本發(fā)明涉及復合納米材料技術、紙芯片技術、電路板制作技術和細胞中氣體信號分子檢測技術領域，更具體地說是一種適合于現(xiàn)場快速原位檢測癌細胞中硫化氫的紙分析器件的構建。

背景技術：

硫化氫（H₂S）作為一種內生的氣體信號分子存在于許多哺乳動物的組織中。它的生理功能在一系列的生理過程中逐漸被識別，比如血管生成、血管舒張、細胞凋亡、炎癥調節(jié)和神經(jīng)調節(jié)等。另外，細胞中H₂S的不正常含量將會引發(fā)一些疾病，比如阿耳茨海默氏病、唐氏綜合癥、糖尿病和肝硬化。因此，發(fā)展有效的檢測細胞中H₂S的分析方法對于理解它的生理和病理功能是非常有意義的，這已經(jīng)成為當今化學研究的一個重要的主題。盡管一些傳統(tǒng)的檢測方法（比色、電化學發(fā)光、熒光光譜）已經(jīng)被用于檢測不同樣品中痕量水平的H₂S，但是由于其高的揮發(fā)性和快速的分解性能，仍急需發(fā)展一種超靈敏、溫和、快速的檢測方法用于原位可靠地檢測癌細胞中的H₂S。

相比于一些傳統(tǒng)的檢測方法，電化學發(fā)分析方法由于其靈敏度高、成本低、裝置簡單、便攜等優(yōu)點已經(jīng)被廣泛使用。在分析過程中，為了放大檢測信號，酶由于其高效的催化性能經(jīng)常被使用。近年來，基于抑制劑對酶活性的抑制作用實現(xiàn)對抑制劑定量檢測的酶抑制分析方法已經(jīng)引起了廣泛的研究興趣。在檢測過程中通過抑制劑控制酶的催化活性，可以實現(xiàn)信號放大。辣根過氧化物酶（HRP）具有響應快速，催化活性高，穩(wěn)定性高、生物相容性好等優(yōu)點，此外其催化活性可以被硫化物有效地抑制?；诖?，我們利用HRP結合電化學檢測技術構建了一種酶抑制的分析方法，它是基于H₂S對酶活性的抑制作用實現(xiàn)對H₂S的檢測。

微流控紙基的分析設備由于其成本低、便攜、操作簡單等優(yōu)點，被廣泛應用于細胞學檢查或組織學研究中，它是利用紙基質作為微流控平臺實現(xiàn)簡單、原位、微型化的檢測。紙是由縱橫交錯的纖維網(wǎng)絡組成的，其具有一定的大孔結構。纖維表面的官能團可以為負載其他功能材料提供較強的結合位點。傳統(tǒng)的紙基功能材料中，材料只負載在紙纖維的表面，紙的大孔結構并沒有得到充分的利用。充分利用紙的纖維網(wǎng)絡和大孔結構，在紙基質中形成一個三維（3D）連續(xù)的復合材料層對于提高分析性能是非常有意義的。

還原氧化石墨烯（rGO）具有導電性好、表面積大、生物相容性高、機械性能好等優(yōu)點，已經(jīng)被作為一個良好的支撐材料用于負載半導體納米材料及貴金屬等。金（Au）鈀（Pd）合金納米粒子由于單一組分Au、Pd優(yōu)良性能的協(xié)同作用，其表現(xiàn)出更優(yōu)越的性能。我們通過控制組裝rGO和AuPd合金納米粒子在紙纖維的表面和紙的大孔結構中，在紙工作電極（PWE）中形成了一個3D AuPd-rGO網(wǎng)絡。這種新型的3D AuPd-rGO-PWE綜合運用了紙的獨特結構特點及rGO和AuPd合金納米粒子的優(yōu)良性能，表現(xiàn)出導電性好、表面積大、生物相容性好等優(yōu)點，其能夠在用于檢測癌細胞中的H₂S時極大地放大檢測信號，增強分析的靈敏度。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是充分利用紙的獨特結構特點及rGO和AuPd合金納米粒子的優(yōu)良性能制備一種新型的紙分析器件，并結合酶抑制分析方法和電化學檢測方法的高靈敏度，實現(xiàn)快速原位檢測癌細胞中的H₂S。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明是通過以下措施來實現(xiàn)的：

