本發(fā)明涉及生物
技術領域：
，特別是涉及一種軍團菌抗體近紅外熒光檢測試劑盒及其用途。
背景技術：
：軍團菌為需氧的多性革蘭陰性菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，其傳染源是水源和空調系統(tǒng)，通過空氣傳播。軍團桿菌的菌體微小,懸浮在空氣中,人在正常呼吸時,會將空氣中含有軍團桿菌的氣溶膠吸入呼吸道內,致使軍團桿菌有機會侵染肺泡組織和巨噬細胞,引發(fā)炎癥,導致軍團菌病，易爆發(fā)流行。軍團桿菌可以侵犯身體內許多器官,因此其臨床表現(xiàn)常是多種多樣。軍團菌病根據(jù)臨床特征,一般分為兩種類型,一類為非肺炎型,病情較輕,潛伏期1～2d,似普通感冒或流感樣起病,有發(fā)熱、肌痛、咽喉疼痛、咳嗽等癥狀,約1～2周可自愈。另一類是肺炎型,潛伏期2～10d,其初發(fā)癥狀為全身不適、疲乏、肌肉酸痛、頭痛、發(fā)熱、咳嗽、胸痛、咳血、呼吸困難等,還能侵犯消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng),重癥病人可出現(xiàn)肝功能變化及腎功能衰竭,并可出現(xiàn)精神紊亂等臟器損害。技術實現(xiàn)要素：鑒于以上所述現(xiàn)有技術的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種軍團菌抗體近紅外熒光檢測試劑盒及其用途，用于建立高效可行的軍團菌抗體近紅外熒光檢測技術，解決現(xiàn)有技術中的問題。為實現(xiàn)上述目的及其他相關目的，本發(fā)明第一方面提供一種軍團菌抗體近紅外熒光檢測試劑盒，包括位于背板上的試劑條，試劑條從加樣端開始依次為樣品墊、標記有免疫熒光探針的玻璃纖維素膜、包被有重組軍團菌抗原的硝酸纖維素膜和吸水紙。優(yōu)選的，所述免疫熒光探針為重組軍團菌抗原包被的近紅外熒光乳膠微球顆粒。更優(yōu)選的，所述熒光乳膠微球顆粒的直徑為140-160nm。近紅外光(NIR)，是介于可見光(VIS)和中紅外光(MIR)之間的電磁波，ASTM定義NIR為波長在780nm-2526nm范圍內的電磁波。在近紅外光區(qū)，生物體自吸收或熒光強度很小，可避免背景干擾。同時由于散射光強度與波長的四次方呈反比，近紅外區(qū)的散射干擾大為減少。本發(fā)明第二方面提供所述軍團菌抗體近紅外熒光檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟：1)用磷酸鹽緩沖液將熒光乳膠微粒離心清洗并將乳膠顆粒分散，在清洗好的乳膠顆粒分散液中加入重組軍團菌抗原；加入EDCA使抗原與顆粒偶聯(lián)；再加入封閉液封閉乳膠顆粒上多余的基團，制備獲得探針溶液；2)利用微量蛋白點膜系統(tǒng)將含有重組軍團菌抗原的緩沖溶液噴加到硝酸纖維素膜上，烘干備用；3)用制備好的探針溶液浸潤玻璃纖維薄膜，真空干燥機中干燥備用；4)將包被重組軍團菌抗原的硝酸纖維素膜、標記有免疫熒光探針的玻璃纖維素膜、樣品墊、吸水紙及背板組裝制備成軍團菌抗體近紅外熒光檢測試劑盒。優(yōu)選的，所述步驟1中，磷酸鹽緩沖液為0.009-0.011mol/L，PH7.25-7.35的磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選的，所述步驟1中，熒光乳膠微粒的直徑為140-160nm。優(yōu)選的，所述步驟1中，乳膠顆粒、重組軍團菌抗原、EDCA的重量比為9-11：0.9-1.1：0.9-1.1。在本發(fā)明一實施例中，乳膠顆粒、重組軍團菌抗原、EDCA的投料量分別為1mg、100ug、100ug。優(yōu)選的，所述封閉液為乙醇胺，加入量為適量，本領域技術人員可根據(jù)實際情況調整乙醇胺的用量。更優(yōu)選的，所述封閉液還包括膠原蛋白，即封閉液為乙醇胺與膠原蛋白的混合液，乙醇胺與膠原蛋白的重量比為5-10:1。優(yōu)選的，所述步驟2中，所述緩沖溶液為PBS緩沖液。本領域技術人員可選取適當濃度和pH的PBS緩沖液。優(yōu)選的，所述步驟2中，含有重組軍團菌抗原的緩沖溶液中重組軍團菌抗原的濃度為1.8-2.2mg/ml。