本發(fā)明涉及動(dòng)物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體提供了一種隱性乳房炎試劑盒。
背景技術(shù)：
乳房炎、蹄葉炎、子宮內(nèi)膜炎被稱為奶牛養(yǎng)殖業(yè)中的“三炎”，是奶牛養(yǎng)殖過程中最主要的三種疾病，一直困擾著我國乃至世界各地的奶牛養(yǎng)殖，制約奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其中乳房炎以其高發(fā)病率、低治愈率和復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制而成為奶牛養(yǎng)殖中最為重要的疾病。傳統(tǒng)的乳房炎檢測方法主要是利用乳汁病原微生物檢查、體細(xì)胞計(jì)數(shù)法等方法進(jìn)行診斷，檢測方法相對繁瑣，結(jié)果判定主觀性較強(qiáng)，準(zhǔn)確度較低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的發(fā)明人針對現(xiàn)有檢測技術(shù)存在的諸多不足之處，提供了一種隱性乳房炎試劑盒，通過檢測與奶牛乳房炎相關(guān)的炎癥因子IL-1β、IL-2、PGE2的變化來建立診斷奶牛隱性乳房炎的新方法，該方法通過定量檢測牛奶中乳房炎相關(guān)炎癥因子，與臨界值進(jìn)行比較，從而達(dá)到早發(fā)現(xiàn)早治療，以減少乳房炎帶來的經(jīng)濟(jì)損失的目的，適合工業(yè)化生產(chǎn)，保存期長。
本發(fā)明的具體技術(shù)方案是：
一種隱性乳房炎試劑盒，試劑盒中包含有：預(yù)包被與隱性乳房炎相關(guān)單克隆抗體的酶標(biāo)板，其中所述的與隱性乳房炎相關(guān)單克隆抗體為IL-1β或IL-2或PGE2。
除此之外，本發(fā)明所述試劑盒中還含有樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，酶標(biāo)試劑，濃縮洗滌液，顯色劑A液和顯色劑B液以及終止液。
其中所述的預(yù)包被時(shí)采用的包被緩沖液為0.05M pH9.6的碳酸鹽緩沖液其1L溶液中含1.59gNa2CO3，2.93g NaHCO3；
樣品稀釋液和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為含有0.5wt％BSA的pH為7.4的0.01mol/L PBS緩沖液；
酶標(biāo)試劑分別為辣根過氧化物酶標(biāo)記的IL-1β或IL-2或PGE2抗體，如北京博奧森生物技術(shù)有限公司等。
濃縮洗滌液為含有體積濃度為0.5‰的吐溫－20的0.02mol/L的pH 7.4的磷酸鹽緩沖液；
原倍標(biāo)準(zhǔn)品分別為96ng/L的IL-1β、640ng/L的IL-2和1200ng/L的PGE2；
顯色劑A液為雙氧水；
顯色劑B液為底物TMB；
終止液為4mol/L的硫酸。
本發(fā)明所述試劑盒的原理為：
白細(xì)胞介素1β(Interleukin 1β，IL-1β)由單核/巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞分泌，主要與巨噬細(xì)胞有關(guān)，能夠增強(qiáng)和維持中性粒細(xì)胞的抗微生物能力，誘導(dǎo)Th1、Th2、Th17等CD4+細(xì)胞及γδT細(xì)胞活化。乳房炎癥反應(yīng)過程表現(xiàn)為發(fā)炎組織內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤、細(xì)胞因子釋放、微循環(huán)損傷，而細(xì)胞因子在損傷中發(fā)揮重要的作用，其中以抗損傷因子IL-1β尤為重要，乳房炎后被激活的血液成分如凝血酶等使其增加；
白細(xì)胞介素2(Interleukin2，IL-2)主要是由奶牛胸腺T淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生，最重要的作用是誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖和分化，又稱為T細(xì)胞生長因子，內(nèi)源性IL-2的減少可引起免疫功能下降，繼而引發(fā)疾病，高劑量的IL-2能引起單核巨噬細(xì)胞增殖和分化，并增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。同時(shí)，IL-2能夠提高中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞等細(xì)胞的吞噬力，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。妊娠最后6周和初乳中IL-2的活性較低，增加了分娩前后乳房炎的發(fā)病率；
前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)主要與中性白細(xì)胞有關(guān)，是炎癥局部組織在炎癥因子的刺激下產(chǎn)生的一種花生四烯酸代謝產(chǎn)物。能夠擴(kuò)張微血管，增強(qiáng)血管通透性；能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞向炎癥局部聚集；并且對機(jī)體有致熱作用。當(dāng)PGE2在一定范圍內(nèi)升高時(shí)能夠適當(dāng)加速炎癥反應(yīng)，快速消滅致炎因子，減少對炎癥局部組織損傷。但當(dāng)其濃度超過一定范圍時(shí)，將加劇炎癥反應(yīng)，對局部組織造成更大的損傷；
