本發(fā)明屬于食品中非食用色素檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種低共熔溶劑萃取液相色譜法快速測定黃曲霉毒素B1、堿性橙II和堿性嫩黃O的方法。

背景技術(shù)：

堿性橙II和堿性嫩黃O均為芳香胺類堿性工業(yè)染料，主要用于麻、紙、皮革、草編織品、人造絲等的染色。堿性橙II和堿性嫩黃O對皮膚黏膜有輕度刺激，可引起結(jié)膜炎、皮炎和上呼吸道刺激癥狀，人體接觸或吸食均會引起中毒，且很難降解代謝，這兩種物質(zhì)均具有致癌和致突變性質(zhì)。根據(jù)GB 2760食品添加劑適用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，堿性橙II和堿性嫩黃O都嚴禁作為食品添加劑使用。由于在中性或偏堿性條件下，堿性橙II和堿性嫩黃O與蛋白質(zhì)吸附較牢固，不易褪色，比其他水溶性染料如檸檬黃、日落黃等更易于在食品中染色，因此，一些不法商販常將其用于食品的染色，使產(chǎn)品色澤鮮亮，欺騙消費者，危害消費者的身體健康。

GB 35/T 897-2009《食品中堿性橙、堿性嫩黃O和堿性桃紅T含量的測定》中規(guī)定了堿性橙II和堿性嫩黃O的檢測方法，該方法存在前處理過程繁瑣復(fù)雜、有機溶劑使用量較多、耗時長等多方面的缺陷，而且該方法主要是針對固體樣品，對于調(diào)味油這類基質(zhì)和雜質(zhì)均比較復(fù)雜的樣品并不適用。

黃曲霉毒素(AFT)是公認的天然強致癌物質(zhì)之一，其中以黃曲霉毒素B₁(AFTB1)毒性最大，它們常存在于各種動物飼料和人類食品中。我國真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)GB 2761《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》針對不同食品品種規(guī)定了黃曲霉毒素B₁的限量指標(biāo)。

GB/T 18979-2003《食品中黃曲霉毒素的測定免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法》和GB/T 5009.23-2006《食品中黃曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的測定》中均規(guī)定了黃曲霉毒素B₁的檢測方法，該方法存在前處理過程繁瑣復(fù)雜、有機溶劑使用量較多、耗時長等多方面的缺陷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對以上技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種低共熔溶劑萃取液相色譜法快速測定黃曲霉毒素B1、堿性橙II和堿性嫩黃O的方法，該方法操作簡單，檢測快速，成本低廉。

對此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種低共熔溶劑萃取液相色譜法快速測定黃曲霉毒素B1、堿性橙II和堿性嫩黃O的方法，其包括以下步驟：

步驟S1：配制堿性橙II和堿性嫩黃O的混合標(biāo)準(zhǔn)液，并稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別采用液相色譜儀進行檢測得到不同濃度的堿性橙II和堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)工作液的液相色譜圖，根據(jù)液相色譜圖的峰面積和對應(yīng)的濃度制作堿性橙II和堿性嫩黃O的校正曲線；配制黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液，并分別稀釋成不同濃度的黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別采用液相色譜儀進行檢測得到不同濃度黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液的液相色譜圖，根據(jù)液相色譜圖的峰面積和對應(yīng)的濃度制作黃曲霉毒素B1的校正曲線；

步驟S2：制備低共熔溶劑，所述低共熔溶劑包括氫鍵受體化合物和氫鍵供體化合物；

步驟S3：稱取調(diào)味油樣品，加入步驟S2中所述低共熔溶劑和烷烴試劑，進行震蕩萃取，離心后去除上面的油層，剩余物采用液相色譜儀進行檢測得到樣品的色譜圖；其中，所述低共熔溶劑和烷烴試劑的體積比大于0.0025；其中優(yōu)選的，所述剩余物用烷烴洗滌后采用液相色譜儀進行檢測，洗滌的目的是為了除油除雜更徹底；

步驟S4：將樣品的色譜圖與堿性橙II和堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)工作液的液相色譜圖、以及黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液的液相色譜圖進行比較確定是否含有堿性橙II、堿性嫩黃O和黃曲霉毒素B1，如果確定含有堿性橙II和堿性嫩黃O，再根據(jù)樣品的色譜圖峰面積所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度確定樣品中堿性橙II和堿性嫩黃O的含量；如果確定含有黃曲霉毒素B1，再根據(jù)樣品的色譜圖峰面積所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度確定樣品中黃曲霉毒素B1的含量。

