技術(shù)特征：

1.一種利用分子熒光差異加標測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）提取液制備：取樣品研磨，稱取m_樣，加入0.09-0.11moL/L鹽酸，蛋黃與鹽酸溶液的質(zhì)量體積比(g/mL)為1:(2.6-4)，VB₂藥片與鹽酸溶液的質(zhì)量體積比(g/mL)為1:(1200-1600)，壓力水解提取，壓力為（8.0-12.0）×10⁴Pa，時間為20-40min，然后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4.5-7.5，蛋黃試液中加入木瓜蛋白酶溶液，木瓜蛋白酶加入量為蛋黃質(zhì)量的0.13-0.16%，VB₂藥片試液中加入淀粉酶溶液，淀粉酶加入量為VB₂藥片質(zhì)量的50-70%，然后在37-39℃保溫15-17h進行酶解；酶解液過濾，濾液定容至V_樣1；

（2）測定液制備：從V_樣1中取至少四份相同體積V_樣2的過濾試液，向第一份和第二份加入不同體積的核黃素標準溶液，核黃素標準溶液質(zhì)量體積濃度為，第二份標準溶液體積V_標2大于第一份V_標1，第四份加入低亞硫酸鈉將核黃素還原為無熒光物質(zhì)，作為空白，第三份既不加標準溶液，也不加低亞硫酸鈉，為原過濾試液；各管加水至V，然后加3-3.5% V的冰乙酸混勻，然后加入3-3.5% V的高錳酸鉀溶液，高錳酸鉀溶液濃度為25-35g/L，混勻，靜置，滴加雙氧水溶液至高錳酸鉀顏色褪去，振搖，使多余氧氣逸出，定容為V₁；

（3）測定：使用核黃素標準溶液在熒光分光光度計下掃描圖譜，根據(jù)圖譜獲得最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長，將（1）處理好的試液在最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長下測定，第一份加標試液相對發(fā)光值為I_標1，第二份加標試液相對發(fā)光值為I_標2，第三份待測樣品試液相對發(fā)光值為I_樣，第四份本底空白背景相對發(fā)光值為I₀，蛋黃或VB₂藥片中核黃素的質(zhì)量分數(shù)ω如式（1）；

。

2.如權(quán)利要求1所述的利用分子熒光差異加標法測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）提取液制備：取樣品研磨，稱取m_樣，加入0.1moL/L鹽酸，蛋黃與鹽酸溶液的質(zhì)量體積比(g/mL)為1:3.5，VB₂藥片與鹽酸溶液的質(zhì)量體積比(g/mL)為1:1400，壓力水解提取，壓力為10.3×10⁴Pa，時間為30min，然后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5.5，蛋黃試液中加入木瓜蛋白酶溶液，木瓜蛋白酶加入量為蛋黃質(zhì)量的0.15%，VB₂藥片試液中加入淀粉酶溶液，淀粉酶加入量為VB₂藥片質(zhì)量的60%，然后在39℃保溫16h進行酶解；酶解液過濾，取濾液定容至V_樣1；

（2）測定液制備：從V_樣1中取至少四份相同體積V_樣2的過濾試液，向第一份和第二份加入不同體積的核黃素標準溶液，核黃素標準溶液質(zhì)量體積濃度為，第二份標準溶液體積V_標2大于第一份V_標1，第四份加入低亞硫酸鈉將核黃素還原為無熒光物質(zhì)作為本底空白，第三份既不加標準溶液，也不加低亞硫酸鈉，為原過濾試液；各管加水至V，加3.3%V的冰乙酸混勻，然后加入3.3%V的高錳酸鉀溶液，高錳酸鉀溶液濃度為30g/L，混勻，靜置，滴加雙氧水溶液至高錳酸鉀顏色褪去，最后加水定容至V₁后測定；

（3）測定：使用核黃素標準溶液在熒光分光光度計下掃描圖譜，根據(jù)圖譜獲得最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長，將步驟（2）處理好的試液在最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長下測定。

3.如權(quán)利要求1所述的利用分子熒光差異加標法測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）提取液制備：取樣品研磨，稱取18-22g雞蛋黃或0.04-0.06gVB₂藥片，加入0.09-0.11moL/L鹽酸60-80 mL，壓力水解提取，壓力為（8-12）×10⁴Pa，時間為20-40min，然后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4.5-7.5，蛋黃試液中加入2.5-3.5mL 9-11g/L木瓜蛋白酶溶液，VB₂藥片試液中加入2.5-3.5mL 9-11g/L淀粉酶溶液，然后在37-39℃保溫15-17h進行酶解；酶解液過濾，取濾液定容至V_樣1；

