一種金納米花偶聯(lián)辣根過氧化物酶和前列腺特異抗原標記抗體的制備方法與流程

文檔序號：11806502閱讀：439來源：國知局

本發(fā)明涉及納米材料制備技術(shù)領(lǐng)域，更具體的是涉及一種金納米花偶聯(lián)辣根過氧化物酶和前列腺特異抗原標記抗體的制備方法。

背景技術(shù)：

為了能快速、準確、早期發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤，醫(yī)務工作者經(jīng)過長期的科學研究，已發(fā)現(xiàn)有許多腫瘤標記物可為惡性腫瘤的診斷提供科學依據(jù)。腫瘤標記物是指腫瘤細胞產(chǎn)生和釋放的某種物質(zhì)，常以抗原、酶、激素等代謝產(chǎn)物的形式存在于腫瘤細胞內(nèi)或患者體液中。臨床上可通過生化或免疫檢測手段檢測這些特異性物質(zhì)而診斷相關(guān)的腫瘤。常用的腫瘤標記物有肝癌的甲胎蛋白(AFP)、大腸癌的癌胚抗原(CEA)、前列腺癌的前列腺特異抗原(PSA)等。腫瘤標志物陽性，可能是惡性腫瘤，也可能不是。要看具體是什么項目，檢測結(jié)果升高多少，有無其他影響因素等。有時需要兩周后復查，看是否繼續(xù)升高，如繼續(xù)升高，則還需要進一步進行CT、B超等方法檢查，并結(jié)合臨床情況，最后才能做出診斷。腫瘤標志物只是診斷腫瘤的輔助指標。目前，由于特異性100％的腫瘤標志物仍然沒有找到，所以還達不到我們希望的理想標準；有的良性腫瘤、囊腫、炎癥也會導致腫瘤標志物的升高。

腫瘤診斷中，雖然目前病理診斷才是腫瘤診斷的“金標準”，但是由于腫瘤標志物檢測簡便易行，對人體傷害也小，僅需要血液或者體液就可以檢測到早期癌癥的蹤跡，所以成為體檢中大量采用的手段。腫瘤標志物并非與腫瘤一一對應，一方面許多腫瘤患者指標全部正常，另一方面許多指標出現(xiàn)異常的咨詢者并未患腫瘤。所以對于指標正常的人不應忽視疾病的癥狀及時就診，對于后者則應放松心情定期復查。前列腺特異性抗原(Prostate Specific Antigen，PSA)：男性正常血清PSA為0-4納克/毫升，PSA對前腺癌的診斷特異性達90％～97％，目前PSA被認為是最有價值的前列癌的腫瘤標志物，大部分前列腺癌患者血清PSA濃度會明顯升高。前列腺癌手術(shù)后，PSA濃度可逐漸降至正常，若手術(shù)后PSA濃度不降或下降后再次升高，應考慮腫瘤轉(zhuǎn)移或復發(fā)的可能。

總之，大家要知道目前腫瘤標記物在臨床上主要用于腫瘤的篩查和腫瘤患者的復查、腫瘤發(fā)展程度及預后的判斷、腫瘤治療效果觀察和評價等。腫瘤標志物進行性升高的意義比較大，提倡腫瘤標志物聯(lián)合檢測，但不建議用于健康人體檢。腫瘤標志物只能作為輔助診斷腫瘤的指標之一，在沒有明確病理組織學診斷前，千萬不要因為見到某項指標輕度升高就認定患了癌癥，甚至進行抗腫瘤治療，這樣會造成不必要的傷害和損失，應當提高警惕，做進一步的檢查和觀察。所以本文擬研制一種金納米花偶聯(lián)辣根過氧化物酶和前列腺特異抗原標記抗體，用于檢測前列腺特異抗原腫瘤標志物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于蛋白標志物在腫瘤檢測中的重要地位、HRP檢測獨特的顯色性質(zhì)以及酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)的優(yōu)勢。我們將利用金納米花納米粒子和前列腺特異抗原標記抗體以及辣根過氧化物酶的靜電吸附作用，制備多酶標記的金納米花前列腺特異抗原免疫探針，對前列腺特異抗原(PSA)，這種廣泛存在前列腺疾病的蛋白標志物進行定性定量的檢測，建立蛋白標志物檢測的新方法，極大程度提高了檢測靈敏度。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種金納米粒子偶聯(lián)辣根過氧化物酶和甲胎蛋白標記抗體的制備方法；其步驟如下：