采用此技術(shù)方案，利用低共熔溶劑提取調(diào)味油樣品中的堿性橙II和堿性嫩黃O，利用烷烴類試劑除去復(fù)雜的基質(zhì)可達到樣品凈化的目的，再將低共熔溶劑上機檢測，實現(xiàn)了快速檢測，步驟簡單，無需復(fù)雜的樣品前處理過程，減少了溶劑的使用，同時又除去了調(diào)味油中復(fù)雜基質(zhì)的干擾，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟S1還包括：配制黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液，并分別稀釋成不同濃度的黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別采用液相色譜儀進行檢測得到不同濃度黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液的液相色譜圖，根據(jù)液相色譜圖的峰面積和對應(yīng)的濃度制作黃曲霉毒素B1的校正曲線；

所述步驟S4還包括：將樣品的色譜圖與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液的液相色譜圖進行比較確定是否含有黃曲霉毒素B1，如果確定含有黃曲霉毒素B1，再根據(jù)樣品的色譜圖峰面積所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度確定樣品中黃曲霉毒素B1的含量。

采用此技術(shù)方案，可以同時進行堿性橙II和堿性嫩黃O非食用色素和黃曲霉毒素B1的檢測，處理簡單，使用方案，檢驗快速，克服了現(xiàn)有檢測方法的缺點與不足。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述氫鍵供體化合物為尿素和醇類中的至少一種，所述氫鍵受體化合物與氫鍵供體化合物的摩爾比為1：(1～3)。

優(yōu)選的，所述低共熔溶劑的用量按照每克調(diào)味油樣品0.05～5.0mL。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述氫鍵受體化合物為甜菜堿，所述甜菜堿與所述氫鍵供體化合物的摩爾比為1:1、1:2或1:3。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述氫鍵供體化合物為丙三醇。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述烷烴試劑包括正己烷、環(huán)己烷、辛烷、庚烷中的至少一種。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述低共熔溶劑和烷烴試劑的體積比為0.5～5。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述烷烴試劑為正己烷或正庚烷。

作為本發(fā)明的進一步改進，步驟S3中，所述萃取的方式為搖床震蕩提取或超聲波提取，所述提取溫度在10-50℃。優(yōu)選的，所述萃取的方式為搖床震蕩提取。

作為本發(fā)明的進一步改進，步驟S3中，剩余物用烷烴洗滌除去殘留的油，然后將低共熔溶劑直接上機或者定容到所需要的體積后上機檢測。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

第一，本發(fā)明的技術(shù)方案，實用性強，對于辣椒油、番椒油、胭脂樹橙油等粘度大、基質(zhì)復(fù)雜的調(diào)味油樣品，均可以進行堿性橙II、堿性嫩黃O以及黃曲霉毒素B1的準(zhǔn)確檢測。

第二，本發(fā)明的技術(shù)方案操作簡單、成本低，本發(fā)明僅需要簡單的樣品提取過程，不需要復(fù)雜的前處理過程，提取所用的低共熔溶劑可以節(jié)省有機溶劑的使用，大大降低了實驗成本。

第三，本發(fā)明的技術(shù)方案檢測快速，由于本方法可以節(jié)省樣品前處理時間，大大縮短了調(diào)味油中堿性橙II、堿性嫩黃O以及黃曲霉毒素B₁檢測所需要的時間。

第四，加標(biāo)回收率高，檢出限低，低共熔溶劑可以有效的從調(diào)味油中提取堿性橙II、堿性嫩黃O以及黃曲霉毒素B₁，同時烷烴類試劑可以除去復(fù)雜的油基質(zhì)，避免雜質(zhì)干擾，因此能夠保證足夠高的回收率和較低的檢出限，樣品的回收率分別在82.3％-101％、81.6％-103％和75.6％-108％范圍內(nèi)，檢出限分別可達0.02mg/kg、0.02mg/kg和1.0μg/kg。

附圖說明

圖1是本發(fā)明一種實施例的濃度為0.1μg/L的堿性橙II和堿性嫩黃O兩種色素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖。

圖2是本發(fā)明一種實施例濃度為0.5μg/L的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖。

圖3是本發(fā)明一種實施例的堿性橙II標(biāo)準(zhǔn)工作液校正曲線。

圖4是本發(fā)明一種實施例的堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)工作液校正曲線。

圖5是本發(fā)明一種實施例的黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)工作液校正曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作出進一步地詳細闡述，所述實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的材料、試劑、儀器設(shè)備等，如無特殊說明，均為商業(yè)可得。

甲醇：色譜純，購于默克公司；乙腈：色譜純，購于默克公司；正己烷：色譜純，購于默克公司；正庚烷：色譜純，購于默克公司；乙酸銨：分析純，購于上海安譜，冰乙酸：分析純，上海凌峰；甜菜堿：分析純，阿拉?。荒蛩兀悍治黾?，阿拉丁；丙三醇：分析純，上海凌峰；丙二醇：分析純，上海凌峰；水為超純水。