因此發(fā)明人發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-2和PGE2三種指標(biāo)在奶?；既榉垦缀缶霈F(xiàn)明顯波動(dòng)，并且三種指標(biāo)在患隱性乳房炎奶牛的牛奶中均比臨床型乳房炎奶牛、健康奶牛的牛奶中要高，由此發(fā)明人決定通過試劑盒的方式檢測牛奶中上述三者的含量指標(biāo)來判定奶牛早期是否患有隱性乳房炎，并分別用三種純化的抗體包被酶標(biāo)板，制成固相抗體，之后往包被單抗的酶標(biāo)板中依次加入待檢奶樣、三種對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在辣根過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在2mol/L的H2SO4終止液的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-1β、IL-2、PGE2含量呈正相關(guān)。在終止反應(yīng)后15min內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中IL-1β、IL-2、PGE2濃度。發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-2和PGE2的臨界值分別為59ng/L、210ng/L和360ng/L，即當(dāng)試劑盒所測樣品三種指標(biāo)中的任意兩種高于臨界值則判定為隱性乳房炎。
其中所述預(yù)包被與隱性乳房炎相關(guān)單克隆抗體IL-1β、IL-2和PGE2的酶標(biāo)板，制備方法如下：
用0.05M pH9.6的碳酸鹽包被緩沖液將純化的IL-2抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為2μg/ml，在8×12孔聚苯乙烯酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中按照每孔0.1ml加入稀釋后的抗體，4℃過夜孵育，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌液(洗滌液為pH為7.4的0.02mol/L PBS+0.05％吐溫-20)洗滌三次；用0.5％的牛血清白蛋白(BSA)37℃封閉1小時(shí)，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌液洗3次，將包被好的酶標(biāo)板干燥后放入密封袋或錫袋中備用；
所述IL-1β和PGE2的酶標(biāo)板制備方法與IL-2酶標(biāo)版相同，發(fā)明人在此不再贅述；
所采用的純化的IL-1β、IL-2和PGE2抗體均采用現(xiàn)有技術(shù)獲得或者市售可得；
而本發(fā)明所述檢測試劑盒的使用方法，以IL-2為例步驟如下：
1、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：將已知濃度的原倍標(biāo)準(zhǔn)品(640ng/L的IL-2)用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(pH為7.4的0.01mol/L PBS+0.5％BSA)在無菌的1.5ml離心管中進(jìn)行倍比稀釋，稀釋5個(gè)濃度梯度；
2、樣品處理：將采集的牛奶樣品放置于5ml離心管中，以8000rpm/min的轉(zhuǎn)速，離心10分鐘，除去脂肪和雜蛋白，收集上清用于檢測；
3、加樣：將包被并封閉好的酶標(biāo)板分別設(shè)置2個(gè)空白對照孔(空白對照孔不加樣品和酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)和5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，其余孔為待測樣品孔；分別向5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入稀釋好的5個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品各50μl；待測樣品孔中先加樣品稀釋液(pH為7.4的0.01mol/L PBS+0.5％BSA)40μl，然后再加入步驟2中離心過后的牛奶上清10μl；加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘；
4、洗滌：棄去酶標(biāo)板中的液體，甩干，每孔加滿洗滌液(洗滌液為pH為7.4的0.02mol/L PBS+0.05％吐溫-20)，靜置30秒后棄去，重復(fù)5次，拍干，此步驟的目的是為了洗去板孔中沒有與包被的IL-2固相抗體結(jié)合的物質(zhì)；
5、加酶標(biāo)抗體：每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗牛IL-2抗體50μl，空白孔除外，用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘，此步驟中酶標(biāo)抗體與結(jié)合在固相抗體上的IL-2結(jié)合；
6、洗滌：操作同步驟4，此步驟是為了洗去板孔中未結(jié)合的酶標(biāo)抗體；
7、顯色：每孔先加入顯色劑A(H2O2)50μl，再加入顯色劑B(底物TMB)50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘，此步驟中顯色劑A與顯色劑B與辣根過氧化物酶反應(yīng)顯藍(lán)色；
