本發(fā)明屬于分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微量馬來酰肼分離方法。

背景技術(shù)：

馬來酰肼，化學(xué)名稱為順丁烯二酰肼（maleic hydrazide，MH），別名為抑芽丹，作為一種選擇性的植物抑制劑和除草劑，被廣泛應(yīng)用于植物、農(nóng)作物等領(lǐng)域中。馬來酰肼存在三種互變異構(gòu)體，常溫（25℃）下為白色晶體，密度為1.60g/m³，該物質(zhì)比較穩(wěn)定，熔點(diǎn)在296-298℃范圍內(nèi)，難溶于水和一般的溶劑。馬來酰肼可降低植物的光合作用，阻礙植物體內(nèi)細(xì)胞分裂，從而抑制腋芽生長，如大蒜，馬鈴薯和煙葉腋芽的生長。有研究報(bào)道馬來酰肼是一種誘變致癌劑，生物體內(nèi)累積達(dá)到一定量后會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的毒性作用。故而，MH農(nóng)藥殘留量成為煙葉生產(chǎn)必需監(jiān)控項(xiàng)目之一。從煙葉中有效提取馬來酰肼農(nóng)藥殘留量成為檢測技術(shù)的重要內(nèi)容。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種微量馬來酰肼分離方法。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，包括前處理、萃取分離步驟，具體包括：

A、前處理：將原料經(jīng)干燥、粉碎過篩備用；

B、萃?。簩⑶疤幚砗蟮脑现萌胼腿」拗胁捎贸R界CO₂流體萃取得到萃取液；

C、分離：將萃取液蒸發(fā)濃縮得到萃取濃縮液，然后將萃取濃縮液中加入原料質(zhì)量體積比1：1～5的甲醇，搖勻后過有機(jī)過濾膜得到萃取凈化液；

D、檢測：萃取凈化液用高效液相色譜進(jìn)行檢測馬來酰肼含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限：

準(zhǔn)確稱取100mg馬來酰肼，精確至0.1mg，溶于100mL甲醇中，得到1mg/mL的馬來酰肼母液，取10mL母液用甲醇定容到100mL容量瓶中。得到100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在蒸餾瓶中加入0.1、0.5、1、2、4、8和10mL的100μg/mL馬來酰肼標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后按測定煙草樣品的步驟進(jìn)行處理，制備7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用HPLC測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積（見圖1），并以峰面積(y)對(duì)其相應(yīng)的濃度(x)作圖得到工作曲線（見圖2），通過回歸分析得到回歸方程：Y = 8.7513X-1.615，相關(guān)系數(shù)為0.99992。該方法的檢出限為2.7μg/g。

本發(fā)明采用超臨界二氧化碳流體和特定助劑作為萃取劑提取煙葉中微量馬來酰肼，所得萃取液通過濃縮和凈化處理用于高效液相色譜分析檢測。本發(fā)明操作過程簡單，提取率高，有機(jī)試劑用量少，其前處理快捷，回收率高，穩(wěn)定性好，且不會(huì)破壞測定樣品，可作為煙草及煙草制品中微量馬來酰肼的專門測定方法。

附圖說明

圖1為馬來酰肼標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖；

圖2為馬來酰肼標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖；

圖3為實(shí)施例1萃取分離產(chǎn)物之HPLC色譜圖；

圖4為實(shí)施例2萃取分離產(chǎn)物之HPLC色譜圖；

圖5為實(shí)施例3萃取分離產(chǎn)物之HPLC色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明所述的微量馬來酰肼分離方法，包括前處理、萃取分離步驟，具體包括：

A、前處理：將原料經(jīng)干燥、粉碎過篩備用；

B、萃?。簩⑶疤幚砗蟮脑现萌胼腿」拗胁捎贸R界CO₂流體萃取得到萃取液；

C、分離：將萃取液蒸發(fā)濃縮得到萃取濃縮液，然后將萃取濃縮液中加入原料質(zhì)量體積比1：1～5的甲醇，搖勻后過有機(jī)過濾膜得到萃取凈化液；

D、檢測：萃取凈化液用高效液相色譜進(jìn)行檢測馬來酰肼含量。

所述的原料為煙草或煙草制品。

A步驟中所述的干燥是將原料于35～45℃下干燥4～6h至含水率為2～8%。

A步驟中所述的粉碎過篩是粉碎過40～100目篩。

B步驟中所述的超臨界CO₂流體萃取的條件為：溫度20～80℃；壓力10～35MPa；特定助劑為甲醇、異丙醇和乙腈組合的二元或三元混合物，其配比范圍為甲醇：異丙醇：乙腈=a：b：c，其中a為0、1或2，b為0或1，c為0或1；CO₂的流量為10～25g/min，特定助劑的用量為CO₂流量的2～5%；萃取方式為動(dòng)態(tài)萃取；萃取時(shí)間為50～100min。

