本發(fā)明涉及一種電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器及其檢測方法，尤其是涉及一種電位分辨同時檢測兩種腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用方法，屬于免疫傳感檢測分析技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器是電化學(xué)發(fā)光和免疫傳感器相結(jié)合的產(chǎn)物，由于其靈敏度高、特異性好、操作簡便等優(yōu)點，具有廣闊的應(yīng)用前景，并被廣泛應(yīng)用于臨床分析、藥物分析和環(huán)境檢測領(lǐng)域。

惡性腫瘤也就是我們所說的癌癥，是一類嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病。腫瘤專家指出，腫瘤的早發(fā)現(xiàn)和早診斷是提高腫瘤患者生存率和治愈率的關(guān)鍵。大量資料證實，不同腫瘤既可能具有不同的腫瘤標(biāo)志物，也可能具有相同的腫瘤標(biāo)志物，如：癌胚抗原最早發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌病人的血清和癌變組織中，隨后，在胰腺癌、肝癌病人的血清和癌變組織中也檢出癌胚抗原。而同一種腫瘤由于組織類型不同，也有可能有一種或幾種腫瘤標(biāo)志物。在腫瘤標(biāo)志物的檢測過程中，特異性越強，診斷人們患有某種癌癥的準(zhǔn)確度就越高；靈敏度越高，某種癌癥的檢出率就高，漏診的可能性就越小。

良好的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)具有高特異性、高靈敏度和易于檢測等特點。然而，大量的臨床研究表明，探求一種具有100%的特異性和敏感性且其水平與腫瘤大小、分期及預(yù)后相關(guān)的理想的腫瘤標(biāo)志物非常困難。在臨床診斷中，常常選擇兩個或更多特異性較高、可以互補的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測來提高腫瘤檢出的準(zhǔn)確度和靈敏度。與單種腫瘤標(biāo)志物檢測相比，聯(lián)合檢測還具有縮短分析時間、降低檢測成本、提高分析效率等優(yōu)點。目前，同時檢測兩種腫瘤標(biāo)志物的免疫傳感器大多采用多通道陣列模式，或者運用兩種不同的檢測方法，其操作過程繁瑣，檢測方法復(fù)雜，嚴(yán)重影響了檢測的時效性。因此，開發(fā)靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡便的同時檢測兩種腫瘤標(biāo)志物的傳感器是迫切需求。

目前，檢測子宮頸癌的腫瘤標(biāo)志物鱗狀細(xì)胞癌抗原（SCCA）和糖類抗原125（CA125）的免疫分析方法主要有：熒光免疫分析法（FIA）、電化學(xué)免疫分析法（ECIA）、和電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（ECLIA）等，這些方法都有一定的靈敏度和準(zhǔn)確度，但也各有一定的不足之處：有的儀器昂貴、操作復(fù)雜、技術(shù)要求高，有的步驟繁多、易出現(xiàn)假陽性和假陰性，更重要的是，這些方法大多難以實現(xiàn)靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡便的兩種腫瘤標(biāo)志物的同時檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單，特異性強，靈敏度和準(zhǔn)確率高的電位分辨雙腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種電位分辨雙腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法，包括以下步驟：

（1）第一信號單元（anti-CA125₂-Ru-NH₂@GO-COOH）的制備方法

a. 取30～50 mL 2.0～3.0 mg/mL的氧化石墨烯（GO）于三頸燒瓶中，加入5～10 mL溴化氫（HBr），常溫下攪拌12～15 h，然后加入1.0～2.0 g乙二酸，常溫下攪拌4 h，于8000 rpm離心棄去上清液，然后用蒸餾水洗滌至中性，定容至30～50 mL，得到羧基化的氧化石墨烯（GO-COOH）溶液；

b. 取200 μL上述羧基化的氧化石墨烯溶液于1.5 mL玻璃瓶中，超聲10 min，然后加入200～400 μL偶聯(lián)試劑，混合均勻，同時滴加0.1～0.2 mol/L鹽酸溶液至溶液pH為4.0～6.0，振蕩孵育1～3 h，加入1 mL二次水清洗，于8000 rpm離心3次去除上清液以去除剩余的偶聯(lián)試劑后，定容至200～300 μL；然后加入50～100 μL 10^-6～10^-4 U/mL anti-CA125₂和50～100 μL 10^-4～10^-2 mol/L二(2,2-聯(lián)吡啶)(5-氨基-1,10-鄰菲咯啉)合釕(II) （Ru-NH₂），用0.1～0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH為8.0～10.0，繼續(xù)振蕩孵育3～5 h；然后加入50～100 μL 2wt%牛血清白蛋白溶液以封閉非特異性吸附位點，繼續(xù)孵育1～2 h；再加入蒸餾水離心清洗至中性后，定容至100～200 μL，即得到第一信號單元anti-CA125₂- Ru-NH₂@GO-COOH；

