本發(fā)明屬于環(huán)境檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種污水中和環(huán)境水體中甲基安非他命的檢測技術(shù)。

背景技術(shù)：

根據(jù)2015年世界毒品報(bào)告和其他相關(guān)文獻(xiàn)，非法藥品在全世界正在令人擔(dān)憂的大規(guī)模的生產(chǎn)和濫用。在這些眾多的非法藥品中，在全球范圍內(nèi)，甲基安非他命(也叫甲基苯丙胺、冰毒)是僅次于大麻的最廣泛的濫用毒品。由于其日益增長的濫用，給人類的健康帶來了巨大的威脅，因?yàn)榫哂猩窠?jīng)毒性的甲基安非他命對(duì)人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有不可恢復(fù)的損傷作用。如果能夠簡單、快速且價(jià)格低廉的對(duì)甲基安非他命進(jìn)行檢測，也許能在某種程度上有效的阻止其濫用，但是目前并沒有這樣一個(gè)有效的檢測方法。

在現(xiàn)有技術(shù)中，存在一些針對(duì)頭發(fā)、血液、尿樣以及廢水等樣品中的甲基安非他命檢測的方法，包括氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)連用、動(dòng)態(tài)離子色譜、成像質(zhì)譜、表面增強(qiáng)拉曼和微流控裝置等等。雖然這些技術(shù)具有很高的靈敏度和好的選擇性，但是他們要求復(fù)雜的樣品準(zhǔn)備和前處理技術(shù)、昂貴的設(shè)備儀器、以及專業(yè)技術(shù)人員。而在實(shí)際應(yīng)用中，有時(shí)為了判斷嫌疑人是否吸毒，需要快速的得到檢測結(jié)果甚至需要現(xiàn)場檢測以阻止毒品濫用，但是上面提到的這些方法都無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。因此，如何簡單、快速地進(jìn)行甲基安非他命的檢測及提供一個(gè)便攜式的檢測工具，能夠讓非專業(yè)人員在現(xiàn)場利用較少的樣品也能夠精確的、快速的檢測到體液和環(huán)境水體中低含量的甲基安非他命，比如對(duì)血液和尿樣的檢測用來判斷嫌疑人是否吸毒，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員急需解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本發(fā)明提出一種簡單、便捷的甲基安非他命(甲基苯丙胺)檢測方法，以及用于實(shí)現(xiàn)該檢測方法的生物傳感器。

