本發(fā)明涉及甘蔗內(nèi)源激素檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是一種甘蔗葉片中檸檬酸含量的HPLC檢測方法。
背景技術(shù)：
：甘蔗（Saccharumofficinarum)是我國最重要糖料作物，蔗糖占我國食糖總產(chǎn)92%。甘蔗中含有的植物激素幾乎參與了其生長發(fā)育所有過程的生理調(diào)節(jié)，從細胞的生長分裂和分化，到種子的休眠、果實發(fā)育、性別分化和衰老過程等。對于甘蔗而言，它有2個非常重要的指標直接影響著甘蔗的經(jīng)濟價值，分別糖分和產(chǎn)量，但如果甘蔗受到病蟲害影響而不能及時發(fā)現(xiàn)，則會大大影響甘蔗的糖分和產(chǎn)量。如果能夠通過研究甘蔗生長過程中內(nèi)源激素的變化趨勢，判斷甘蔗品種感染病原后的感抗差異，并建立對應病原菌脅迫應答的生化機制，那么將對甘蔗經(jīng)濟價值的增長具有重大的現(xiàn)實意義。甘蔗梢腐病最早是在印尼首先發(fā)現(xiàn)的，并隨甘蔗品種POJ2878及其衍生品種的推廣蔓延至全世界，其發(fā)病最高級和嚴重階段，會導致蔗株心葉整個基部腐爛和快速失水，最終在甘蔗梢部幼嫩組織上形成頂腐狀，從而造成產(chǎn)量和糖分損失。尤其近年，云南、廣西蔗區(qū)種植的桂糖11號、GT21號和主推的桂糖37號多為感病品種，ROC22以及ROC16等主栽品種感染梢腐病程度也日益嚴重，這給糖業(yè)安全生產(chǎn)帶來了嚴重影響。甘蔗在受到梢腐病病原侵染時，會產(chǎn)生一系列的防御反應來保護自己。在與病原菌的互作過程中，蔗株內(nèi)源激素的含量和活性發(fā)生變化，由此影響甘蔗正常生理生化進程，從而感染甘蔗并導致發(fā)病。因此，對感染梢腐病病原后的內(nèi)源激素變化趨勢研究是十分緊迫的問題。檸檬酸作為逆境信號物質(zhì)，以內(nèi)源激素為正負信號對體內(nèi)各種代謝進行有效調(diào)控，不僅與可溶性蛋白合成及提高羧基歧化酶、蔗糖轉(zhuǎn)運酶活性等有關(guān)，且與提高植物光合能力，增強植物生長勢、植物激素物質(zhì)的合成密切相關(guān)。但至今尚無建立高效、精確的甘蔗葉片檸檬酸含量檢測方法，鑒于此建立一套快速有效的甘蔗葉片檸檬酸含量檢測方法，對及時判斷甘蔗品種感染病原后的感抗差異和研究檸檬酸內(nèi)源激素介導甘蔗梢腐病病原菌脅迫應答的生化機制具有非常重要的意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對我國甘蔗葉片檸檬酸含量檢測方法的空白，本發(fā)明的目的在于提供一種簡便、快速、準確的甘蔗葉片中檸檬酸含量的HPLC檢測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方法如下：一種甘蔗葉片中檸檬酸含量的HPLC檢測方法，其特征在于包括以下步驟：S1.將待測的甘蔗葉片加入預冷至2~5℃的體積分數(shù)為70~90%甲醇水溶液，再加入液氮研磨成漿，定容，2~5℃浸提50~90min，超聲提取1.5~3h，離心，取上清液，殘渣再加入預冷至2~5℃體積分數(shù)為70~90%甲醇水溶液超聲提取20~40min，離心后取出上清液，重復殘渣浸提和離心操作0~3次，合并上清液，用70~90%甲醇定容，過濾，作為樣品溶液備用；S2.采用HPLC檢測樣品溶液中檸檬酸的含量。進一步的，所述步驟S2中，HPLC色譜條件為：采用C18反相色譜柱；流動相由12.5mmol/L的磷酸二氫鈉水溶液與甲醇按體積比50:1混合，再加入0.5mol/L的磷酸水溶液調(diào)節(jié)pH至2.8；柱溫為32~38℃，流速0.8~1.2mL/min，紫外檢測波長214nm。