（2）第二信號單元（anti-SCCA₂-AuNPs/g-C₃N₄）的制備方法

a. 氮化碳（g-C₃N₄）薄膜的合成：將三聚氰胺在500～600 ℃下加熱3～5 h，真空干燥后，得到氮化碳（g-C₃N₄）粉末；取0.8～1.5 g 氮化碳粉末加入到80～120 mL 4～6 mol/L HNO₃中，于120～150 ℃下回流24～48小時后，自然冷卻至室溫，12000 rpm離心棄去上清液，然后用蒸餾水洗滌至中性，超聲4個小時，8000 rpm離心半個小時，取上清液，即得到產(chǎn)物氮化碳薄膜溶液；

b. 將30～70 mL氮化碳薄膜溶液加入到 30～70 mL 膠體金溶液中，室溫下攪拌16～24 h，然后于6000～8000 rpm離心半小時后，去除沒有連接上的膠體金，取其上清液即得到AuNPs/g-C₃N₄溶液；然后取200 μL AuNPs/g-C₃N₄溶液于玻璃瓶中，加入30～50 μL 10^-6～10^-4 mg/mL anti-SCCA₂溶液后孵育3～5 h；然后加入50～100 μL 2wt%牛血清白蛋白溶液以封閉非特異性吸附位點，繼續(xù)孵育1～2 h；加入1 mL二次水清洗，于12000 rpm離心去除上清液以去除剩余的牛血清白蛋白，即得第二信號單元anti-SCCA₂-AuNPs/g-C₃N₄溶液；

（3）電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的組裝

a. 將直徑為3～5 mm的金電極依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al₂O₃拋光粉在麂皮上拋光至鏡面，用蒸餾水沖洗干凈，再依次在乙醇、蒸餾水中超聲洗滌，清洗后的電極放入濃H₂SO₄和H₂O₂按體積比7:3混合成的混合溶液中浸泡5～10 min，取出洗凈，然后在0.5 mol/L 硫酸溶液中用循環(huán)伏安掃描處理，掃描速度為50 mV/s，電壓范圍為-0.3～1.5 V，持續(xù)掃描得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖后，取出用二次蒸餾水洗凈待用；

b. 將上述預(yù)處理過的金電極插入20～30 μL 含10^-6～10^-4 U/mL anti-CA125₁和10^-6～10^-4 mg/mL anti-SCCA₁的混合溶液中，孵育16 h，然后加入50～100 μL 2wt%牛血清白蛋白溶液以封閉非特異性吸附位點，繼續(xù)孵育1～2 h，用蒸餾水清洗去除剩余的牛血清白蛋白溶液，然后孵育在50～100 μL含有CA125和SCCA的待測混合溶液中，于37 ℃中孵育1～2 h后，清洗；再置于10～20 μL由步驟（1）b所得的anti-CA125₂-Ru-NH₂@GO-COOH溶液和步驟（2）b所得的anti-SCCA₂-AuNPs/g-C₃N₄溶液按等體積混合而成的混合溶液，于37 ℃中孵育1～2 h后，清洗；即得到同時檢測CA125和SCCA兩種腫瘤標(biāo)志物的電位分辨雙腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。

步驟（1）b中所述的偶聯(lián)試劑為1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于水中得到，所述的偶聯(lián)試劑中1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）的摩爾濃度為10～100 mmol/L，所述的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾濃度為1～10 mmol/L。

步驟（2）b中膠體金溶液的制備方法如下：將80～120 mL 蒸餾水和1～3 mL 1 wt%氯金酸溶液依次加入到燒杯中，在磁力加熱攪拌下加熱至沸騰，然后迅速加入3～5 mL的1wt%檸檬酸鈉水溶液，繼續(xù)煮沸至溶液顏色變成深紅色（黑—藍(lán)—深紅），然后沸騰狀態(tài)下繼續(xù)加熱攪拌20 min，制備得到膠體金溶液，于4 ℃密封保存。

