離子，而且能同時(shí)降低GO和貴金屬納米粒子表面的帶電層，使得貴金屬納米粒子沉積到GO上。形成活性基底材料。

4)將待測(cè)血清溶液加入基底溶液中混合均勻，拉曼光譜檢測(cè)。得到了牛血清蛋白的表面增強(qiáng)拉曼圖譜，同時(shí)，也做了清潔后的活性基底材料的表面增強(qiáng)拉曼圖譜，如圖4?？梢钥闯觯尤氲纳倭康柠}酸鹽溶液和鹽酸具有協(xié)同效應(yīng)，能夠有效地清除納米銀顆粒表面的活性劑檸檬酸根粒子，形成的活性基底材料能夠有效地吸附牛血清蛋白質(zhì)分子，并產(chǎn)生良好的牛血清蛋白的SERS信號(hào)。

以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。