更進一步的，所述步驟S6中，HPLC色譜條件為：柱溫為35℃，流速0.8mL/min，進樣量10μL。進一步的，所述步驟S1中，所述待測的甘蔗葉片預先從甘蔗上置于冰盒上剪下。進一步的，所述步驟S1中，待測的甘蔗葉片和殘渣浸提采用的是體積分數(shù)為80%的甲醇水溶液。進一步的，所述步驟S1中，待測的甘蔗葉片和殘渣浸提的溫度為4℃。進一步的，所述步驟S1中，甘蔗葉片研磨成漿后，加入超凈水進行定容。進一步的，所述步驟S5中，過濾采用針頭式過濾器進行。本發(fā)明還提供了以上所述的檢測方法在判斷甘蔗品種對梢腐病感性和抗性差異方面的應用。本發(fā)明的有益效果是：1）樣品前處理方法采用浸泡和超聲提取相結(jié)合的方法提取檸檬酸，與其他方法相比，提取快速，提取有效成分完全，除雜效果好，待測樣品純凈度高。2）通過本發(fā)明HPLC色譜條件測量樣品溶液中檸檬酸的含量，檸檬酸能與其他有效成分較好地進行分離，且檢測速度快，重復性和準確性好，在具備高效液相色譜儀的實驗室均能通過此法開展檸檬酸含量檢測工作。3）本發(fā)明尤其適用于感染梢腐病的甘蔗葉片中檸檬酸含量的測定，通過上述樣品的前處理方法和色譜條件，能排除梢腐病病原菌對檢測結(jié)果的干擾，從而為判斷甘蔗品種對梢腐病感抗差異研究和檸檬酸介導甘蔗梢腐病病原菌脅迫應答生化機制提供科學有力的檢測技術(shù)；同時，本發(fā)明方法的推廣使用，對于篩選抗病品種和指導甘蔗抗病育種也具有重要意義和現(xiàn)實作用。附圖說明圖1為檸檬酸的標準工作曲線。圖2a為標準溶液檢測得到的色譜圖。圖2b為樣品溶液檢測得到的色譜圖。圖3為不同生長階段甘蔗樣品中檸檬酸的含量的趨勢分析圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步詳細的闡述，但本發(fā)明的實施方式并不局限于實施例表示的范圍。這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此外，在閱讀本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種修改，這些等價變化同樣落于本發(fā)明所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例1甘蔗葉片中檸檬酸含量的HPLC檢測方法S1.選取感染甘蔗梢腐病病原的甘蔗葉片作為待測樣品，取待測樣品2g，加入4mL預冷至4℃的體積分數(shù)為80%的甲醇水溶液，加入液氮研磨成漿，用超凈水定容至10ml，4℃浸提1h，超聲提取2h，10000r/min離心10min，取上清液，殘渣再加入2mL預冷至4℃的體積分數(shù)為80%甲醇水溶液超聲提取30min，10000r/min離心10min，離心后取出上清液，合并上清液，用體積分數(shù)為80%甲醇水溶液定容至8mL，取適量定容后的溶液用針頭式過濾器過濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶內(nèi)，作為樣品溶液備用；S2.采用HPLC檢測樣品溶液中檸檬酸的含量。S2-1.色譜條件：ARigolL3000高效液相色譜儀；色譜柱：CSTC18反相色譜柱（250mm*4.6mm,5μm）；流動相：12.5mmol/L的磷酸二氫鈉水溶液800mL，加入16mL甲醇，用0.5mol/L的磷酸水溶液調(diào)節(jié)溶液pH至2.8，混勻；柱溫：35℃；流速：0.8mL/min；檢測波長：214nm；進樣體積：10μL。