一種甲基安非他命的檢測方法，包括如下步驟：

將DNA酶分子信標(biāo)和甲基安非他命適配體各自在第一設(shè)定溫度下解離一第一預(yù)定時(shí)間后冷卻到室溫；

將DNA酶分子信標(biāo)和甲基安非他命適配體混合在HEPES緩沖溶液里形成混合液，并在第二設(shè)定溫度下溫育一第二預(yù)定時(shí)間；

將待測對(duì)象加入到混合液中，再在第三設(shè)定溫度下溫育一第三預(yù)定時(shí)間；

將氯高鐵血紅素加入到混合液中；

將比色物質(zhì)加入到混合液中，在室溫下反應(yīng)后根據(jù)顯色確定待測對(duì)象中是否含有甲基安非他命。

一種用于甲基安非他命檢測的生物傳感器，包括以下部分

由DNA酶分子信標(biāo)和甲基安非他命適配體混合在HEPES緩沖溶液里形成的雙鏈DNA；

氯高鐵血紅素；

由ABTS和雙氧水混合形成的比色物質(zhì)。

進(jìn)一步的優(yōu)選方案，DNA酶分子信標(biāo)中堿基對(duì)數(shù)量為37，比色物質(zhì)為ABTS和雙氧水，ABTS作為比色基底，其能夠被雙氧水催化氧化成有顏色的ABTS⁺。雙鏈DNA由以下方式制成：將DNA酶分子信標(biāo)和甲基安非他命適配體各自在設(shè)定溫度下解離一預(yù)定時(shí)間后冷卻到室溫；將DNA酶分子信標(biāo)和甲基安非他命適配體各自在第一設(shè)定溫度下解離一第一預(yù)定時(shí)間后冷卻到室溫；將DNA酶分子信標(biāo)和甲基安非他命適配體混合在HEPES緩沖溶液里形成混合液，并在第二設(shè)定溫度下溫育一第二預(yù)定時(shí)間，以形成雙鏈DNA。第一設(shè)定溫度為90℃，第二、第三設(shè)定溫度為37℃；第一預(yù)定時(shí)間為5分鐘，第二預(yù)定時(shí)間為30分鐘，第三預(yù)定時(shí)間為90分鐘。

通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了簡單、快速、便捷的甲基安非他命的檢測，具有靈敏度高、不受其他物質(zhì)干擾的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

【附圖說明】

圖1甲基安非他命的檢測機(jī)理

圖2 DNA酶分子信標(biāo)中堿基對(duì)的優(yōu)化

圖3比色基底的選擇

圖4比色信號(hào)強(qiáng)度與甲基安非他命濃度的關(guān)系

圖5裸眼看到的比色信號(hào)強(qiáng)度與甲基安非他命濃度的關(guān)系

圖6干擾試驗(yàn)結(jié)果

【具體實(shí)施方式】

下面就本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步介紹。

生物傳感器是一個(gè)具有生物受體并且在目標(biāo)分析物出現(xiàn)還能產(chǎn)生特定信號(hào)(如電化學(xué)、光學(xué)、納米機(jī)理及質(zhì)量敏感信號(hào)等)的小型裝置，具有價(jià)格低廉、響應(yīng)快速和容易跟其他設(shè)備整合的優(yōu)點(diǎn)。生物傳感器作為一種有效的檢測工具，已經(jīng)在健康和環(huán)境監(jiān)測中有廣泛的應(yīng)用，能夠用于檢測重金屬離子、小分子、目標(biāo)DNA、多肽、酶、蛋白質(zhì)、生物標(biāo)記物、甚至細(xì)菌。生物傳感器在分析體液和環(huán)境中的樣品時(shí)，具有很大的潛力，與傳統(tǒng)的分析方法相比，生物傳感器的優(yōu)勢可以使其能夠?qū)崿F(xiàn)便攜式、小型化，以及可用于量少且成分復(fù)雜的樣品的分析。

在現(xiàn)有技術(shù)中，利用DNA酶作為一種催化信標(biāo)來設(shè)計(jì)的生物傳感器由于其具有高特異性而受到廣泛的關(guān)注。不僅如此，這類生物傳感器在環(huán)境和復(fù)雜樣品中還具有讓人滿意的靈敏度。DNA酶是一類具有催化活性能夠催化化學(xué)反應(yīng)的一段DNA分子，其具有高化學(xué)穩(wěn)定性、低成本、合成簡單和容易修飾等特點(diǎn)，DNA酶優(yōu)于蛋白質(zhì)酶。一個(gè)重要且日益受到關(guān)注的一種DNA酶叫G四聯(lián)體-氯高鐵血紅素復(fù)合物，其具有過氧化物酶活性，被成功的應(yīng)用到蛋白質(zhì)和DNA，小分子和金屬離子的分析檢測中。雖然許多研究者確認(rèn)了這種G四聯(lián)體-氯高鐵血紅素復(fù)合物具有催化活性，但是需要更多的注意力去關(guān)注和發(fā)展這種催化信標(biāo)。