（2）測定液制備：從V_樣1中取至少四份相同體積V_樣2的過濾液，體積為0.5-10mL，向第一份和第二份加入不同體積的核黃素標準溶液，核黃素標準溶液質(zhì)量體積濃度為，第二份標準溶液體積V_標2為第一份V_標1的1.2-2倍；第四份加入低亞硫酸鈉將核黃素還原為無熒光物質(zhì)作為本底空白；第三份既不加標準溶液，也不加低亞硫酸鈉，為原過濾試液；各管加水至14-16mL，然后向每份過濾液中加入0.4-0.6mL冰乙酸混勻，然后加入0.4-0.6mL的高錳酸鉀溶液，高錳酸鉀溶液濃度為25-35g/L，混勻，靜置，滴加雙氧水溶液至高錳酸鉀顏色褪去，最后各管加水定容至24-26mL；

（3）測定：使用核黃素標準溶液在熒光分光光度計下掃描圖譜，根據(jù)圖譜獲得最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長，將步驟（2）處理好的樣品試液在最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長下測定。

4.如權(quán)利要求3所述的利用分子熒光差異加標法測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，其特

征在于包括以下步驟：

（1）提取液制備：取樣品研磨，稱取20g雞蛋黃或0.05gVB₂藥片，加入0.1moL/L鹽酸70mL， 壓力水解提取，壓力為10.3×10⁴Pa，時間為30min，然后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5.5，蛋黃試液中加入3mL 10g/L木瓜蛋白酶溶液，VB₂藥片試液中加入3mL 10g/L淀粉酶溶液，然后在39℃保溫16h進行酶解；酶解液過濾，取濾液定容至100mL；

（2）測定液制備：從100mL濾液中取四份相同體積的過濾試液，雞蛋黃濾液體積為10.00mL，VB₂藥片濾液體積為1.00mL，向第一份和第二份提取液中分別加入1.00mL和2.00mL濃度為 1μg/mL的核黃素標準溶液；第四份加入低亞硫酸鈉將核黃素還原為無熒光物質(zhì)作為背景空白, 第三份既不加標準溶液，也不加低亞硫酸鈉，為原過濾試液；各管加水至15mL，然后向每份過濾液中加入0.5mL冰乙酸混勻，加入0.5mL的高錳酸鉀溶液，高錳酸鉀溶液濃度為30g/L，混勻，靜置，滴加雙氧水溶液至高錳酸鉀顏色褪去，最后加水定容至25mL；

（3）測定：使用核黃素標準溶液在熒光分光光度計下掃描圖譜，根據(jù)圖譜獲得最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長，將步驟（2）處理好的樣品試液在最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長下測定。

5.如權(quán)利要求1-4任一項所述的利用分子熒光差異加標法測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，其特征在于步驟（1）中NaOH溶液濃度為1moL/L，步驟（2）中雙氧水質(zhì)量體積濃度為3%。

6.如權(quán)利要求3-4任一項所述的利用分子熒光差異加標法測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，其特征在于蛋黃試液中加入低亞硫酸鈉溶液至少0.5mL，VB₂藥片試液中加入低亞硫酸鈉溶液至少5mL；低亞硫酸鈉溶液濃度為20g/100mL。

7.如權(quán)利要求3-4任一項所述的利用分子熒光差異加標法測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，其特征在于所述木瓜蛋白酶和淀粉酶溶液采用2.5moL/L乙酸鈉溶液配制。

8.如權(quán)利要求1-4任一項所述的利用分子熒光差異加標法測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，其特征在于核黃素標準溶液分為濃度為25μg/mL核黃素標準儲備液和濃度為1μg/mL核黃素標準使用液；核黃素標準儲備液配制過程如下：將標準品核黃素粉末狀結(jié)晶置于真空干燥器中，用五氧化二磷干燥管和硅膠干燥劑聯(lián)合干燥24h后，準確稱取50mg，置于2L容量瓶中，加入2.4mL冰乙酸和1.5mL水，將容量瓶置于30-40℃溫水中搖動，待其溶解，冷至室溫，加水定容至2L，移至棕色瓶內(nèi)，加甲苯覆蓋于溶液表面，于4℃冰箱中保存；核黃素標準使用液配制過程為：吸取25μg/mL核黃素標準儲備液2.00mL，置于50mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度，4℃冰箱保存，保存時間為1周。

9.如權(quán)利要求1-4任一項所述的利用分子熒光差異加標法測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，其特征在于蛋黃和VB₂藥片還采用直接干燥法進行水分含量的測定。