(1)將氯金酸(HAuCl₄)加入到反應器，加熱煮沸后注入檸檬酸鈉，冷卻至室溫，得到金種溶液(Gold seeds)；

(2)通過氫氧化鈉調(diào)節(jié)氯金酸pH4.2～11.0，加入羥胺鹽酸(NH₂OH.HCl)和上述金種溶液，其中摩爾質(zhì)量配比HAuCl₄:NH₂OH.HCl：Gold seeds＝14:10～20:1，最后得到金納米花納米粒子(AuNFs)；

(3)將金納米花納米粒子(AuNFs)超聲處理加入反應器，加入前列腺特異抗原PSA標記抗體(Ab₁)和辣根過氧化物酶(HRP)混合液，所得AuNFs、HRP和Ab₁混合液在旋轉(zhuǎn)混合架上旋轉(zhuǎn)過夜，最后離心得到multi-HRP-AuNFs-Ab₁檢測探針。

所述步驟1)氯金酸是四水合氯金酸，氯金酸和檸檬酸鈉的摩爾質(zhì)量配比為1:5～10。

所述步驟2)是通過氫氧化鈉調(diào)節(jié)氯金酸pH4.2～11.0；摩爾質(zhì)量配比HAuCl₄:NH₂OH.HCl：Gold seeds＝14:10～20：1。

所述步驟3)前列腺特異抗原標記抗體(Ab₁)：辣根過氧化物酶(HRP)質(zhì)量配比為1:1～9；金納米粒子AuNFs：(HRP和Ab₁)混合液質(zhì)量配比為100～500:1

所述步驟3)AuNFs-HRP-Ab₁檢測探針為多酶標記探針，可有效提高檢測靈敏度。

如圖4所示，一個金納米花納米粒子分子上面可以同時偶聯(lián)多個HRP分子和前列腺特異抗原標記抗體分子，有效提高了酶分子和抗體分子的偶聯(lián)效率；如圖1(a)所示本發(fā)明制備的金納米花納米粒子種子為20nm的金納米球，(b-d)pH＝4.2、7.0和11.0時所得納米粒子形貌均為花狀；如圖2金納米花納米粒子紫外吸收光譜所示，pH在4.2～11之間所得金納米花納米粒子吸收波長在500～620nm之間，可有效偶聯(lián)蛋白分子。如圖3所示金納米花納米粒子偶聯(lián)辣根過氧化物酶和前列腺特異抗原標記抗體后粒徑由35nm增加到110nm左右，表明辣根過氧化物酶和前列腺特異抗原標記抗體已經(jīng)成功標記到金納米花納米粒子上。如圖5所示，multi-HRP-AuNFs-Ab₁檢測探針ELISA測試明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的ELISA，說明multi-HRP-AuNFs-Ab₁檢測探針具有較高的檢測靈敏度。

本發(fā)明制備的金納米花偶聯(lián)辣根過氧化物酶和前列腺特異抗原標記抗體優(yōu)勢在于：

1.通過調(diào)整體系的pH值，即可制備不同形貌、不同性能的金納米花納米粒子，從而為后續(xù)的免疫實驗提供良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.金納米花納米粒子AuNFs與前列腺特異抗原標記抗體Ab₁和辣根過氧化物酶(HRP)的靜電吸附相互作用得到檢測探針，檢測探針將同時具有免疫活性和酶催化活性。

3.金納米花納米粒子因其豐富的比表面積，性能明顯優(yōu)于球狀金納米粒子，所得檢測探針為多酶標記探針，實現(xiàn)了納米領(lǐng)域的納米增強效應，可有效提高檢測靈敏度。

附圖說明

圖1本發(fā)明制備的金納米花納米粒子AuNFs透射電鏡照片(a)20nm金球納米粒子；(b-d)pH 4.2、pH7.0、pH11.0所得金納米花納米粒子。

圖2本發(fā)明制備的金納米花納米粒子AuNFs紫外吸收曲線，從左至右依次為pH4.2、pH4.6、pH5.6、pH7.0、pH10.8和pH11.0。

圖3本發(fā)明制備的金納米花納米粒子AuNFs粒度數(shù)據(jù)。

圖4本發(fā)明制備的金納米花納米粒子AuNFs偶聯(lián)辣根過氧化物酶和前列腺特異抗原標記抗體示意圖。

圖5本發(fā)明制備的multi-HRP-AuNFs-Ab₁檢測探針免疫實驗Enhanced ELISA與傳統(tǒng)檢測探針免疫實驗Traditional ELISA擬合曲線。

具體實施方式

下面的實施案例中將對本發(fā)明作進一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。

實施案例1：