實(shí)施例一檢測甲基安非他命的檢測方法

如圖1所示為甲基安非他命的檢測機(jī)理：具有過氧化物酶活性的DNA酶的活性部位主要由兩條分開的鏈構(gòu)成：5′-AGG GAC GGG-3′和5′-GTGGAGGGT-3′(圖1中較長鏈的兩頭淺色部分，即兩條鏈相交點(diǎn)之上和之下的部分)，除了這兩條鏈以外，DNA酶分子信標(biāo)還包括一段寡聚核苷酸(圖1中較長鏈中間的黑色部分，即兩條鏈相交點(diǎn)之間的部分)，它位于兩條催化活性鏈的之間。這段寡聚核苷酸通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則可部分的與甲基安非他命適配體互補(bǔ)形成雙鏈DNA。分析過程中，DNA酶分子信標(biāo)本身由于在氯高鐵血紅素存在下能夠形成G四聯(lián)體-氯高鐵血紅素結(jié)構(gòu)的DNA酶，這種酶具有過氧化物酶活性。但是當(dāng)DNA酶分子信標(biāo)與甲基安非他命適配體雜交形成雜交DNA雙鏈的后，這種DNA酶分子信標(biāo)不具有過氧化物酶的活性。甲基安非他命由于能跟甲基安非他命適配體特異性的結(jié)合從而可以導(dǎo)致DNA酶分子信標(biāo)從雜交后的DNA雙鏈上解離下來。也就是說，甲基安非他命在這個(gè)過程可以導(dǎo)致DNA酶分子信標(biāo)的催化活性恢復(fù)，恢復(fù)活性后的DNA酶分子信標(biāo)能夠催化氧化一個(gè)顯色的比色反應(yīng)，這個(gè)顯色反應(yīng)的強(qiáng)度可以反應(yīng)甲基安非他命的濃度。通過這個(gè)特殊的信號(hào)響應(yīng)，可以設(shè)計(jì)這種G四聯(lián)體-氯高鐵血紅素DNA酶分子信標(biāo)探針用于檢測甲基安非他命。

基于上述原理，本發(fā)明的甲基安非他命檢測的步驟如下：

步驟一，將DNA酶分子信標(biāo)和甲基安非他命適配體各自在第一設(shè)定溫度下解離一第一預(yù)定時(shí)間后冷卻到室溫；

其中DNA酶分子信標(biāo)可以采用上海生工，純化方式為色譜純的氯高鐵血紅素，而DNA酶分子信標(biāo)中堿基對(duì)數(shù)量為37。

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DNA酶分子信標(biāo)的長度，即堿基對(duì)數(shù)量不同對(duì)其催化活性有很大的影響。一方面是因?yàn)镚四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的形成受鏈長的影響；另一方面是因?yàn)镈NA酶分子信標(biāo)和甲基安非他命適配體形成的雙鏈的穩(wěn)定性是由堿基對(duì)決定的。配對(duì)的堿基對(duì)太多會(huì)使得甲基安非他命適配體從雙鏈DNA上解離困難，但是太少的堿基配對(duì)數(shù)不能阻止雙鏈DNA中DNA酶分子信標(biāo)形成有酶活性的G四聯(lián)體-氯高鐵血紅素復(fù)合物。如圖2所示，3條不同長度的DNA酶分子信標(biāo)應(yīng)用在實(shí)驗(yàn)中以選擇最佳長度，其中DNA酶分子信標(biāo)1-3的堿基對(duì)數(shù)量分別為57、47和37。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在沒有甲基安非他命適配體的情況下，3條DNA酶分子信標(biāo)都可以使415納米處紫外-可見吸收增強(qiáng)。但是加入DNA酶分子信標(biāo)2的體系信號(hào)最強(qiáng)。這說明，DNA酶分子信標(biāo)2的堿基數(shù)最有利于形成G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)。但是甲基安非他命適配體從雙鏈DNA上的解離也要考慮，在加入甲基安非他命適配體和甲基安非他命的情況下，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入DNA酶分子信標(biāo)3的溶液具有最大的紫外-可見吸收強(qiáng)度，這說明較少的堿基配對(duì)數(shù)更有利于甲基安非他命適配體從雙鏈DNA上解離然后形成甲基安非他命-適配體復(fù)合物。綜合考慮，DNA酶分子信標(biāo)3，即堿基對(duì)數(shù)量為37，作為最佳DNA酶分子信標(biāo)用于甲基安非他命的檢測。