8、終止：每孔加終止液(4mol/L的硫酸)50μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立即變?yōu)辄S色)；
9、測定：以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測量各孔的吸光度(OD值)。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
計(jì)算與結(jié)果判定：以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
所述IL-1β和PGE2的檢測方法與IL-2完全相同，發(fā)明人在此不再贅述；
當(dāng)所測樣品三種指標(biāo)中的任意兩種高于臨界值(IL-1β、IL-2和PGE2的臨界值分別為59ng/L、210ng/L和360ng/L)則判定為隱性乳房炎。
綜上所述，本發(fā)明提供了一種隱性乳房炎試劑盒，通過檢測與奶牛乳房炎相關(guān)的炎癥因子IL-1β、IL-2、PGE2的變化來建立診斷奶牛隱性乳房炎的新方法，該方法通過定量檢測牛奶中乳房炎相關(guān)炎癥因子，與臨界值進(jìn)行比較，從而達(dá)到早發(fā)現(xiàn)早治療，以減少乳房炎帶來的經(jīng)濟(jì)損失的目的，適合工業(yè)化生產(chǎn)，保存期長。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中除特殊注明外，其他均采用現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)
實(shí)施例1
一種隱性乳房炎試劑盒，試劑盒中包含有：預(yù)包被與隱性乳房炎相關(guān)單克隆抗體的酶標(biāo)板，其中所述的與隱性乳房炎相關(guān)單克隆抗體為IL-1β。
除此之外，本發(fā)明所述試劑盒中還含有樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，酶標(biāo)試劑，濃縮洗滌液，顯色劑A液和顯色劑B液以及終止液。
其中所述的預(yù)包被時(shí)采用的包被緩沖液為0.05M pH9.6的碳酸鹽緩沖液其1L溶液中含1.59gNa2CO3，2.93g NaHCO3，；
樣品稀釋液和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為含有0.5wt％BSA的pH為7.4的0.01mol/L PBS緩沖液；
酶標(biāo)試劑分別為辣根過氧化物酶標(biāo)記的IL-1β抗體；
濃縮洗滌液為含有體積濃度為0.5‰的吐溫－20的0.02mol/L及pH 7.4的磷酸鹽緩沖液；
原倍標(biāo)準(zhǔn)品分別為96ng/L的IL-1β；
顯色劑A液為雙氧水；
顯色劑B液為底物TMB；
終止液為4mol/L的硫酸。
實(shí)施例2
一種隱性乳房炎試劑盒，試劑盒中包含有：預(yù)包被與隱性乳房炎相關(guān)單克隆抗體的酶標(biāo)板，其中所述的與隱性乳房炎相關(guān)單克隆抗體為IL-2抗體。
除此之外，本發(fā)明所述試劑盒中還含有樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，酶標(biāo)試劑，濃縮洗滌液，顯色劑A液和顯色劑B液以及終止液。
其中所述的預(yù)包被時(shí)采用的包被緩沖液為0.05M pH9.6的碳酸鹽緩沖液其1L溶液中含1.59gNa2CO3，2.93g NaHCO3；
樣品稀釋液和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為含有0.5wt％BSA的pH為7.4的0.01mol/L PBS緩沖液；
酶標(biāo)試劑分別為辣根過氧化物酶標(biāo)記的IL-2抗體；
濃縮洗滌液為含有體積濃度為0.5‰的吐溫－20的0.02mol/L及pH 7.4的磷酸鹽緩沖液；
原倍標(biāo)準(zhǔn)品為640ng/L的IL-2；
顯色劑A液為雙氧水；
顯色劑B液為底物TMB；
終止液為4mol/L的硫酸。
實(shí)施例3
一種隱性乳房炎試劑盒，試劑盒中包含有：預(yù)包被與隱性乳房炎相關(guān)單克隆抗體的酶標(biāo)板，其中所述的與隱性乳房炎相關(guān)單克隆抗體為PGE2抗體。
除此之外，本發(fā)明所述試劑盒中還含有樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，酶標(biāo)試劑，濃縮洗滌液，顯色劑A液和顯色劑B液以及終止液。
其中所述的預(yù)包被時(shí)采用的包被緩沖液為0.05M pH9.6的碳酸鹽緩沖液其1L溶液中含1.59gNa2CO3，2.93g NaHCO3；
樣品稀釋液和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為含有0.5wt％BSA的pH為7.4的0.01mol/L PBS緩沖液；
酶標(biāo)試劑分別為辣根過氧化物酶標(biāo)記的PGE2抗體；
濃縮洗滌液為含有體積濃度為0.5‰的吐溫－20的0.02mol/L及pH 7.4的磷酸鹽緩沖液；
原倍標(biāo)準(zhǔn)品為1200ng/L的PGE2；
顯色劑A液為雙氧水；
顯色劑B液為底物TMB；
終止液為4mol/L的硫酸。
實(shí)施例4
預(yù)包被與隱性乳房炎相關(guān)單克隆抗體IL-1β、IL-2和PGE2的酶標(biāo)板，以IL-2為例，制備方法如下：