C步驟中所述的蒸發(fā)濃縮是在真空度70～90KPa，溫度20～45℃下采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮5～15min得到萃取濃縮液。

C步驟中所述的有機(jī)過濾膜的為0.22～0.45μm的有機(jī)過濾膜。

D步驟中所述的高效液相色譜檢測條件為：色譜柱:SBC18（4.6mm×250mm,5um）；流動(dòng)相：0.1moL/L乙酸銨溶液（pH=4.8）；檢測波長303nm；柱溫30℃；流動(dòng)相流速0.7mL/min；進(jìn)樣量5μL，等度洗脫。

本發(fā)明所述的微量馬來酰肼分離方法的具體實(shí)施如下：

萃取分離操作：

⑴將粉碎好的煙葉在40℃下烘5小時(shí)，過篩，準(zhǔn)確稱取干燥煙末5~10g備用。

⑵將稱量好的煙末放入萃取罐，設(shè)定操作參數(shù)，萃取溫度、萃取壓力、CO₂流量，特定助劑。

⑶參數(shù)設(shè)定完畢后，打開CO₂閥門，開啟CO₂泵，萃取系統(tǒng)開始工作。

⑷當(dāng)萃取罐內(nèi)狀態(tài)達(dá)到設(shè)定值，同時(shí)有尾氣放出時(shí)開始計(jì)時(shí)。

⑸到達(dá)萃取時(shí)間，結(jié)束萃取實(shí)驗(yàn)，停止系統(tǒng)的運(yùn)行，關(guān)閉CO₂泵，關(guān)閉CO₂閥門。

⑹萃取實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，逐漸降低萃取系統(tǒng)壓力至大氣壓，待萃取罐溫度降至30℃，打開收集罐底的排空閥，收集萃取液并計(jì)量。

⑺實(shí)驗(yàn)結(jié)束后清潔超臨界CO₂設(shè)備，歸位。

工藝參數(shù)：

超臨界二氧化碳流體狀態(tài)范圍為：溫度20~80℃，壓力10~35MPa；

特定助劑為：甲醇、異丙醇和乙腈組合的二元或三元混合物，其配比范圍是甲醇:異丙醇:乙腈=A:B:C，（A=0，1，2；B=0，1；C=0，1）；

萃取操作條件：

萃取溫度：20~80℃

萃取壓力：10~35MPa

萃取時(shí)間：50~100min

萃取方式：動(dòng)態(tài)萃取

CO₂流量：10~25g/min

特定助劑用量：取CO₂流量的2~5%

煙草樣本：在不含MH的煙葉粉末中均勻加入20μg/g MH標(biāo)準(zhǔn)樣品，并封存一定時(shí)間讓MH充分滲透于煙葉細(xì)粒中，備用。

煙葉粉末粒度：40~100目

萃取液濃度測定：

萃取液濃縮條件：在真空度70~ 90kPa，溫度為20~45℃下，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮5~15min，得到萃取濃縮液；

凈化處理：將上述萃取濃縮液用甲醇定容至10~50mL，過0.22或0.45μm有機(jī)過濾膜，得到萃取凈化液。

分離結(jié)果測定：

高效液相色譜檢測條件為：色譜柱:SBC18（4.6mm×250mm,5um）；流動(dòng)相：0.1moL/L乙酸銨溶液（pH=4.8）；檢測波長303nm；柱溫30℃；流動(dòng)相流速0.7mL/min；進(jìn)樣量5μL，等度洗脫。

標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限：

準(zhǔn)確稱取100mg馬來酰肼，精確至0.1mg，溶于100mL甲醇中，得到1mg/mL的馬來酰肼母液，取10mL母液用甲醇定容到100mL容量瓶中。得到100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在蒸餾瓶中加入0.1、0.5、1、2、4、8和10mL的100μg/mL馬來酰肼標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后按測定煙草樣品的步驟進(jìn)行處理，制備7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用HPLC測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積（見圖1），并以峰面積(y)對(duì)其相應(yīng)的濃度(x)作圖得到工作曲線（見圖2），通過回歸分析得到回歸方程：Y = 8.7513X-1.615，相關(guān)系數(shù)為0.99992。該方法的檢出限為2.7μg/g。