（1）在計算機上利用Adobe illustrator CS4軟件設計微流控紙芯片的疏水蠟打印圖案，如附圖1所示；

（2）將步驟（1）中設計的打印圖案通過蠟打印機打印在色譜紙上，然后將打印過的色譜紙放在烘箱中，在100-150 ℃加熱30-80秒使蠟融化并滲透整個色譜紙的厚度，形成疏水墻；

（3）在計算機上設計與蠟打印圖案相匹配的對電極和參比電極的印刷圖案，如附圖2所示；

（4）將步驟（2）中得到的蠟打印色譜紙通過絲網(wǎng)印刷技術按照步驟（3）設計的印刷電極圖案印刷碳對電極和Ag/AgCl參比電極；

（5）將步驟（4）中得到的色譜紙的樣品板和輔助板沿中間線剪開，在樣品板的工作區(qū)域，生長3D AuPd-rGO網(wǎng)絡，制備3D AuPd-rGO-PWE；

（6）在步驟（5）中所得到3D AuPd-rGO-PWE的工作區(qū)域，修飾HRP，固定3′端帶有氨基的適配體鏈，隨后采用牛血清白蛋白封閉非特異性結合位點，最后通過3′端帶有氨基的適配體鏈捕獲癌細胞，如附圖3所示；

（7）在計算機上利用Adobe illustrator CS4軟件設計電路板的尺寸和形狀，如附圖4所示，然后根據(jù)設計的尺寸和形狀完成電路板的制作；

（8）將步驟（5）中得到的輔助板完全疊放在步驟（6）中得到的樣品板上，然后將完全疊合的紙芯片與步驟（7）中得到的電路板進行組裝；

（9）借助電路板上的導電片將步驟（8）中組裝完成的紙分析器件連接到電化學工作站，在電路板B的通孔中加入檢測溶液，利用循環(huán)伏安法在掃描速度為100 mV/s，掃描電壓范圍為-0.6 ~ 0.6V進行電化學信號檢測，并通過計算抑制率，實現(xiàn)癌細胞中H₂S的檢測。

本發(fā)明所設計的紙芯片的尺寸如附圖1所示，樣品板和輔助板的形狀均為長方形，長和寬分別為21 mm和20 mm；工作區(qū)域和輔助區(qū)域均為直徑為8 mm的圓形，樣品板與輔助板之間寬度為1mm的線為分離二者的剪切線。

本發(fā)明所設計的電路板的尺寸如附圖4所示，電路板A和電路板B的形狀均為長方形，長和寬分別為27 mm和20 mm，其中“a”是用于連接紙工作區(qū)域的導電片，其形狀為直徑為8 mm的圓，“b”是用于連接到電化學工作站的導電片，其形狀為邊長為5 mm的正方形，“c”是用于連接電化學工作站和參比電極的導電片，其形狀為長為10 mm，寬為5 mm的長方形，“d”是用于連接對電極的導電片，其形狀為邊長為5 mm的正方形，“e”是用于連接兩個電路板的通孔，其形狀為直徑為8 mm的圓。

本發(fā)明所述的3D AuPd-rGO-PWE的制備步驟為：

（1）合成金納米粒子：量取90 mL的二次水置于單口燒瓶中，加熱到90℃， 隨后加入0.5-1.0 mL 1wt%-2wt%氯金酸，水浴加熱到95-100 ℃，反應1-5 min后，加入2.5-3.0 mL 0.5wt%-1wt%檸檬酸鈉，并繼續(xù)攪拌10-20 min至溶液變?yōu)榫萍t色；

（2）在樣品板的工作區(qū)域首先滴涂15-25 μL 0.5-1.0 mg mL^?1氧化石墨烯分散液（GO），然后在室溫下自然干燥，重復操作該“滴涂-干燥”過程3-5次，隨后將樣品板放入含有5-10 mL 0.5 mg mL^?1 GO、20-25 μL 80wt% 水合肼和15-20μL 28wt% 氨水的25 mL高壓釜中，在90-100 ℃加熱2-4 h, 待冷卻到室溫后用二次水洗滌工作區(qū)域，獲得rGO-PWE；

（3）在rGO-PWE的工作區(qū)域滴加15-20 μL 金納米粒子，在室溫下靜置1-3 h，用二次水洗去多余的金納米粒子后，將30-40 μL新鮮制備的含有10-15 mM 氯金酸，20-25 mM氯鈀酸和100-110 mM抗壞血酸的混合液加入到工作區(qū)域，在室溫下生長10-20 min后，用二次水徹底清洗工作區(qū)域并在室溫下干燥30 min，獲得3D AuPd-rGO-PWE。