堿性橙II標(biāo)準(zhǔn)品：純度95.00％，購自Sigma-Aldrich。

堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)品：純度86.00％，購自Sigma-Aldrich。

黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)品：純度100.0％，購自百靈威。

高效液相色譜儀：配備四元梯度泵，脫氣裝置，微量進樣器，紫外檢測器和熒光檢測器。

堿性橙II和堿性嫩黃O液相色譜條件參數(shù)如下：

色譜柱：Agilent 5TC-C18，150×4.6mm

柱溫：25℃

檢測波長：450nm

乙酸銨緩沖溶液：稱取0.77g乙酸銨固體，加水溶解，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，再加入1.2mL冰醋酸，用超純水定容至刻度，超聲除去氣泡，抽濾除去固體雜質(zhì)。

進樣量：25μL。

流速：1.0mL/min。

梯度洗脫條件：流動相A為乙腈，流動相B為乙酸銨緩沖溶液。

流動相的具體情況如表1所示。

表1

黃曲霉毒素B₁液相色譜條件參數(shù)如下：

色譜柱：Agilent 5TC-C18，150×4.6mm

柱溫：40℃

檢測波長：激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長420nm

進樣量：20μL

流速：0.8mL/min

等度洗脫條件：甲醇：水＝45：55

柱后衍生條件：0.05％碘溶液，流速0.2mL/min，反應(yīng)溫度70℃

按照以下步驟進行檢測：

步驟S1：配制堿性橙II和堿性嫩黃O的混合標(biāo)準(zhǔn)液，并稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別采用液相色譜儀進行檢測得到不同濃度的堿性橙II和堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)工作液的液相色譜圖，根據(jù)液相色譜圖的峰面積和對應(yīng)的濃度制作堿性橙II和堿性嫩黃O的校正曲線；并配制黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液，并分別稀釋成不同濃度的黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別采用液相色譜儀進行檢測得到不同濃度黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液的液相色譜圖，根據(jù)液相色譜圖的峰面積和對應(yīng)的濃度制作黃曲霉毒素B1的校正曲線；

步驟S2：制備低共熔溶劑。

低共熔溶劑DES-1的制備：稱取20g甜菜堿和15.72g的丙三醇于100mL反應(yīng)瓶中，升溫到90℃并攪拌至澄清為止，冷卻至室溫備用。

低共熔溶劑DES-2的制備：稱取20g甜菜堿和20.51g的尿素于100mL反應(yīng)瓶中，升溫到90℃并攪拌至澄清為止，冷卻至室溫備用。

低共熔溶劑DES-3的制備：稱取20g甜菜堿和31.79g的乙二醇于100mL反應(yīng)瓶中，升溫到90℃并攪拌至澄清為止，冷卻至室溫備用。

步驟S3：稱取調(diào)味油樣品，加入步驟S2中所述低共熔溶劑和烷烴試劑，進行震蕩萃取，離心后去除上面的油層，剩余物用烷烴洗滌后采用液相色譜儀進行檢測得到樣品的色譜圖；其中，所述低共熔溶劑和烷烴試劑的體積比大于0.0025；

步驟S4：將樣品的色譜圖與堿性橙II和堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)工作液的液相色譜圖、以及黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液的液相色譜圖進行比較確定是否含有堿性橙II和堿性嫩黃O，如果確定含有堿性橙II和堿性嫩黃O，再根據(jù)樣品的色譜圖峰面積所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度確定樣品中堿性橙II和堿性嫩黃O的含量；將樣品的色譜圖與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液的液相色譜圖進行比較確定是否含有黃曲霉毒素B1，如果確定含有黃曲霉毒素B1，再根據(jù)樣品的色譜圖峰面積所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度確定樣品中黃曲霉毒素B1的含量。濃度為0.1μg/L的堿性橙II和堿性嫩黃O兩種色素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖如圖1所示；濃度為0.5μg/L的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖如圖2所示；堿性橙II標(biāo)準(zhǔn)工作液校正曲線如圖3所示；堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)工作液校正曲線如圖4所示；黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)工作液校正曲線如圖5所示。

實施例1

樣品：稱取番椒油1g于15mL離心管中，加入0.5mL低共熔溶劑DES-1和8mL正己烷，搖床震蕩提取10分鐘，7500r/min離心2分鐘，用塑料吸管吸取上面的油層棄去，再加入4mL正己烷，震蕩洗滌1分鐘，7500r/min離心2分鐘，上面的油層用塑料吸管吸走棄去。殘留的低共熔溶劑DES-1部分用甲醇定容至2.0mL，渦旋混勻，過0.22μm有機濾膜，上機測試。