S2-2.稱取檸檬酸標準品2.5mg，加入10mL水溶解，配置成250μg/mL的標準溶液母液；然后用標準溶液母液再一次稀釋成濃度分別為50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL的標準溶液，采用S2-1的色譜條件檢測標準溶液母液和標準溶液，其對應峰面積分別為236.008、5.439、23.503、8.295、4.745、0.755；然后以峰面積為縱坐標、以檸檬酸濃度為橫坐標做標準曲線，標準曲線如圖1所述，由圖1可見，在所檢測范圍內(nèi)(1μg/mL～250μg/mL)，回歸方程式為y=0.9448x-0.4263，液相色譜峰面積與檸檬酸濃度具有良好的線性關(guān)系(R2=0.9996)。S2-3.專屬性考察：分別取10μL的250μg/mL標準溶液母液和樣品溶液注入液相色譜儀中，采用S2-1的色譜條件檢測，標準溶液母液中檸檬酸的保留時間為8.747min，樣品溶液中檸檬酸的保留時間為8.713min，結(jié)果分別見圖2a和圖2b。S2-4.加標回收實驗：分別向同一樣品溶液中添加1mL濃度為10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、50μg/mL的標準溶液，采用S2-1的色譜條件檢測，計算回收率。表1檸檬酸回收率測定結(jié)果S2-5.方法精密度試驗取濃度為5μg/mL的標準溶液，采用S2-1的色譜條件檢測，連續(xù)進樣5針觀察保留時間與峰面積，檢測結(jié)果見表2。表2方法精密度實驗結(jié)果編號保留時間（min）峰面積（μvsec）18.7477.74228.7137.86038.7287.32048.7557.57858.7157.688標準偏差0.0180.204相對標準偏差0.9592.677S2-6.S1獲得的樣品溶液分析采用S2-1的色譜條件檢測，重復測定三次，得樣品的中檸檬酸的含量為33.898μg/g。由本實施例可以看出，本方法的靈敏度、檢出限和精密度能夠滿足甘蔗葉片中檸檬酸含量的測定；尤其適用于感染梢腐病的甘蔗葉片中檸檬酸含量的測定，通過上述樣品的前處理方法和色譜條件，能排除梢腐病病原菌對檢測結(jié)果的干擾。實施例2判斷甘蔗品種感染梢腐病后的感性和抗性差異研究（1）接種體的制備：將甘蔗梢腐病病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上活化3天，挑取PDA培養(yǎng)基邊緣菌絲接種在滅菌的馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3天，離心、用滅菌的脫脂棉過濾、收集所獲得的菌體，用無菌水與菌體配制成濃度為1×106CFU/ml甘蔗梢腐病病原菌孢子懸浮液。（2）接種材料的處理：選取甘蔗品種YT94-128、甘蔗品種GT37為接種材料，溫室條件下每個品種種植30桶，每桶4個芽，下種前用0.3%多菌靈浸種20min，出苗后正常管理，長出5～6片完全葉時進行接種。（3）注射接種：取長勢相同的甘蔗品種YT94-128、甘蔗品種GT37的幼苗各30株，使用1ml醫(yī)用注射器分別將100μl甘蔗梢腐病病原菌孢子懸浮液到甘蔗+1葉位，作為甘蔗接種樣品；再另外取長勢相同的甘蔗品種YT94-128、甘蔗品種GT37的幼苗各30株，以注射無菌水為對照，作為甘蔗對照樣品；甘蔗接種結(jié)束后保持室內(nèi)溫度28-30℃，濕度80%。（4）樣品選取:選擇相同株齡+1葉位上相同位置有近似病癥的甘蔗葉片，在冰盒上將其剪成1cm×1cm的葉片進行備樣。（5）檢測方法與結(jié)果S1.