優(yōu)選的，所述步驟2中，重組軍團菌抗原的緩沖溶液的噴加量為0.9-1.1ul/cm。優(yōu)選的，所述步驟2中，烘干的具體條件為36-38℃烘箱烘干。優(yōu)選的，所述重組軍團菌抗原的制備方法如下：抗原的制備：將嗜肺軍團菌菌株接種在培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后用生理鹽水從平板上洗脫細菌，離心獲取菌泥(同時去除平板被洗脫的液體成分)，菌泥加適量PBS緩沖液超聲破裂，過陰離子柱純化，用NaCl水溶液洗滌，再用NaCl水溶液洗脫，洗脫液裝透析袋，用PEG包埋吸水濃縮，獲取抗原；優(yōu)選的，所述嗜肺軍團菌菌株購自ATCC。優(yōu)選的，所述抗原的制備過程中的培養(yǎng)條件具體為：37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)，3-5天后洗下菌苔。優(yōu)選的，所述抗原的制備過程中的培養(yǎng)基為緩沖活性碳酵母瓊脂培養(yǎng)基(BCYE)。優(yōu)選的，所述離心獲取菌泥的條件為4500-5500rpm。優(yōu)選的，所述用NaCL水溶液洗滌時，NaCl的溶液濃度為45-55mM。優(yōu)選的，所述用NaCl水溶液洗脫時，NaCl的溶液濃度為135-165mM。本發(fā)明第三方面提供所述軍團菌抗體近紅外熒光檢測試劑盒在軍團菌抗體檢測領域的用途。所述用途具體為使用所述軍團菌抗體近紅外熒光檢測試劑盒對軍團菌抗體進行檢測。近紅外光(NIR)是介于可見光(VIS)和中紅外光(MIR)之間的電磁波，ASTM定義NIR為波長在780nm-2526nm范圍內的電磁波。在近紅外光區(qū)，生物體自吸收或熒光強度很小，可避免背景干擾。同時由于散射光強度與波長的四次方呈反比，近紅外區(qū)的散射干擾大為減少。隨著激光熒光、傳感器、免疫檢測裝置的建立，近紅外熒光分析儀在免疫測定領域中顯示出極大的優(yōu)越性。本發(fā)明所提供的檢測試劑盒以患者的血清/血漿作為檢測樣本，結合近紅外熒光檢測技術，可快速，準確的檢測出患者標本中特異性、可溶性軍團菌抗體。軍團菌抗體近紅外熒光檢測法靈敏度高，特異性好，檢測過程中樣品收集及處理簡單，可快速準確的獲得結果，非常適合突發(fā)事件現(xiàn)場和基層使用，并可應用到臨床檢測中，為臨床治療提供定性依據(jù)。具體實施方式本發(fā)明所提供的軍團菌抗體近紅外熒光檢測法，實驗室考核結果顯示，不與其他血清型抗體及多種細菌發(fā)生交叉反應，與細菌培養(yǎng)結果較一致，具有較高的敏感性和特異性。整體而言，近紅外熒光法檢測軍團菌的可信度及各項性能均已達到臨床定性檢測的要求，有望用于由軍團菌引發(fā)的軍團病的快速早期診斷。以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發(fā)明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體實施方案， 而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復數(shù)形式。當實施例給出數(shù)值范圍時，應理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術和科學術語與本
技術領域：
技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據(jù)本
技術領域：
的技術人員對現(xiàn)有技術的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術的任何方法、設備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本
技術領域：