本發(fā)明所述的在步驟（5）中所得到3D AuPd-rGO-PWE的工作區(qū)域，修飾HRP，固定3′端帶有氨基的適配體鏈，隨后采用牛血清白蛋白封閉非特異性結合位點，最后通過3′端帶有氨基的適配體鏈捕獲癌細胞的步驟為：將10 μL 2 mg mL^?1 HRP 滴加到紙芯片工作區(qū)域，并在室溫下孵化35 min，用pH 7.4 的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌除去多余的HRP后，將10 μL 4.0 μM的3′端帶有氨基的適配體鏈滴加到工作區(qū)域，孵化30 min 后用pH 7.4 PBS洗滌，然后滴加1%的牛血清白蛋白，用于封堵非特異性結合位點，利用pH 7.4 PBS洗滌后，滴加10 μL不同濃度的癌細胞在37 ℃孵化40 min，隨后用pH 7.4 PBS洗滌除去多余的癌細胞。

本發(fā)明所述的將步驟（5）中得到的輔助板完全疊放在步驟（6）中得到的樣品板上，然后將完全疊合的紙芯片與步驟（7）中得到的電路板進行組裝的步驟為：將完全疊合的芯片用自制芯片夾夾在電路板A電路板B之間，在這個過程中，要保證電路板A的導電片a、紙芯片的工作區(qū)域、輔助區(qū)域和電路板B中的通孔e完全重合。

本發(fā)明所述的步驟（9）中的利用循環(huán)伏安法進行電化學信號檢測，并通過計算抑制率，實現(xiàn)癌細胞中H₂S的檢測的步驟為：借助電路板上的導電片將步驟（8）中組裝的紙分析器件連接到電化學工作站，在電路板B的通孔中加入20 μL含有0.5 mM過氧化氫的pH 7.0 PBS檢測溶液，在掃描速率為100 mV/s，掃描電壓范圍為-0.6 ~ 0.6V進行循環(huán)伏安法測量，獲得電流信號I₀，測量后，用pH 7.0 PBS洗滌紙工作區(qū)域，再加入20 μL含有0.5 mM過氧化氫和40 ng mL^-1 血管內皮生長因子的pH 7.0 PBS檢測溶液，利用循環(huán)伏安法測量電流信號I₁，最后通過方程：抑制率=（I₀- I₁）/ I₀，計算抑制率，繪制抑制率與癌細胞濃度的標準曲線，實現(xiàn)癌細胞中H₂S的檢測。

本發(fā)明的有益效果：

（1）通過控制組裝rGO和AuPd合金納米粒子在紙纖維的表面和紙的大孔結構中，在PWE中形成了一個3D AuPd-rGO網(wǎng)絡，這極大地增強了PWE的表面積、導電性和生物相容性，有利于放大檢測信號，增強分析的靈敏度。

（2）該酶抑制分析方法綜合運用了HRP高效的催化活性、H₂S對HRP催化活性的有效抑制作用以及電化學檢測方法的優(yōu)越性，極大地提高了分析檢測的靈敏度。

（3）采用成本低廉的紙材料設計簡易、便攜的紙分析器件，可以實現(xiàn)現(xiàn)場快速原位可靠地檢測癌細胞中的H₂S。

（4）本發(fā)明的簡易、便攜紙分析器件，操作簡單、響應迅速且具有良好的特異性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性，為臨床分析癌細胞中的H₂S提供了一個良好的分析平臺，對進一步研究H₂S在細胞學和組織學中的生理功能具有重要的意義。

附圖說明

附圖1：紙芯片的疏水蠟打印圖案。

附圖2：紙芯片的絲網(wǎng)印刷電極圖案。

附圖3：細胞傳感器的構建過程。

附圖4：電路板的尺寸和形狀。

具體實施方式:

為了更好地理解本發(fā)明，下面結合實施例和附圖進一步闡明本發(fā)明的內容，但本發(fā)明的內容不僅僅局限于下面的實施例。

實施例1: 三維紙分析器件在檢測MCF-7細胞中H₂S的應用

（1）在計算機上用Adobe illustrator CS4軟件設計微流控紙芯片的疏水蠟打印圖案；

（2）將步驟（1）中設計的打印圖案通過蠟打印機批量打印在A4尺寸色譜紙上，然后將打印過的色譜紙放在烘箱中，在130 ℃加熱50s，使蠟融化并滲透整個色譜紙的厚度，形成疏水墻，而未進行蠟打印的區(qū)域仍保持良好的親水性；