步驟二，將DNA酶分子信標(biāo)和甲基安非他命適配體混合在HEPES緩沖溶液里形成混合液，并在第二設(shè)定溫度下溫育一第二預(yù)定時(shí)間；

DNA酶分子信標(biāo)本身由于在氯高鐵血紅素存在下能夠形成G四聯(lián)體-氯高鐵血紅素結(jié)構(gòu)的DNA酶，這種酶具有過氧化物酶活性。但是當(dāng)DNA酶分子信標(biāo)與甲基安非他命適配體雜交形成雜交DNA雙鏈的后，這種DNA酶分子信標(biāo)不具有過氧化物酶的活性。

步驟三，將待測對(duì)象加入到混合液中，再在第三設(shè)定溫度下溫育一第三預(yù)定時(shí)間；

將可能含有甲基安非他命的待測對(duì)象，如嫌疑人員的血液、尿樣等液體，加入到混合溶液中，甲基安非他命由于能跟甲基安非他命適配體特異性的結(jié)合從而可以導(dǎo)致DNA酶分子信標(biāo)從雜交后的DNA雙鏈上解離下來。也就是說，甲基安非他命在這個(gè)過程可以導(dǎo)致DNA酶分子信標(biāo)的催化活性恢復(fù)。

步驟四：將氯高鐵血紅素加入到混合液中；

步驟五，將比色物質(zhì)加入到混合液中，根據(jù)顯色確定待測對(duì)象中是否含有甲基安非他命。

設(shè)計(jì)G四聯(lián)體-氯高鐵血紅素DNA酶傳感器的另外重要一點(diǎn)是比色基底的選擇。常用的還原基底是一種叫做ABTS的化合物。這種物質(zhì)在過氧化物酶的存在下，能夠被雙氧水催化氧化成有顏色的ABTS^·+。這種物質(zhì)在波長415納米處具有顯著的紫外-可見吸收信號(hào)。因此，選擇ABTS作為比色基底。

如圖3所示為比色基底的選擇：在實(shí)驗(yàn)中，首先選擇不同濃度的雙氧水分別在有和沒有氯高鐵血紅素的情況下，查看其對(duì)ABTS的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入雙氧水的體系跟沒有加入雙氧水的體系，紫外吸收信號(hào)差別并不明顯；加入不同濃度的雙氧水之間的紫外吸收信號(hào)差別也不明顯。也就是說雙氧水并不能使ABTS發(fā)生顯色反應(yīng)。并且，加入氯高鐵血紅素后，溶液中ABTS的信號(hào)也沒有增強(qiáng)。這些結(jié)果說明單純的雙氧水和氯高鐵血紅素并不能使ABTS氧化而發(fā)生顯色反應(yīng)。但是，當(dāng)有DNA酶分子信標(biāo)存在的條件下，415納米處的信號(hào)強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(圖3中的MB)；當(dāng)加入一定濃度的甲基安非他命的適配體后，信號(hào)強(qiáng)度會(huì)急劇下降(圖3中的MB+Apt)；然后接著加入甲基安非他命后，信號(hào)強(qiáng)度恢復(fù)，恢復(fù)效率達(dá)到82％(圖3中的MB+Apt+METH)。分析其原因，一方面甲基安非他命適配體可以與DNA酶分子信標(biāo)通過堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行部分鍵和形成雙鏈。另一方面，甲基安非他命適配體可以與甲基安非他命進(jìn)行特異性結(jié)合形成甲基安非他命-適配體復(fù)合物。換句話說，甲基安非他命與DNA酶分子信標(biāo)競爭性的與甲基安非他命適配體結(jié)合。當(dāng)甲基安非他命加入到均相溶液體系后DNA酶分子信標(biāo)可以特異性的與甲基安非他命適配體結(jié)合，從而使得適配體從雙鏈DNA解離，也就使得DNA酶分子信標(biāo)變成單鏈，可以形成具有過氧化物酶活性的G四聯(lián)體-氯高鐵血紅素復(fù)合物結(jié)構(gòu)。從而使得ABTS被催化氧化成ABTS^·+，紫外可見吸收信號(hào)在波長415納米處顯著增強(qiáng)。

