本發(fā)明涉及微電極生物傳感技術(shù)，具體地說，涉及一種原位活體檢測植物miRNA的微電極生物傳感器及其應用。

背景技術(shù)：

植物microRNA(miRNA)是一類重要的具有調(diào)控作用的小分子，它是一種非編碼RNA，長約20～25個核苷酸。研究結(jié)果表明，miRNA在高等植物中普遍存在。miRNA的靶基因很多都是植物中起著重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，miRNA通過對這些靶基因的調(diào)節(jié)，在植物生長發(fā)育、激素響應、抗逆抗病等多個方面起到了至關(guān)重要的作用。例如在白菜受蕪菁花葉病毒侵染后，可誘導產(chǎn)生miR1885，miR1885通過調(diào)控生長素受體—核苷酸綁定位點—亮氨酸富集區(qū)(TIR-NBS-LRR)類抗病基因介導了白菜抵御病毒侵染的過程。在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)miRNA可以通過阻斷生長素信號傳導途徑，提高植株對細菌侵染疾病的抗性。

目前miRNA的檢測方法主要有高通量測序、定量PCR等。高通量方法有助于獲得樣本中所有miRNA的總體表達圖譜，但檢測過程較為復雜，并且靈敏度低，難以實現(xiàn)標準化。定量PCR方法靈敏度較高，并且檢測范圍較寬，但是miRNA樣品的準備要求較高的實驗技術(shù)，并且需要昂貴的信號讀出設備，因此具有一定的局限性?，F(xiàn)有的幾種檢測方法均為離體取樣，需要損壞植物材料，經(jīng)過復雜的處理過程提取其中的RNA樣品，樣本處理過程中會造成RNA樣品的大量丟失。如植物材料較為珍貴，則其損壞會對科學研究造成巨大損失。并且隨著研究的深入，人們希望獲得植物活體內(nèi)這些調(diào)控分子的即時信息，從而更加準確、清晰的了解植物的生理變化規(guī)律。而目前還沒有對植物體內(nèi)miRNA進行原位活體檢測的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有檢測技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種基于生物傳感技術(shù)的植物miRNA的原位活體檢測方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中離體取樣檢測、處理過程復雜、對植物樣本破壞較大等缺陷。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供的一種活體在線檢測植物miRNA的微電極生物傳感器具有三電極體系，包括Ag/AgCl的參比電極，鉑對電極，金工作電極，所述金工作電極上電沉積金納米粒子，并修飾有能識別目標miRNA的DNA探針。電極裸露導電部分長3-10mm。

所述金納米粒子直徑為10-50nm。優(yōu)選金納米粒子直徑為10-30nm。

所述DNA探針是指末端巰基化的DNA探針。用于miRNA識別的DNA探針序列根據(jù)目標miRNA序列進行設計，保證傳感器檢測的特異性。

修飾方法為滴涂有能識別目標miRNA的DNA探針-亞甲基藍復合物。

進一步地，所述能識別目標miRNA的DNA探針-亞甲基藍復合物的制備方法為：將DNA探針序列放入10^-4-10^-5M的亞甲基藍溶液中10-20min，形成DNA-亞甲基藍復合物。

本發(fā)明將能識別目標miRNA的DNA探針-亞甲基藍復合物滴涂到沉積了金納米粒子的金工作電極表面，室溫放置8-16h，固定DNA探針，后用去離子水沖洗掉未吸附的DNA探針分子。

本發(fā)明含有上述金工作電極的微電極生物傳感器的電極外觀具有穿透植物組織的能力，長度為30-50mm，電極裸露導電部分長3-10mm。

本發(fā)明提供了上述微電極生物傳感器在原位活體檢測植物miRNA中的應用。

檢測部位為植物的根、莖、葉或果實。

所述植物為農(nóng)作物、花卉、蔬菜、林木等。檢測目標材料是植物生長的不同時期和不同環(huán)境。

本發(fā)明提供了一種原位活體檢測植物miRNA的方法，包括：

(1)將上所述微電極生物傳感器連接至電化學工作站，與不同濃度的目標miRNA標準溶液反應，在工作電壓下通過計時電流法進行連續(xù)檢測，利用電化學脈沖伏安法檢測雜交前后MB的峰電流值變化，由濃度與電流關(guān)系獲得穩(wěn)定的檢測目標miRNA的工作曲線；