（3）在計算機上用Adobe illustrator CS4軟件設計與蠟打印圖案相匹配的對電極和參比電極印刷圖案；

（4）將步驟（2）中得到的蠟打印色譜紙通過絲網(wǎng)印刷技術按照步驟（3）設計的印刷電極圖案印刷Ag/AgCl參比電極和碳對電極；

（5）將步驟（4）中得到的色譜紙的樣品板和輔助板沿中間線剪開，在樣品板的工作區(qū)域，首先生長一層3D的rGO網(wǎng)絡：將20 μL 0.5 mg mL^?1 GO滴涂到樣品板的工作區(qū)域，并在室溫下自然干燥，將此“滴涂-干燥”過程重復操作3次，然后將樣品板放入含有5 mL 0.5 mg mL^?1 GO、20μL 80wt%水合肼和18μL 28wt%氨水的25 mL高壓釜中，在90 ℃加熱2 h。待自然冷卻到室溫后，將樣品板取出，用二次水洗滌并在室溫干燥；

（6）在步驟（5）中長有rGO網(wǎng)絡的工作區(qū)域上生長一層AuPd合金納米粒子導電層，首先合成金納米粒子：量取90 mL的二次水置于單口燒瓶中，加熱到90 ℃， 隨后加入0.8 mL 1%氯金酸，水浴加熱到96 ℃，反應1 min后，加入2.8 mL 1%檸檬酸鈉，并繼續(xù)攪拌15 min至溶液變?yōu)榫萍t色。取15 μL 金納米粒子滴加在工作區(qū)域，在室溫下靜置1 h，用二次水洗去多余的金納米粒子后，將新鮮制備的30 μL含有10 mM 氯金酸，20 mM氯鈀酸和100 mM抗壞血酸的混合液加入到工作區(qū)域，在室溫下生長10 min后，用二次水徹底清洗工作區(qū)域并在室溫下干燥30 min，獲得3D AuPd-rGO-PWE；

（7）對步驟（6）中獲得的3D AuPd-rGO-PWE的工作區(qū)域進行生物分子的負載及細胞的捕獲：首先，將10 μL 2 mg mL^?1 HRP 滴加到紙芯片工作區(qū)域，并在室溫下孵化35 min，用pH 7.4 PBS洗滌除去多余的HRP后，將10 μL 4.0 μM的3′端帶有氨基的適配體鏈滴加到工作區(qū)域，孵化30 min后用pH 7.4 PBS洗滌，然后滴加1%的牛血清白蛋白，用于封堵非特異性結合位點，利用pH 7.4 PBS洗滌后，滴加10 μL一定濃度的MCF-7細胞在37 ℃孵化40 min，隨后用pH 7.4 PBS洗滌除去多余的MCF-7細胞；

（8）在計算機上用Adobe illustrator CS4軟件設計電路板的尺寸和形狀，然后根據(jù)設計的尺寸和形狀完成電路板的制作；

（9）將步驟（4）中得到的輔助板完全疊放在步驟（7）中得到的樣品板上，然后將完全疊合的紙芯片與電路板進行組裝：將完全疊合的芯片用自制芯片夾夾在電路板A和B之間，在這個過程中，要保證電路板A的導電片a、紙芯片的工作區(qū)域、輔助區(qū)域和電路板B中的通孔e完全重合；

（10）借助電路板上的導電片將步驟（9）中組裝的紙分析器件連接到電化學工作站，在電路板B的通孔中加入20 μL含有0.5 mM過氧化氫的pH 7.0 PBS檢測溶液，在掃描速率為100 mV/s，掃描電壓范圍為-0.6 ~ 0.6V進行循環(huán)伏安法測量，獲得電流信號I₀，測量后，用pH 7.0 PBS洗滌紙工作區(qū)域，再加入20 μL含有0.5 mM過氧化氫和40 ng mL^-1 血管內皮生長因子的pH 7.0 PBS檢測溶液，利用循環(huán)伏安法測量電流信號I₁，最后通過方程：抑制率=（I₀- I₁）/ I₀，計算抑制率，繪制抑制率與癌細胞濃度的標準曲線，實現(xiàn)癌細胞中H₂S的檢測。

SEQUENCE LISTING

<110> 濟南大學

<120> 一種用于檢測癌細胞中H2S的三維紙分析器件的制備方法

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gcagttgatc ctttggatac cctggttttt tttttt 36