常規(guī)的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術及相關領域的常規(guī)技術。這些技術在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。本發(fā)明各實施例中試驗菌種由軍事醫(yī)學科學院提供；交叉實驗所用細菌由本實驗室培養(yǎng)保存。近紅外熒光檢測儀，由上海凱創(chuàng)生物技術有限公司開發(fā)提供。實施例11.抗原的制備：從ATCC購買嗜肺軍團菌菌株，接種在緩沖活性碳酵母瓊脂培養(yǎng)基(BCYE)上，37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)，3-5天后用生理鹽水從平板上洗脫細菌，5000rpm離心獲取菌泥(同時去除平板被洗脫的液體成分)，菌泥加適量PBS緩沖液超聲破裂，過陰離子柱純化，用50mMNaCl洗滌，再用150mMNaCl洗脫，洗脫液裝透析袋，用PEG包埋吸水濃縮，獲取抗原。2.免疫熒光重組軍團菌抗原顆粒制備：用0.01mol/L，PH7.3±0.05的磷酸鹽緩沖液將直徑為150nm的熒光乳膠微粒離心清洗2 遍并將乳膠顆粒分散，在清洗好的乳膠顆粒中加入重組軍團菌抗原；加入EDCA使抗原與顆粒偶聯(lián)；加入封閉液(乙醇胺：膠原蛋白＝8:1)封閉乳膠顆粒上多余的基團按每毫克微球乳膠100微克的待標記抗原，100微克的EDCA用量標記。每毫克的微球乳膠最后加相當于20微克的乙醇胺當量的封閉液進行封閉。3.試劑盒的制備：用0.01MpH7.2的PBS緩沖液稀釋重組軍團菌抗原至濃度2.0mg/ml，利用微量蛋白點膜系統(tǒng)將溶液噴加到適當孔徑的硝酸纖維素膜上，按1ul/cm的量進行噴膜，37℃烘箱烘干備用。用制備好的探針(步驟2制得的標記有重組軍團菌抗原的近紅外熒光乳膠微球)溶液浸潤玻璃纖維薄膜，真空干燥機中干燥備用。將包被重組軍團菌抗原的硝酸纖維素膜、標記有免疫熒光探針的玻璃纖維素膜、樣品墊、吸水紙及背板組裝制備成軍團菌抗體近紅外熒光檢測試劑盒。實施例2軍團菌抗體近紅外熒光檢測法與細菌培養(yǎng)對比實驗：試劑盒檢測：待測樣品為血清，使用0.01MpH7.2的PBS緩沖液稀釋，稀釋比例為1：1。待測樣品及試劑盒均平衡至室溫開始檢測，用滴管在每個試劑盒的加樣孔內滴加3滴樣本(約120-150ul)。15分鐘時，用近紅外熒光檢測儀檢測熒光信號，并用熒光儀器進行判斷，分析儀的對熒光信號的檢測范圍是AD值0-10000，根據(jù)儀器的性能，CUTOFF值為50，檢測AD值大于等于50為陽性結果。實驗結果與細菌培養(yǎng)結果對比驗證。用于細菌培養(yǎng)的血清樣本與血漿樣本來自相同的患者。軍團菌抗體近紅外熒光檢測法與血清細菌培養(yǎng)結果如表1所示：表1Sensitivity＝75％Specificity＝94.11％此外，以血漿為待測樣品時，其檢測結果與血清細菌培養(yǎng)檢測結果相符。實施例3交叉實驗：在軍團菌抗體近紅外檢測試劑盒分別滴加制備好的糞腸球菌、屎腸球菌、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、克雷伯菌、乳酸桿菌、淋病奈瑟菌、綠膿假單胞菌、大腸桿菌、人型支原體、解脲脲原體、金黃色葡萄球菌、鏈球菌及幽門螺旋菌菌液(1×106CFU/ml)，進行交叉實驗檢測，檢測以上細菌是否對本試劑盒檢測結果產生影響，軍團菌抗體近紅外熒光檢測試劑與細菌交叉實驗結果如表2所示，各細菌交叉實驗中均無交叉反應發(fā)生：表2交叉物結果交叉物結果糞腸球菌-淋病奈瑟菌-屎腸球菌-綠膿假單胞菌-大腸埃希菌-大腸桿菌-鮑曼不動桿菌-人型支原體-克雷伯菌-解脲脲原體-乳酸桿菌-金黃色葡萄球菌-幽門螺旋菌-鏈球菌-由實施例2中的表1和實施例3中的表2可以看出，本試劑盒具有高靈敏度、高特異性的優(yōu)點，且不與其他細菌發(fā)生交叉反應，穩(wěn)定性及重復性良好。綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術中的種種缺點而具高度產業(yè)利用價值。上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬
技術領域：
中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發(fā)明的權利要求所涵蓋。當前第1頁1 2 3