實(shí)施例二用于檢測甲基安非他命的生物傳感器

根據(jù)上述檢測甲基安非他命機(jī)理，本申請(qǐng)還設(shè)計(jì)了一個(gè)基于比色分析的甲基安非他命的生物傳感器，這種傳感器簡單快速并且不需要復(fù)雜或者昂貴的儀器設(shè)備。

該用于檢測甲基安非他命的生物傳感器包括：

由DNA酶分子信標(biāo)和甲基安非他命適配體混合在HEPES緩沖溶液里形成的雙鏈DNA；

氯高鐵血紅素；

由ABTS和雙氧水混合形成的比色物質(zhì)。

其中雙鏈DNA由以下方式制成：將DNA酶分子信標(biāo)和甲基安非他命適配體各自在第一設(shè)定溫度下解離一第一預(yù)定時(shí)間后冷卻到室溫；將DNA酶分子信標(biāo)和甲基安非他命適配體混合在HEPES緩沖溶液里形成混合液，并在第二設(shè)定溫度下溫育一第二預(yù)定時(shí)間，以形成雙鏈DNA。

采用本發(fā)明的甲基安非他命檢測方法和生物傳感器進(jìn)行測定的一實(shí)例如下：

DNA酶分子信標(biāo)(10μM)和甲基安非他命適配體(10μM)各自在90℃下解離5分鐘然后緩慢冷卻到室溫。20μL的10μM DNA酶分子信標(biāo)和20μL的10μM甲基安非他命適配體混合在HEPES緩沖溶液里，并溫育在37℃下半個(gè)小時(shí)，然后甲基安非他命和10μL的5μM氯高鐵血紅素加入到混合液中，并加入緩沖液使其最終體積160μL，然后在37℃下溫育一個(gè)小時(shí)，然后20μL 7.2mM ABTS和20μL H₂O₂(15‰，v/v)加入到混合液中。然后混合物混勻后在室溫下反應(yīng)10分鐘，然后在室溫下進(jìn)行比色測定。

如圖4所示，本發(fā)明成功的設(shè)計(jì)了一個(gè)新的、簡單的，靈敏的甲基安非他命檢測方法。DNA酶分子信標(biāo)/甲基安非他命適配體濃度為1uM的情況下，安非他命濃度在0-1000nM范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，吸收信號(hào)變強(qiáng)。附圖4表明在波長為415納米的信號(hào)強(qiáng)度跟甲基安非他命的濃度在8nM-500nM具有很好的線性關(guān)系線性相關(guān)系數(shù)R²為0.991，根據(jù)三倍標(biāo)準(zhǔn)偏差規(guī)則，檢測限為0.5nM。不僅如此，通過實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，如果對(duì)甲基安非他命濃度取對(duì)數(shù)，對(duì)數(shù)濃度與相應(yīng)的吸收信號(hào)強(qiáng)度也具有線性關(guān)系，線性范圍為0.5nM-200，相關(guān)系數(shù)為R₂²＝0.983(Fig.S3，seen in the Supporting Information)。更加顯著地是，不同濃度的甲基安非他命加入到檢測體系中(blank，0.50nM，1.00nM，5.00nM，10.00nM，50.00nM，100.00nM，200.00nM，500.00nM，and 1000.00nM)，可以用裸眼顯著的看到其顏色的變化梯度，如圖5所示。與現(xiàn)有技術(shù)中其他甲基安非他命檢測方法相比，這個(gè)方法具有讓人滿意的靈敏度及其獨(dú)特的優(yōu)勢。另外，所提出方案的甲基安非他命的檢測方法的檢出限遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于美國國家毒品管理機(jī)構(gòu)推薦的1000ng/ml(6.7μM)。