加標(biāo)樣品1：稱取番椒油1g于15mL離心管中，添加堿性橙II、堿性嫩黃O以及黃曲霉毒素B₁的濃度水平均為2.0mg/kg，加入0.5mL低共熔溶劑DES-1和8mL正己烷，搖床震蕩提取10分鐘，7500r/min離心2分鐘，用塑料吸管吸取上面的油層棄去，再加入4mL正己烷，震蕩洗滌1分鐘，7500r/min離心2分鐘，上面的油層用塑料吸管吸走棄去。殘留的低共熔溶劑DES-1部分用甲醇定容至2.0mL，渦旋混勻，過0.22μm有機濾膜，上機測試。

將樣品的色譜圖與堿性橙II和堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜圖、以及黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液的液相色譜圖進行比較確定是否含有堿性橙II和堿性嫩黃O、或同時含有黃曲霉毒素B1，再根據(jù)樣品的色譜圖峰面積所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度確定樣品中堿性橙II、堿性嫩黃O、黃曲霉毒素B1的含量，得到的結(jié)果如表2所示。

表2實施例1的檢測結(jié)果表

實施例2

樣品：稱取辣椒油1g于15mL離心管中，加入0.3mL低共熔溶劑DES-2和5mL正庚烷，搖床震蕩提取10分鐘，7500r/min離心2分鐘，用塑料吸管吸取上面的油層棄去，再加入5mL正庚烷，震蕩洗滌1分鐘，7500r/min離心2分鐘，上面的油層用塑料吸管吸走棄去。殘留的低共熔溶劑DES-2部分用甲醇定容至2.0mL，渦旋混勻，過0.22μm有機濾膜，上機測試。

加標(biāo)樣品2：稱取辣椒油1g于15mL離心管中，添加堿性橙II、堿性嫩黃O以及黃曲霉毒素B₁的濃度水平均為2.0mg/kg，加入0.3mL低共熔溶劑DES-2和5mL正庚烷，搖床震蕩提取10分鐘，7500r/min離心2分鐘，用塑料吸管吸取上面的油層棄去，再加入5mL正庚烷，震蕩洗滌1分鐘，7500r/min離心2分鐘，上面的油層用塑料吸管吸走棄去。殘留的低共熔溶劑DES-2部分用甲醇定容至2.0mL，渦旋混勻，過0.22μm有機濾膜，上機測試。

將樣品的色譜圖與堿性橙II和堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜圖、以及黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液的液相色譜圖進行比較確定是否含有堿性橙II和堿性嫩黃O，以及是否同時含有黃曲霉毒素B1，再根據(jù)樣品的色譜圖峰面積所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度確定樣品中堿性橙II、堿性嫩黃O、黃曲霉毒素B1的含量，得到的結(jié)果如表3所示。

表3實施例2的檢測結(jié)果表

實施例3

樣品：稱取姜黃油1g于15mL離心管中，加入0.5mL低共熔溶劑DES-3和5mL正庚烷，搖床震蕩提取10分鐘，7500r/min離心2分鐘，用塑料吸管吸取上面的油層棄去，再加入5mL正庚烷，震蕩洗滌1分鐘，7500r/min離心2分鐘，上面的油層用塑料吸管吸走棄去。殘留的低共熔溶劑DES-3部分用甲醇定容至2.0mL，渦旋混勻，過0.22μm有機濾膜，上機測試。

加標(biāo)樣品3：稱取姜黃油1g于15mL離心管中，添加堿性橙II、堿性嫩黃O以及黃曲霉毒素B₁的濃度水平均為2.0mg/kg，加入0.5mL低共熔溶劑DES-3和5mL正庚烷，搖床震蕩提取10分鐘，7500r/min離心2分鐘，用塑料吸管吸取上面的油層棄去，再加入5mL正庚烷，震蕩洗滌1分鐘，7500r/min離心2分鐘，上面的油層用塑料吸管吸走棄去。殘留的低共熔溶劑DES-3部分用甲醇定容至2.0mL，渦旋混勻，過0.22μm有機濾膜，上機測試。

將樣品的色譜圖與堿性橙II和堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜圖、以及黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液的液相色譜圖進行比較確定是否含有堿性橙II和堿性嫩黃O、或同時含有黃曲霉毒素B1，再根據(jù)樣品的色譜圖峰面積所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度確定樣品中堿性橙II、堿性嫩黃O、黃曲霉毒素B1的含量，得到的結(jié)果如表4所示。

表4實施例3的檢測結(jié)果表

通過反復(fù)實驗，含有堿性橙II、堿性嫩黃O、黃曲霉毒素B1的樣品的回收率分別在82.3％-101％、81.6％-103％和75.6％-108％范圍內(nèi)，堿性橙II、堿性嫩黃O、黃曲霉毒素B1的檢出限分別可達0.02mg/kg、0.02mg/kg和1.0μg/kg。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護范圍。