上述電位分辨雙腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器同時檢測CA125和SCCA兩種腫瘤標(biāo)志物的方法，具體步驟如下：將上述步驟（3）得到的電位分辨雙腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器作為工作電極；采用鉑電極作為對電極，Ag/AgCl電極或者飽和甘汞電極作為參比電極，構(gòu)成三電極體系；將三電極體系放入緩沖溶液，啟動電化學(xué)反應(yīng)，測量電化學(xué)發(fā)光強度；獲得待測CA125和SCCA的混合溶液對應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強度值；根據(jù)電化學(xué)發(fā)光強度值與腫瘤標(biāo)志物溶液濃度對數(shù)之間的定量關(guān)系，計算得到待測樣品溶液中CA125和SCCA腫瘤標(biāo)志物的準(zhǔn)確濃度。

所述的緩沖溶液為：pH = 7.5～8.5的磷酸鹽緩沖溶液，含有10～30 mmol/L K₂S₂O₈、40～80 mmol/L 二丁基氨基乙醇（DBAE）、80～100 mmol/L KCl。

所述的電化學(xué)反應(yīng)的條件如下：多電位階躍計時電流法，脈沖寬度：0.25秒；脈沖間隔：30秒；電壓設(shè)定：0～-1.30～0～1.25 V，脈沖電壓分別為-1.30 V，1.25 V。

發(fā)明原理：本發(fā)明中使用金電極固定抗體anti-CA125₁和anti-SCCA₁作為捕獲單元，CA125和SCCA作為目標(biāo)物，anti-CA125₂-Ru-NH₂@GO-COOH和anti-SCCA₂-AuNPs/g-C₃N₄作為檢測探針，開發(fā)了一種電位分辨雙腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，具備以下多種功能：（1）羧基化的氧化石墨烯具有較大的表面積以及豐富的羧基基團，可以利用羧基和氨基之間的反應(yīng)，使得大量的anti-CA125₂和Ru-NH₂結(jié)合到其表面；（2）氮化碳材料不僅具有較大的表面積，通過AuNPs結(jié)合大量的anti-SCCA₂，其本身還具有極強的電化學(xué)發(fā)光的性質(zhì)；（3）anti-CA125₂和anti-SCCA₂可以特異性結(jié)合CA125和SCCA，不會發(fā)生交叉反應(yīng)。

本發(fā)明構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，可以特異性分別俘獲兩種腫瘤標(biāo)志物，當(dāng)兩種檢測探針通過層層組裝形成“第一抗體-抗原-第二抗體”免疫復(fù)合物被結(jié)合到傳感器表面之后，在電化學(xué)反應(yīng)激發(fā)下Ru-NH₂和氮化碳兩種發(fā)光材料即會分別在1.25 V和-1.30 V的電位下產(chǎn)生穩(wěn)定的電化學(xué)發(fā)光信號；目標(biāo)物的濃度越大，結(jié)合的發(fā)光物就會越多，電化學(xué)發(fā)光強度就會越高，電化學(xué)發(fā)光強度與目標(biāo)物的濃度的對數(shù)之間呈線性關(guān)系。據(jù)此可以實現(xiàn)樣品中兩種腫瘤標(biāo)志物的未知濃度的檢測。

與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

（1）操作簡單。目前同時檢測雙目標(biāo)物的傳感器，大多使用多電極構(gòu)成傳感器陣列或者使用光電兩種檢測方法，其操作過程復(fù)雜繁瑣，需用時間較長，嚴(yán)重影響檢測的時效性。本發(fā)明選擇兩種不同的發(fā)光物質(zhì)分別標(biāo)記兩種抗體，只需調(diào)控不同的電壓，在一個循環(huán)伏安周期內(nèi)便會產(chǎn)生兩個電化學(xué)發(fā)光信號，即可實現(xiàn)同時檢測兩種目標(biāo)物的目的。

（2）高靈敏度。構(gòu)建Ru-NH₂@GO-COOH和AuNPs/g-C₃N₄兩種復(fù)合材料，導(dǎo)電性好，大大增強電子傳遞速度，有效地提高Ru-NH₂和g-C₃N₄電化學(xué)發(fā)光效率，檢測靈敏度高。