(2)將上述微電極生物傳感器插入待測植物組織，連接電化學工作站，利用電化學脈沖伏安法檢測雜交前后MB的峰電流值變化，導入工作曲線，計算被測樣本內(nèi)的miRNA。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種基于微型生物傳感技術(shù)的植物體內(nèi)miRNA的活體在線監(jiān)測方法，從而更全面、深入地了解植物體內(nèi)miRNA的調(diào)節(jié)規(guī)律及作用機制。本發(fā)明通過在工作電極電沉積金納米粒子后，將末端巰基化的能識別目標miRNA的DNA探針放入亞甲基藍MB溶液中孵育，形成DNA-亞甲基藍復合物，再將該復合物滴涂至沉積了金納米粒子的工作電極表面，得到DNA探針修飾的工作電極。應用含有該工作電極的微電極生物傳感器對活體植物監(jiān)測，利用電化學脈沖伏安法檢測雜交前后MB的峰電流值變化，從而達到對microRNA定量檢測的目的，對被檢測樣本不造成本質(zhì)傷害，得到的數(shù)據(jù)結(jié)果可實時、準確的反映植物體內(nèi)目標miRNA的含量變化，實際應用操作簡便，易于掌握。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述微電極生物傳感器三電極體系外觀結(jié)構(gòu)以及。金工作電極制備示意圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1工作電極的制備

(1)微電極陣列通過微機電加工技術(shù)(MEMS)制備，包括Ag/AgCl的參比電極，鉑對電極及金工作電極，微電極長5cm，其中裸露導電部分長約3-10mm；將微電極置于0.5M稀硫酸溶液中進行循環(huán)伏安掃描(-0.2～1.6V)得到典型的循環(huán)伏安譜圖，確保電極表面清潔。

(2)在金工作電極上通過電沉積方法沉積直徑為10nm的金納米粒子，以增強傳感器的檢測靈敏度。

(3)DNA探針序列(5`-ggcatacagggagccaggca-3`)根據(jù)GmMIR160A的序列進行設計，末端巰基化，以便固定在金工作電極上。將PBS(100mM,pH 7.0)配制好的5μL 50nM末端巰基化的DNA探針序列放入10^-5M的亞甲基藍溶液中10min，形成DNA-亞甲基藍復合物，再將DNA-亞甲基藍復合物逐步滴涂到沉積了金納米粒子的工作電極表面，室溫放置16h，固定DNA探針。后用去離子水清洗干凈，得到DNA探針修飾的工作電極，儲存在4℃下。

實施例2微電極生物傳感器的應用

(1)分別配制0、0.01,0.1,0.5,1,5,10μM miRNA的PBS(pH＝7.0)標準溶液，用實施例1制得的修飾有探針DNA單鏈的微電極與不同濃度的miRNA標準溶液反應，通過脈沖伏安法檢測雜交前后MB的峰電流值變化，得到一組濃度與峰電流的關(guān)系曲線，制作miRNA的標準曲線I(μA)＝1.45log c(pM)+3.09(R＝0.9857)。

(2)植物樣本的培養(yǎng)：選擇水培15天的大豆幼苗，設置對照組和處理組，用50mM氯化鈉對其進行鹽脅迫處理不同時間。每個處理組設置30個重復。

(3)將微電極插入不同處理時間段(0h，6h,12h,24h,48h)待測大豆幼苗的嫩莖中，連接電化學工作站，通過脈沖伏安法記錄不同時間段鹽脅迫處理后大豆幼苗嫩莖中的GmMIR160A的即時濃度。通過將電流值代入工作曲線，求得待測樣品的即時GmMIR160A濃度。