取各生長階段（0、4、8、16d）的甘蔗接種樣品和甘蔗對照樣品葉片2g，分別加入4mL預冷至4℃的體積分數(shù)為80%甲醇水溶液，加入液氮研磨成漿，用超凈水定容至10ml，4℃浸提1h，超聲提取2h，10000r/min離心10min，取上清液，殘渣再加入2mL預冷至4℃的體積分數(shù)為80%甲醇水溶液超聲提取30min，10000r/min離心10min，離心后取出上清液，合并上清液，用體積分數(shù)為80%甲醇水溶液定容至8mL，取適量定容后的溶液用針頭式過濾器過濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶內(nèi)，作為樣品溶液備用；S2.采用HPLC檢測樣品溶液中檸檬酸的含量。S2-1色譜條件：ARigolL3000高效液相色譜儀；色譜柱：CSTC18反相色譜柱（250mm*4.6mm,5μm）；流動相：12.5mmol/L的磷酸二氫鈉水溶液800mL，加入16mL甲醇，用0.5mol/L的磷酸水溶液調(diào)節(jié)溶液pH至2.8，混勻；柱溫：35℃；流速：0.8mL/min；檢測波長：214nm；進樣體積：10μL。S2-2取不同生長階段（0、4、8、16d）的甘蔗接種樣品YT94-128、GT37和甘蔗對照樣品制成的研究樣品溶液，進行檸檬酸含量的測定，每個樣品重復測定3次，使用實施例1S2-2制得的標準曲線計算結(jié)果，結(jié)果見表3。表3不同生長階段甘蔗接種樣品中檸檬酸的含量S2-3實驗結(jié)果分析。檸檬酸（CA）作為三羧酸循環(huán)中間物質(zhì)之一，其含量高低直接與植物生長、發(fā)育及其抗性有關(guān)。經(jīng)鑒定，YT94-128對梢腐病表現(xiàn)出抗性，GT37對梢腐病表現(xiàn)出感性。由上述表3獲得的數(shù)據(jù)制得檸檬酸含量的趨勢分析圖，如圖3所示，其中，A為接種樣品YT94-128的檸檬酸含量變化趨勢，B為對照樣品GT37的檸檬酸含量變化趨勢，C為對照樣品YT94-128的檸檬酸含量變化趨勢，D為接種樣品GT37的檸檬酸含量變化趨勢，結(jié)合圖3所示，對照樣品中的檸檬酸含量隨甘蔗生長而緩慢上升，抗病品種YT94-128的檸檬酸含量變化趨勢高于感病品種GT37；病原菌接種處理的甘蔗葉片中檸檬酸含量表現(xiàn)出隨甘蔗生長而不斷增加并不斷趨于穩(wěn)定的趨勢；其中，對照之間檸檬酸含量差異并不顯著，而接種4天后處理間含量差異達到極顯著。本試驗說明，空白處理下，感病品種GT37葉片合成檸檬酸的速率要高于抗病品種YT94-128；在接種病原菌后，感病品種GT37梢腐病病情指數(shù)不斷加重，其葉片合成檸檬酸的能力受到顯著影響，同時蔗株在受到生物（病原菌）和非生物（針刺）脅迫后發(fā)生檸檬酸次生合成反應，但前者大于后者，從而導致GT37葉片中檸檬酸含量出現(xiàn)波峰后呈顯著降低趨勢?？共∑贩NYT94-128在接種病原菌后，因其病情指數(shù)并不嚴重，其在接種后葉片檸檬酸含量不斷增加，在接種10天左右達到一個穩(wěn)定狀態(tài)，這也反映檸檬酸含量與甘蔗梢腐病病情指數(shù)呈負相關(guān)，與抗病性呈正相關(guān)。結(jié)論：由試驗可看出，對梢腐病呈抗性的甘蔗品種檸檬酸含量都呈不斷增加趨勢，而對梢腐病呈感性的甘蔗品種合成檸檬酸能力嚴重下降，這一試驗結(jié)果為研究檸檬酸抗逆性生理生化機制、篩選抗病品種和指導甘蔗抗病育種提供了重要的技術(shù)參考。本文中所描述的具體實施例僅僅是對本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。當前第1頁1 2 3