（3）高特異性。常見其他腫瘤標(biāo)志物對本檢測體系均無干擾。原因在于：本發(fā)明是基于腫瘤標(biāo)志物抗體與腫瘤標(biāo)志物之間的特異性識別與結(jié)合而構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，干擾物質(zhì)不是特定抗體的目標(biāo)物，因此待測液中的干擾物質(zhì)并不能與特定抗體結(jié)合，故對本檢測體系無干擾。

（4）結(jié)果準(zhǔn)確?；厥章示?0%～110%之間。

綜上所述，本發(fā)明首次公開了一種電位分辨同時檢測雙腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用，其利用二(2,2-聯(lián)吡啶)(5-氨基-1,10-鄰菲咯啉)合釕(II)@羧基化氧化石墨烯（Ru-NH₂@GO-COOH）和納米金/氮化碳（AuNPs/g-C₃N₄）兩種復(fù)合納米材料，可以實現(xiàn)同時檢測兩種子宮頸癌的腫瘤標(biāo)志物鱗狀細(xì)胞癌抗原（SCCA）和糖類抗原125（CA125），制備過程簡單，特異性強，靈敏度和準(zhǔn)確率高。

附圖說明

圖1為本發(fā)明電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備流程圖；

圖2為含有0.001 ng/mL SCCA和0.001 U/mL CA125的溶液A測得的電化學(xué)發(fā)光信號圖；其中a為SCCA，b為CA125；

圖3為含有0.01 ng/mL SCCA和0.01 U/mL CA125的溶液B測得的電化學(xué)發(fā)光信號圖；其中a為SCCA，b為CA125；

圖4為含有0.1 ng/mL SCCA和0.1 U/mLCA125的溶液C測得的電化學(xué)發(fā)光信號圖；其中a為SCCA，b為CA125；

圖5為含有1 ng/mL SCCA和0.5 U/mL CA125的溶液D測得的電化學(xué)發(fā)光信號圖；其中a為SCCA，b為CA125；

圖6為含有5 ng/mL SCCA和1 U/mL CA125的溶液E測得的電化學(xué)發(fā)光信號圖；其中a為SCCA，b為CA125；

圖7為含有10 ng/mL SCCA和5 U/mL CA125的溶液F測得的電化學(xué)發(fā)光信號圖；其中a為SCCA，b為CA125；

圖8為含有50 ng/mL SCCA和10 U/mL CA125的溶液G測得的電化學(xué)發(fā)光信號圖；其中a為SCCA，b為CA125；

圖9為含有100 ng/mL SCCA和100 U/mL CA125的溶液H測得的電化學(xué)發(fā)光信號圖；其中a為SCCA，b為CA125；

圖10為不同濃度SCCA的電化學(xué)發(fā)光強度 (y)—濃度(x)對數(shù)線性圖；

圖11為不同濃度CA125的電化學(xué)發(fā)光強度 (y)—濃度(x)對數(shù)線性圖；

圖12為空白溶液、0.001 ng/mLSCCA+0 U/mLCA125混合溶液、0 ng/mLSCCA+0.001 U/mLCA125混合溶液測得的電化學(xué)發(fā)光強度值。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

具體實施例一

實施例1

一種電位分辨雙腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法，包括以下步驟：

（1）第一信號單元（anti-CA125₂-Ru-NH₂@GO-COOH）的制備方法

a.取40 mL 2.5 mg/mL的氧化石墨烯于三頸燒瓶中，加入8 mL溴化氫，常溫下攪拌13 h，然后加入1.5 g乙二酸，常溫下攪拌4 h，于8000 rpm離心棄去上清液，然后用蒸餾水洗滌至中性，定容至40 mL，得到羧基化的氧化石墨烯（GO-COOH）溶液；

