本發(fā)明涉及一種定量判斷材料抗菌率的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

TTC法是定性判定細(xì)菌活性的常用方法，可間接測量藥品的抑菌性能。TTC顯色的效果代表被測物質(zhì)抗菌力的強(qiáng)弱。顯色越明顯抑菌性能越差。此方法是將顯色完成的菌液用有機(jī)溶劑提出色素，測量吸光度，用吸光度定量表示抗菌能力的強(qiáng)弱。然后繪制吸光度曲線。通過吸光度曲線預(yù)測藥品的抑菌趨勢。

TTC法可以間接定性的評估抗菌劑對細(xì)菌的抑菌活性，應(yīng)用較為廣泛，但是這種方法無法實(shí)施定量實(shí)驗(yàn)。例如，顯色后的菌液渾濁，影響吸光度無法測量，且將濁液離心后，色素也被分離無法準(zhǔn)確測量，其他操作更會影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。該方法無法提供定量結(jié)果。

為了克服上述弊端，實(shí)施一種適用性廣的抗菌劑定量測試抑菌性的方法，并加以應(yīng)用，這也是本發(fā)明的創(chuàng)新之處。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是要解決TTC法在定量試驗(yàn)中不可操作性，而提供的一種定量判斷材料抗菌率的方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明一種定量判斷材料抗菌率的方法具體步驟為：

①0.1mol/L的葡萄糖溶液、pH=8.4的Tris-HCL緩沖液、1 mg/L的TTC溶液、丙酮石油醚混合溶液（2:3）、幾個(gè)不同濃度的藥品溶液；

②將2mL菌液和各濃度藥品溶液1mL分裝于比色管內(nèi)，放置于恒溫水浴振蕩器，37℃，振蕩頻率視情況而定。20min-30min后分別按順序加入pH=8.4的Tris-HCL緩沖液2mL、1mol/L的葡萄糖溶液2mL、1mg/L的TTC溶液2mL，繼續(xù)恒溫20min-30min；

③向顯色好的菌液中分別加入10mL丙酮石油醚混合溶液，充分震蕩，使色素全部提取出來；

④測量各色素層的吸光度并以濃度和吸光度繪制曲線，對材料抑菌性進(jìn)行定量判定。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：便于操作，定性容易，得到的對比圖易分析，數(shù)據(jù)可靠。適用對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等常見菌種的抑菌測試。

附圖說明

以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明加以詳細(xì)說明。

圖1為抗菌劑的IR圖

圖2為抗菌劑的UV圖

圖3為抗菌劑的TG圖

圖4為抗菌劑的XRD圖

圖5為未加萃取劑顯色完全的蠟樣芽胞桿菌菌液

圖6為加入萃取劑萃取完成的蠟樣芽胞桿菌菌液

圖7藥品濃度對吸光度的曲線

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：自制抗菌劑雜多酸鹽β₂-SiW₁₁Ti，取Na₂SiO₃2.881g 于50mL燒杯中，加入25mL蒸餾水，超生溶解，稱取Na₂WO₄54.575g于250mL燒杯中，加入50mL蒸餾水超聲溶解，在Na₂WO₄溶液磁力攪拌條件下，向溶液中逐滴滴加4mol/L的HCl溶液，調(diào)節(jié)溶液pH=5~6，劇烈攪拌是局部產(chǎn)生的鎢酸鈉沉淀全部溶解，之后迅速倒入Na₂SiO₃水溶液，再用4mol/L的HCl溶液，調(diào)節(jié)溶液pH=5~6，保持100min，抽濾，濾除不溶物，向?yàn)V液中加入23.217g KCl(s)，磁力攪拌25min，產(chǎn)生白色沉淀，抽濾，所得產(chǎn)品用1mol/L 的KCl溶液淋洗數(shù)次，得到白色粉末，置于空氣中干燥，稱重，裝瓶并貼好標(biāo)簽，記β₂- SiW₁₁。取8.028gβ₂-SiW₁₁于250mL燒杯中，加入80mL蒸餾水，超生溶解，在100℃恒溫磁力攪拌30min，逐滴加入1.6mL的TiCl₄溶液（2mol/L），投入6.291gKCl(s) 固體，抽濾，所得產(chǎn)品用1mol/L 的KCl溶液淋洗數(shù)次，得到淡綠色粉末，置于空氣中干燥，稱重，裝瓶平貼好標(biāo)簽，記β₂-SiW₁₁Ti。