用0.05M pH9.6的碳酸鹽包被緩沖液將純化的IL-2抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為2μg/ml，在8×12孔聚苯乙烯酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中按照每孔0.1ml加入稀釋后的抗體，4℃過夜孵育，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌液(洗滌液為pH為7.4的0.02mol/L PBS+0.05％吐溫-20)洗滌三次；用0.5％的牛血清白蛋白(BSA)37℃封閉1小時(shí)，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌液洗3次，將包被好的酶標(biāo)板干燥后放入密封袋或錫袋中備用；
所述IL-1β和PGE2的酶標(biāo)板制備方法與IL-2酶標(biāo)版相同，發(fā)明人在此不再贅述。
實(shí)施例5
一種隱性乳房炎試劑盒的使用方法，以IL-2為例步驟如下：
1、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：將已知濃度的原倍標(biāo)準(zhǔn)品(640ng/L的IL-2)用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(pH為7.4的0.01mol/L PBS+0.5％BSA)在無菌的1.5ml離心管中進(jìn)行倍比稀釋，稀釋5個(gè)濃度梯度；
2、樣品處理：將采集的牛奶樣品放置于5ml離心管中，以8000rpm/min的轉(zhuǎn)速，離心10分鐘，除去脂肪和雜蛋白，收集上清用于檢測；
3、加樣：將包被并封閉好的酶標(biāo)板分別設(shè)置2個(gè)空白對照孔(空白對照孔不加樣品和酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)和5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，其余孔為待測樣品孔；分別向5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入稀釋好的5個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品各50μl；待測樣品孔中先加樣品稀釋液(pH為7.4的0.01mol/L PBS+0.5％BSA)40μl，然后再加入步驟2中離心過后的牛奶上清10μl；加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘；
4、洗滌：棄去酶標(biāo)板中的液體，甩干，每孔加滿洗滌液(洗滌液為pH為7.4的0.02mol/L PBS+0.05％吐溫-20)，靜置30秒后棄去，重復(fù)5次，拍干，此步驟的目的是為了洗去板孔中沒有與包被的IL-2固相抗體結(jié)合的物質(zhì)；
5、加酶標(biāo)抗體：每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗牛IL-2抗體(市購)50μl，空白孔除外，用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘，此步驟中酶標(biāo)抗體與結(jié)合在固相抗體上的IL-2結(jié)合；
6、洗滌：操作同步驟4，此步驟是為了洗去板孔中未結(jié)合的酶標(biāo)抗體；
7、顯色：每孔先加入顯色劑A(H2O2)50μl，再加入顯色劑B(底物TMB)50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘，此步驟中顯色劑A與顯色劑B與辣根過氧化物酶反應(yīng)顯藍(lán)色；
8、終止：每孔加終止液(4mol/L的硫酸)50μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立即變?yōu)辄S色)；
9、測定：以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測量各孔的吸光度(OD值)。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
計(jì)算與結(jié)果判定：以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
所述IL-1β和PGE2的檢測方法與IL-2完全相同，發(fā)明人在此不再贅述；
當(dāng)所測樣品三種指標(biāo)中的任意兩種高于臨界值(IL-1β、IL-2和PGE2的臨界值分別為59ng/L、210ng/L和360ng/L)則判定為隱性乳房炎。
發(fā)明人進(jìn)一步利用現(xiàn)有技術(shù)于本發(fā)明進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯微鏡鏡檢牛奶中體細(xì)胞數(shù)的方法可以間接檢測奶牛是否患有隱性乳房炎，可與采用本發(fā)明檢測的結(jié)果相互應(yīng)征，但是雖然其檢測結(jié)果較準(zhǔn)確，但是制備樣品計(jì)數(shù)、鏡檢費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適合于大規(guī)模的樣品批量檢測；
而對于CMT法檢測而言，則存在結(jié)果判斷主觀性較強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確度不高的缺陷，與本發(fā)明的技術(shù)方案相比，本發(fā)明所提供的技術(shù)方案更加簡單可行，且準(zhǔn)確度極高，好于現(xiàn)有技術(shù)的相關(guān)技術(shù)方案。