b.取200 μL上述羧基化的氧化石墨烯溶液于1.5 mL玻璃瓶中，超聲10 min，然后加入300 μL偶聯(lián)試劑，混合均勻，同時滴加0.15 mol/L鹽酸溶液至溶液pH為5.0，振蕩孵育2 h，用二次水清洗后，于8000 rpm離心3次去除上清液以去除剩余的偶聯(lián)試劑后，定容至250 μL；然后加入80 μL 10^-5 U/mL anti-CA125₂溶液和80 μL 10^-3 mol/L Ru-NH₂溶液，用0.15 mol/L NaOH溶液調(diào)pH為9.0，繼續(xù)振蕩孵育4 h；然后加入80 μL 2wt%牛血清白蛋白溶液以封閉非特異性吸附位點，繼續(xù)孵育1.5 h；再加入蒸餾水離心清洗至中性后，定容至150 μL，即得到第一信號單元anti-CA125₂- Ru-NH₂@GO-COOH溶液；其中偶聯(lián)試劑為1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于水中得到，偶聯(lián)試劑中1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）的摩爾濃度為50 mmol/L， N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾濃度為5 mmol/L；

（2）第二信號單元（anti-SCCA₂-AuNPs/g-C₃N₄）的制備方法

a．氮化碳（g-C₃N₄）薄膜的合成：將三聚氰胺在550 ℃下加熱4 h，真空干燥后，得到氮化碳（g-C₃N₄）粉末；取1.2 g 氮化碳粉末加入到100 mL 5 mol/L HNO₃中，于135 ℃下回流36小時后，自然冷卻至室溫，12000 rpm離心棄去上清液，然后用蒸餾水洗滌至中性，超聲4個小時，8000 rpm離心半個小時，取上清液，即得到產(chǎn)物氮化碳薄膜溶液；

b．將40 mL氮化碳薄膜溶液加入到 40 mL 膠體金溶液中，室溫下攪拌20 h，然后于7000 rpm離心半小時后，去除沒有連接上的膠體金，取其上清液即得到AuNPs/g-C₃N₄溶液；然后取200 μL AuNPs/g-C₃N₄溶液于玻璃瓶中，加入40 μL 10^-5 mg/mL anti-SCCA₂溶液后孵育3～5 h；然后加入80 μL 2wt%牛血清白蛋白溶液以封閉非特異性吸附位點，繼續(xù)孵育1～2 h；用蒸餾水清洗后，于12000 rpm離心去除上清液以去除剩余的牛血清白蛋白，即得第二信號單元anti-SCCA₂-AuNPs/g-C₃N₄溶液；其中膠體金溶液的制備方法如下：將100 mL 蒸餾水和2 mL 1 wt%氯金酸溶液依次加入到燒杯中，在磁力加熱攪拌下加熱至沸騰，然后迅速加入4 mL的1wt%檸檬酸鈉水溶液，繼續(xù)煮沸至溶液顏色變成深紅色（黑—藍(lán)—深紅），然后沸騰狀態(tài)下繼續(xù)加熱攪拌20 min，制備得到膠體金溶液，于4 ℃密封保存；

（3）電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的組裝

a. 將直徑為3～5 mm的金電極依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al₂O₃拋光粉在麂皮上拋光至鏡面，用蒸餾水沖洗干凈，再依次在乙醇、蒸餾水中超聲洗滌，清洗后的電極放入濃H₂SO₄和H₂O₂按體積比7:3混合成的混合溶液中浸泡5～10 min，取出洗凈，然后在0.5 mol/L 硫酸溶液中用循環(huán)伏安掃描處理，掃描速度為50 mV/s，電壓范圍為-0.3～1.5 V，持續(xù)掃描得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖后，取出用二次蒸餾水洗凈待用；

b. 將上述預(yù)處理過的金電極插入25 μL 含10^-5 U/mL anti-CA125₁和10^-5 mg/mL anti-SCCA₁的混合溶液中，孵育16 h，然后加入80 μL 2wt%牛血清白蛋白溶液以封閉非特異性吸附位點，繼續(xù)孵育1.5 h，用蒸餾水清洗離心去除剩余的牛血清白蛋白溶液，然后孵育在80 μL含有CA125和SCCA的待測混合溶液中，置37 ℃中孵育1.5 h后，清洗；再置于15 μL由步驟（1）b所得的anti-CA125₂-Ru-NH₂@GO-COOH溶液和步驟（2）b所得的anti-SCCA₂-AuNPs/g-C₃N₄溶液按等體積混合而成的混合溶液，于37 ℃中孵育1.5 h后，清洗；即得到同時檢測CA125和SCCA兩種腫瘤標(biāo)志物的電位分辨雙腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。