實(shí)施例2：附圖1是抗菌劑的IR圖，從圖中可以看出，在700～1100 cm^-1指紋區(qū)范圍內(nèi)出現(xiàn)了Keggin結(jié)構(gòu)的雜多酸鹽的四個(gè)特征吸收峰。其中，786.99cm^-1處的吸收峰是W-O_c-W鍵的反對稱伸縮振動，917.62cm^-1處的吸收峰是W-O_b-W鍵的反對稱伸縮振動，969.90cm^-1處的特征峰屬于W=O_d鍵的反對稱伸縮振動，1009.58cm^-1處的特征峰屬于Si-O_a鍵的反對稱的代伸縮振動655.76cm^-1的峰位說明鈦原子成功取代。這表明β₂-SiW₁₁Ti符合Keggin結(jié)構(gòu)的基本特征。除此之外， 1620^-1附近處的吸收峰是水分子的H-O-H鍵的彎曲振動，3415.09cm^-1處的吸收峰是水分子中O-H鍵的對稱伸縮振動，從中可以看出，所合成的雜多酸鹽含有結(jié)晶水。

實(shí)施例3：附圖2是抗菌劑的UV圖，在210nm和230nm處出現(xiàn)了兩個(gè)吸收譜帶，分別對應(yīng)于O_d→W間的荷移躍遷和O_b/O_c→W間的荷移躍遷。其中，210nm處是高能量吸收峰，230nm處是低能量吸收峰，也就是210nm處的電子躍遷能更大。β₂-SiW₁₁Ti具有Keggin結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例4：附圖3是抗菌劑的TG圖，TG曲線是研究雜多酸化合物熱穩(wěn)定性的有力工具。從曲線上可以看出，β₂-SiW₁₁Ti有三個(gè)失重過程，從20oC開始失重，至526oC左右基本恒重，這說明β₂-SiW₁₁Ti的熱穩(wěn)定性較好。第一步失重范圍是20oC～110oC，這部分失去的是吸附水，第二步失重范圍是110oC～450oC，失去的是結(jié)晶水，第三步在450oC～526oC失重，失去的也是結(jié)晶水，但后兩步失去的結(jié)晶水是有差別的，結(jié)晶水是以氫鍵的形式與雜多酸鹽結(jié)合的，結(jié)晶水一般有兩種存在形態(tài)，一種可能是結(jié)晶水與極氧形成氫鍵，另一種可能是結(jié)晶水與赤道氧形成氫鍵。526oC～700oC的范圍內(nèi)，曲線上是一條直線，雜多酸鹽不再失重，在整個(gè)過程中，雜多酸鹽沒有分解，有較好的熱穩(wěn)定性。

實(shí)施例5：附圖4是抗菌劑的XRD，Keggin結(jié)構(gòu)的多酸特征2θ度數(shù)為8.28°、8.9°、9.1°、27.9°、28.9°。由圖可以看出在9.12°、11.06°、26.88°、27.8°有峰，說明產(chǎn)物為Keggin結(jié)構(gòu)，而幾個(gè)衍射峰發(fā)生偏移，且有幾個(gè)衍射峰沒有出現(xiàn)說明由于鈦原子的取代使得晶型發(fā)生畸變。

實(shí)施例6稱取1.938 g葡萄糖再加入100 mL去離子水，配置成0.1 mol/L的葡萄糖溶液；稱取3.019g三（羥甲基）氨基甲烷加水溶解，再加入10 mL1mol/L的HCl溶液定容至500 mL，配置成pH=8.4的Tris-HCl緩沖液備用，稱取0.050 g TTC放于棕色瓶中，加入50 mL的去離子水配置成1mg/L的TTC溶液備用。取β₂-SiW₁₁Ti五個(gè)濃度的溶液（0.00125g/mL、0.0025 g/mL、0.00375 g/mL、0.005 g/mL、0.0075 g/mL）各1mL加入到比色管中，再向每個(gè)管中加入2mL蠟樣芽胞桿菌菌液，放置在37℃環(huán)境中20min-30min。取出后依次向試管中加入2 mL Tris-HCl緩沖溶液，2 mL葡萄糖溶液，2 mL TTC溶液。在37 ℃的環(huán)境下放置20 min。加入丙酮石油醚溶液（丙酮:石油醚=2:3）。充分搖勻，提取出色素。測量色素層的吸光度。色素層測量最大吸收波長（420nm-600nm）。得到最大吸收波長后，在最大吸收波長下對五個(gè)濃度下的色素層進(jìn)行吸光度測量。

實(shí)施例7：圖5是未加為未加萃取劑顯色完全的蠟樣芽胞桿菌菌液，從圖中看到，經(jīng)過培養(yǎng)后，菌液已經(jīng)不同程度的顯色；圖6是為加入萃取劑萃取完成的蠟樣芽胞桿菌菌液，從圖中看到，經(jīng)過萃取劑萃取后，菌液幾乎褪色，色素層不同程度程度的顯色。

實(shí)施例8：圖7是藥品濃度對吸光度的曲線，由曲線可看出最佳抑菌濃度為0.0025g/mL。0.005g/mL后隨著濃度升高吸光度又逐漸降低，這說明隨著濃度升高抑菌性能也逐漸提升?？赡転闈舛冗^大改變細(xì)菌內(nèi)外滲透壓，使細(xì)菌脫水而死亡。抑菌趨勢可明顯直觀的顯示在圖上，更利于分析。