下面以具體實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：

實(shí)施例1

準(zhǔn)確稱取10g粒徑60目煙末放于萃取罐中，設(shè)置超臨界CO₂流體萃取條件：萃取壓力20MPa，萃取溫度55℃，CO₂流量20g/min，特定助劑為甲醇:異丙醇=1:1（V:V），其用量為CO₂流量的4%。打開CO₂閥門，開啟CO₂泵，啟動(dòng)萃取分離系統(tǒng)，在設(shè)定條件下動(dòng)態(tài)萃取60min，結(jié)束萃取實(shí)驗(yàn)，停止系統(tǒng)的運(yùn)行，關(guān)閉CO₂泵。萃取實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，逐漸降低系統(tǒng)壓力至大氣壓，待萃取罐溫度降至30℃，打開收集罐底的排空閥收集萃取液并稱重。將所得萃取液置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在0.08MPa和溫度為40℃下濃縮10min，得到萃取濃縮液；將上述萃取濃縮液用甲醇定容至10mL，過0.45μm有機(jī)過濾膜，得到萃取凈化液。用高效液相色譜檢測萃取凈化液中馬來酰肼含量，檢測條件為：色譜柱:SBC18（4.6mm×250mm,5um）；流動(dòng)相：0.1moL/L乙酸銨溶液（pH=4.8）；檢測波長303nm；柱溫30℃；流動(dòng)相流速0.7mL/min；進(jìn)樣量5μL，等度洗脫。由檢測結(jié)果得MH的回收率為95.08%，RSD為4.87%。

實(shí)施例2

準(zhǔn)確稱取10g粒徑80目煙末放于萃取罐中，設(shè)置超臨界CO₂流體萃取條件：萃取壓力25MPa，萃取溫度50℃，CO₂流量25g/min，特定助劑為甲醇:異丙醇:乙腈=1:1:1（V:V:V），其用量為CO₂流量的3%。打開CO₂閥門，開啟CO₂泵，啟動(dòng)萃取分離系統(tǒng)，在設(shè)定條件下動(dòng)態(tài)萃取80min，結(jié)束萃取實(shí)驗(yàn)，停止系統(tǒng)的運(yùn)行，關(guān)閉CO₂泵。萃取實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，逐漸降低系統(tǒng)壓力至大氣壓，待萃取罐溫度降至30℃，打開收集罐底的排空閥收集萃取液并稱重。將所得萃取液置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在0.09MPa和溫度為30℃下濃縮5min，得到萃取濃縮液；將上述萃取濃縮液用甲醇定容至10mL，過0.45μm有機(jī)過濾膜，得到萃取凈化液。用高效液相色譜檢測萃取凈化液中馬來酰肼含量，檢測條件為：色譜柱:SBC18（4.6mm×250mm,5um）；流動(dòng)相：0.1moL/L乙酸銨溶液（pH=4.8）；檢測波長303nm；柱溫30℃；流動(dòng)相流速0.7mL/min；進(jìn)樣量5μL，等度洗脫。由檢測結(jié)果得MH的回收率為99.16%，RSD為2.37%。

實(shí)施例3

準(zhǔn)確稱取5g粒徑80目煙末放于萃取罐中，設(shè)置超臨界CO₂流體萃取條件：萃取壓力20MPa，萃取溫度50℃，CO₂流量15g/min，特定助劑為甲醇:異丙醇=1:1（V:V），其用量為CO₂流量的4%。打開CO₂閥門，開啟CO₂泵，啟動(dòng)萃取分離系統(tǒng)，在設(shè)定條件下動(dòng)態(tài)萃取60min，結(jié)束萃取實(shí)驗(yàn)，停止系統(tǒng)的運(yùn)行，關(guān)閉CO₂泵。萃取實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，逐漸降低系統(tǒng)壓力至大氣壓，待萃取罐溫度降至30℃，打開收集罐底的排空閥收集萃取液并稱重。將所得萃取液置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在0.08MPa和溫度為40℃下濃縮8min，得到萃取濃縮液；將上述萃取濃縮液用甲醇定容至10mL，過0.45μm有機(jī)過濾膜，得到萃取凈化液。用高效液相色譜檢測萃取凈化液中馬來酰肼含量，檢測條件為：色譜柱:SBC18（4.6mm×250mm,5um）；流動(dòng)相：0.1moL/L乙酸銨溶液（pH=4.8）；檢測波長303nm；柱溫30℃；流動(dòng)相流速0.7mL/min；進(jìn)樣量5μL，等度洗脫。由檢測結(jié)果得MH的回收率為98.08%，RSD為2.45%。