實施例2

同上述實施例1，其區(qū)別在于：

步驟（1）第一信號單元的制備過程中：

a.取30 mL 3.0 mg/mL的氧化石墨烯于三頸燒瓶中，加入5 mL溴化氫，常溫下攪拌12 h，然后加入1.0 g乙二酸，常溫下攪拌4 h，于8000 rpm離心棄去上清液，然后用蒸餾水洗滌至中性，定容至30 mL，得到羧基化的氧化石墨烯溶液；

b.取200 μL上述羧基化的氧化石墨烯溶液于1.5 mL玻璃瓶中，超聲10 min，然后加入200 μL偶聯(lián)試劑，混合均勻，同時滴加0.1 mol/L鹽酸溶液至溶液pH為6.0，振蕩孵育1 h，用二次水清洗后，于8000 rpm離心3次去除上清液后，定容至200～300 μL；然后加入50 μL 10^-4 U/mL anti-CA125₂溶液和50 μL 10^-2 mol/L Ru-NH₂溶液，用0.1mol/L NaOH溶液調(diào)pH為8.0，繼續(xù)振蕩孵育3 h；然后加入50 μL 2wt%牛血清白蛋白溶液，繼續(xù)孵育1 h；再加入蒸餾水離心清洗至中性后，定容至100 μL，即得到第一信號單元anti-CA125₂- Ru-NH₂@GO-COOH溶液；偶聯(lián)試劑中1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）的摩爾濃度為10 mmol/L，所述的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾濃度為10 mmol/L；

步驟（2）第二信號單元的制備過程中：

a．氮化碳（g-C₃N₄）薄膜的合成：將三聚氰胺在500 ℃下加熱5 h，真空干燥后，得到氮化碳（g-C₃N₄）粉末；取0.8 g 氮化碳粉末加入到80 mL 6 mol/L HNO₃中，于120℃下回流48小時；

b．將30 mL氮化碳薄膜溶液加入到 70 mL 膠體金溶液中，室溫下攪拌16 h，然后于6000 rpm離心半小時后，取其上清液即得到AuNPs/g-C₃N₄溶液；然后取200 μL AuNPs/g-C₃N₄溶液于玻璃瓶中，加入30 μL 10^-6 mg/mL anti-SCCA₂溶液后孵育3 h；然后加入50 μL 2wt%牛血清白蛋白溶液，繼續(xù)孵育1 h；用蒸餾水清洗后，于12000 rpm離心去除上清液，即得第二信號單元anti-SCCA₂-AuNPs/g-C₃N溶液₄；其中膠體金溶液的制備方法如下：將80 mL 蒸餾水和1 mL 1 wt%氯金酸溶液依次加入到燒杯中，在磁力加熱攪拌下加熱至沸騰，然后迅速加入3 mL的1wt%檸檬酸鈉水溶液；

步驟（3）電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的組裝中：

將上述預(yù)處理過的金電極插入20 μL 含10^-4 U/mL anti-CA125₁和10^-4 mg/mL anti-SCCA₁的混合溶液中，孵育16 h，然后加入50 μL 2wt%牛血清白蛋白溶液，繼續(xù)孵育1～2 h，用蒸餾水清洗離心，然后孵育在50 μL含有CA125和SCCA的待測混合溶液中，置37 ℃中孵育1 h后，清洗；再置于10 μL由步驟（1）b所得的anti-CA125₂-Ru-NH₂@GO-COOH溶液和步驟（2）b所得的anti-SCCA₂-AuNPs/g-C₃N₄溶液按等體積混合而成的混合溶液，于37 ℃中孵育1 h后，清洗即可。

實施例3

同上述實施例1，其區(qū)別在于：

步驟（1）第一信號單元的制備過程中：

a.取50 mL 2.0 mg/mL的氧化石墨烯（GO）于三頸燒瓶中，加入10 mL溴化氫（HBr），常溫下攪拌15 h，然后加入2.0 g乙二酸，常溫下攪拌4 h，于8000 rpm離心棄去上清液，然后用蒸餾水洗滌至中性，定容至50 mL，得到羧基化的氧化石墨烯（GO-COOH）溶液；