為了測定該方法的特異性，利用其他毒品進(jìn)行一系列的干擾試驗(yàn)。這些毒品包括美沙酮，可卡因，mephedrone，卡西酮，甲卡西酮，BZP，TFMPP，MDPV，(1)-MDA，MDMA，EDDP和m-CPP(1000ppb)。圖6中從左到右依次是METH、KET、NK、MOR、MTD、COC、MEP、MDMA、CAT、MCAT、BZP、TFMPP、MDPV、MDA、EDDP、m-CPP、空白樣品的檢測結(jié)果，由圖6可知，在甲基安非他命的存在下，吸收信號(hào)顯著增強(qiáng)，而加入的其他毒品后，吸收信號(hào)卻相當(dāng)?shù)?，與空白樣品相比沒有什么變化。這表明，即使在其它高濃度物質(zhì)的干擾下，該方法對(duì)甲基安非他命的檢測幾乎不受到其他物質(zhì)的干擾，具有顯著的特異性。這主要是由于甲基安非他命適配體對(duì)甲基安非他命具有很強(qiáng)的特異性結(jié)合作用。

為了研究該方法在實(shí)際樣品中的應(yīng)用潛能，該方法應(yīng)用到尿樣中甲基安非他命的檢測。吸毒人員的尿樣來源于公安部禁毒局。所有的尿樣需用0.22μm濾膜過濾。首先進(jìn)行加標(biāo)回收率計(jì)算，不同濃度的甲基安非他命加入到一定體積的尿樣中(最終濃度為50，100and 200ppb)。根據(jù)下表1，甲基安非他命加標(biāo)回收率取得令人滿意的效果，回收率大于85％。另外，HPLC-MS用于尿樣中甲基安非他命的檢測，以對(duì)比新設(shè)計(jì)探針的準(zhǔn)確性。從測得的結(jié)果表明，液質(zhì)連用儀器測得的尿樣濃度跟新設(shè)計(jì)的濃度一致。因此，本發(fā)明的檢測方法具有巨大的潛力應(yīng)用于實(shí)際樣品中的甲基安非他命的檢測。

表1.水樣中METH的加標(biāo)回收率(50.0，100.0and 200.0g L^-1)

綜上所述，本發(fā)明成功的構(gòu)建了一個(gè)簡單，成本低廉的，免標(biāo)記的高選擇性和高靈敏度的生物傳感器。該生物傳感器是基于G四聯(lián)體-氯高鐵血紅素DNA酶分子信標(biāo)來構(gòu)建的甲基安非他命檢測方法。該方法的檢測限為0.5nM，線性范圍為8-500nM。此外，其他毒品的存在對(duì)甲基安非他命的檢測沒有干擾，具有很高的特異性。最后，我們利用所設(shè)計(jì)的方法用于尿樣中甲基安非他命的檢測，加標(biāo)回收率超過85％。不僅如此，利用該方法測定的5個(gè)尿樣中的甲基安非他命的濃度與HPLC-MS測定的結(jié)果一致。這表明G四聯(lián)體-氯高鐵血紅素復(fù)合物結(jié)構(gòu)的DNA酶分子信標(biāo)探針具有很大的潛力應(yīng)用于實(shí)際樣品中的甲基安非他命檢測。并且值得注意的是，這種DNA酶分子信標(biāo)探針只需要改變部分堿基和對(duì)應(yīng)的適配體就有可能應(yīng)用到其他目標(biāo)物的檢測。

以上所述的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。