(4)實驗結(jié)果對比

切取微電極檢測部位的部分組織進行實時定量PCR檢測(所用上下游引物序列分別為5`-CTCATCGAAGCATCAAT-3`；5`-CGCCATCCACAAAGGTCAT-3`)，與傳感器檢測的即時結(jié)果進行對比，如下表所示。結(jié)果表明該微電極傳感檢測的結(jié)果在48h內(nèi)的變化趨勢與定量PCR的趨勢一致，但結(jié)果更為準確，并且反應了植物活體內(nèi)的即時miRNA濃度，結(jié)果更加可靠。

表1測試結(jié)果對比

對比例1

(1)微電極先進行清潔處理，然后將PBS(100mM,pH 7.0)配制好的5μL 50nM末端巰基化的DNA探針序列放入10^-5M的亞甲基藍溶液中10min，形成DNA-亞甲基藍復合物，再將DNA-亞甲基藍復合物逐步滴涂到工作電極表面(不沉積金納米粒子)，室溫放置16h，后用去離子水清洗干凈，得到DNA探針修飾的工作電極，儲存在4℃下。

(2)用制備的微電極與不同濃度的miRNA標準溶液反應，通過脈沖伏安法檢測雜交前后MB的峰電流值變化，得到一組濃度與峰電流的關(guān)系曲線，制作miRNA的標準曲線為I(μA)＝0.815log c(pM)+4.21(R＝0.9822)，與本發(fā)明制備的傳感器相比，靈敏度降低。

(3)選擇水培15天的大豆幼苗，將微電極插入50mM氯化鈉鹽脅迫處理不同時間段(0h，6h)待測大豆幼苗的嫩莖中，連接電化學工作站，通過脈沖伏安法記錄不同時間段鹽脅迫處理后大豆幼苗嫩莖中的GmMIR160A的即時濃度。通過將電流值代入工作曲線，求得待測樣品的即時GmMIR160A濃度，檢測值偏低，并與PCR結(jié)果偏差較大。

表2測試結(jié)果對比

對比例2

(1)微電極清潔好后，在金工作電極上通過電沉積方法沉積直徑為200nm的金納米粒子，以增強傳感器的檢測靈敏度。

(2)將PBS(100mM,pH 7.0)配制好的5μL 50nM末端巰基化的DNA探針序列放入10^-5M的亞甲基藍溶液中10min，形成DNA-亞甲基藍復合物，再將DNA-亞甲基藍復合物逐步滴涂到沉積了200nm金納米粒子的工作電極表面，室溫放置16h，后用去離子水清洗干凈，得到DNA探針修飾的工作電極，儲存在4℃下。

(3)用制備的微電極與不同濃度的miRNA標準溶液反應，通過脈沖伏安法檢測雜交前后MB的峰電流值變化，得到一組濃度與峰電流的關(guān)系曲線，制作miRNA的標準曲線為I(μA)＝1.106log c(pM)+5.89(R＝0.9885)，與本發(fā)明制備的傳感器相比，靈敏度降低。

(4)選擇水培15天的大豆幼苗，將微電極插入50mM氯化鈉鹽脅迫處理不同時間段(0h，6h)待測大豆幼苗的嫩莖中，連接電化學工作站，通過脈沖伏安法記錄不同時間段鹽脅迫處理后大豆幼苗嫩莖中的GmMIR160A的即時濃度。通過將電流值代入工作曲線，求得待測樣品的即時GmMIR160A濃度，檢測值偏低，并與PCR結(jié)果偏差較大。

表3測試結(jié)果對比

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

序列表

<110> 北京農(nóng)業(yè)信息技術(shù)研究中心

<120> 一種原位活體檢測植物miRNA的微電極生物傳感器及其應用

<130> KHP161116906.4

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggcatacagg gagccaggca 20

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcatcgaag catcaat 17

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgccatccac aaaggtcat 19