b.取200 μL上述羧基化的氧化石墨烯溶液于1.5 mL玻璃瓶中，超聲10 min，然后加入400 μL偶聯(lián)試劑，混合均勻，同時滴加0.2 mol/L鹽酸溶液至溶液pH為4.0，振蕩孵育3 h，用二次水清洗后，于8000 rpm離心3次去除上清液以去除剩余的偶聯(lián)試劑后，定容至300 μL；然后加入100 μL 10^-6 U/mL anti-CA125₂和100 μL 10^-4 mol/L Ru-NH₂，用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH為10.0，繼續(xù)振蕩孵育5 h；然后加入100 μL 2wt%牛血清白蛋白溶液，繼續(xù)孵育2 h；再加入蒸餾水離心清洗至中性后，定容至200 μL，即得到第一信號單元anti-CA125₂- Ru-NH₂@GO-COOH；其中偶聯(lián)試劑中1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）的摩爾濃度為100 mmol/L，所述的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾濃度為1 mmol/L；

步驟（2）第二信號單元的制備過程中：

a．氮化碳（g-C₃N₄）薄膜的合成：將三聚氰胺在600 ℃下加熱3 h，真空干燥后，得到氮化碳（g-C₃N₄）粉末；取1.5 g 氮化碳粉末加入到120 mL 4 mol/L HNO₃中，于150 ℃下回流24小時；

b．將70 mL氮化碳薄膜溶液加入到 30 mL 膠體金溶液中，室溫下攪拌24 h，然后于8000 rpm離心半小時后，取其上清液即得到AuNPs/g-C₃N₄溶液；然后取200 μL AuNPs/g-C₃N₄溶液于玻璃瓶中，加入50 μL 10^-6 mg/mL anti-SCCA₂后孵育5 h；然后加入100 μL 2wt%牛血清白蛋白溶液以封閉非特異性吸附位點，繼續(xù)孵育2 h；用蒸餾水清洗后，于12000 rpm離心去除上清液，即得第二信號單元anti-SCCA₂-AuNPs/g-C₃N₄；其中膠體金溶液的制備方法如下：將120 mL 蒸餾水和3 mL 1 wt%氯金酸溶液依次加入到燒杯中，在磁力加熱攪拌下加熱至沸騰，然后迅速加入5 mL的1wt%檸檬酸鈉水溶液；

步驟（3）電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的組裝中：

將上述預(yù)處理過的金電極插入30 μL 含10^-6 U/mL anti-CA125₁和10^-6 mg/mL anti-SCCA₁的混合溶液中，孵育16 h，然后加入100 μL 2wt%牛血清白蛋白溶液以封閉非特異性吸附位點，繼續(xù)孵育2 h，用蒸餾水清洗離心去除剩余的牛血清白蛋白溶液，然后孵育在100 μL含有CA125和SCCA的待測混合溶液中，置37 ℃中孵育2 h后，清洗；再置于20 μL由步驟（1）b所得的anti-CA125₂-Ru-NH₂@GO-COOH溶液和步驟（2）b所得的anti-SCCA₂-AuNPs/g-C₃N₄溶液按等體積混合而成的混合溶液，于37 ℃中孵育2 h后，清洗即可。

具體實施例二

一種利用具體實施例一制備的電位分辨雙腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器同時檢測CA125和SCCA兩種腫瘤標(biāo)志物的方法，具體步驟如下：

將具體實施例一步驟（3）a中預(yù)處理過的金電極插入20～30 μL 含10^-6～10^-4 U/mL anti-CA125₁和10^-6～10^-4 mg/mL anti-SCCA₁的混合溶液中，孵育16 h，然后加入50～100 μL 2wt%牛血清白蛋白溶液以封閉非特異性吸附位點，繼續(xù)孵育1～2 h，用蒸餾水清洗離心去除剩余的牛血清白蛋白溶液，然后孵育在含有不同濃度的CA125和SCCA的混合溶液50～100 μL中，置37 ℃中孵育1～2 h后，清洗；再置于10～20 μL由具體實施例一步驟（1）b所得的anti-CA125₂-Ru-NH₂@GO-COOH和具體實施例一步驟（2）b所得的anti-SCCA₂-AuNPs/g-C₃N₄按等體積混合而成的混合溶液，置于37 ℃中孵育1～2 h后，清洗；得到一系列不同濃度的CA125和SCCA的混合溶液對應(yīng)的電位分辨雙腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，以之作為工作電極；采用鉑電極作為對電極，Ag/AgCl電極或者飽和甘汞電極作為參比電極，構(gòu)成三電極體系；將三電極體系放入緩沖溶液，啟動電化學(xué)反應(yīng)，測量電化學(xué)發(fā)光強度；獲得一系列不同濃度的CA125和SCCA的混合溶液對應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強度值，建立電化學(xué)發(fā)光強度值與CA125和SCCA溶液濃度之間的定量關(guān)系；根據(jù)這個定量關(guān)系可以檢測樣品中CA125和SCCA的未知濃度。

其中緩沖溶液為：pH = 7.5～8.5的磷酸鹽緩沖溶液，含有10～30 mmol/L K₂S₂O₈、40～80 mmol/L 二丁基氨基乙醇（DBAE）、80～100 mmol/L KCl。電化學(xué)反應(yīng)的條件如下：多電位階躍計時電流法，脈沖寬度：0.25秒；脈沖間隔：30秒；電壓設(shè)定：0～-1.30～0～1.25 V，脈沖電壓分別為-1.30 V，1.25 V。

不同濃度的CA125和SCCA的混合溶液分別為

溶液A中含有0.001 ng/mL 的SCCA和0.001 U/mL CA125，測得的電化學(xué)發(fā)光信號圖如圖2所示；

溶液B中含有0.01 ng/mL SCCA和0.01 U/mL CA125，測得的電化學(xué)發(fā)光信號圖如圖3所示；

溶液C中含有0.1 ng/mL SCCA和0. 1 U/mL CA125，測得的電化學(xué)發(fā)光信號圖如圖4所示；

溶液D中含有1 ng/mL SCCA和0.5 U/mL CA125，測得的電化學(xué)發(fā)光信號圖如圖5所示；

溶液E中含有5 ng/mL SCCA和1 U/mL CA125，測得的電化學(xué)發(fā)光信號圖如圖6所示；

溶液F中含有10 ng/mL SCCA和5 U/mL CA125，測得的電化學(xué)發(fā)光信號圖如圖7所示；

溶液G中含有50 ng/mL SCCA和10 U/mL CA125，測得的電化學(xué)發(fā)光信號圖如圖8所示；

溶液H中含有100 ng/mL SCCA和100 U/mL CA125，測得的電化學(xué)發(fā)光信號圖如圖9所示。

由圖2-圖9說明在SCCA和CA125的檢測范圍內(nèi)的各個濃度下均可以產(chǎn)生強而穩(wěn)定的信號，說明該傳感器可行。

不同濃度SCCA的ECL信號(y)—濃度(x)對數(shù)線性圖如圖10所示，線性方程為：y = 1998.8 *logx + 6979.3，相關(guān)系數(shù)為0.996，線性范圍為0.001 ng/mL-100 ng/mL，檢測限為0.4 pg/mL；不同濃度CA125的ECL信號(y)—濃度(x)對數(shù)線性圖如圖11所示，線性方程為：y = 1482.5 *logx + 5802.3，相關(guān)系數(shù)為0.997，線性范圍為0.001 U/mL-100 U/mL，檢測限為0.33 mU/mL，線性良好，可用于同時檢測待測樣品中SCCA和CA125濃度。

具體實施例三

特異性試驗設(shè)計及結(jié)果分析

如圖12所示，將上述具體實施例一制備的同時檢測SCCA和CA125傳感器，分別測定空白溶液、0.001 ng/mLSCCA+0 U/mLCA125混合溶液、0 ng/mLSCCA+0.001 U/mLCA125混合溶液，結(jié)果如圖12所示，對應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強度分別為240、350；990、380；280、1375。結(jié)果表明，該傳感器的特異性較好。

具體實施例四

為了考察上述具體實施例一方法的準(zhǔn)確性與實際應(yīng)用價值，采用加標(biāo)回收法，在空白的血清樣本中分別加入不同濃度的SCCA和CA125。使用本發(fā)明方法檢測結(jié)果可知，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于8.3%，回收率為93.4～109.0%，結(jié)果令人滿意。表明本發(fā)明對于血清中兩種腫瘤標(biāo)志物的同時檢測準(zhǔn)確度和精密度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表 1人血清中兩種腫瘤標(biāo)志物的檢測結(jié)果

以上結(jié)果說明，本發(fā)明構(gòu)建的同時檢測腫兩種瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，靈敏度高、檢測限低、選擇性高、操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

當(dāng)然，上述說明并非對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍。