相關(guān)申請(qǐng)的引證
本申請(qǐng)要求于2014年10月7日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)62/060,916的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，通過引用將該公開的全部?jī)?nèi)容結(jié)合于此。
本公開的主題在一些實(shí)施方式中涉及評(píng)估候選化合物在體外培養(yǎng)物和/或懸浮液中的布置和/或影響以預(yù)測(cè)該候選化合物的體內(nèi)布置和/或影響的方法。更具體地，本公開的主題涉及評(píng)估布置和/影響的方法，其包括但不限于吸收清除率、基底側(cè)流出物清除率(basolateraleffluxclearance)、微管流出物清除率(canaliculareffluxclearance)、細(xì)胞內(nèi)濃度、膽清除率、新陳代謝清除率和候選化合物在體外培養(yǎng)和/或懸浮液中的化合物動(dòng)力學(xué)的整合影響，來預(yù)測(cè)候選化合物的體內(nèi)布置和/或影響。在一些實(shí)施方式中，該方法包括將培養(yǎng)物和/或懸浮液暴露于提供體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境的介質(zhì)如包含生理濃度或提供類似于生理濃度的結(jié)合特征的濃度的組分如蛋白質(zhì)的介質(zhì)。
背景技術(shù)：
典型地，在使用肝細(xì)胞或相關(guān)的細(xì)胞系(懸浮的、鋪板的、夾心培養(yǎng)的(sandwich-cultured)或其他3d模型、caco-2、mdck、opti-targettm(optiviabiotechnology，menlopark，加利福尼亞，美國)和在商品名稱
因此，仍需要不依賴于這種校正測(cè)量和假設(shè)的方法。需要評(píng)估候選化合物在體外培養(yǎng)物和/或懸浮液中的布置和/或影響來預(yù)測(cè)該候選化合物的體內(nèi)布置和/或影響的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
在一些實(shí)施方式中，所述方法包括提供細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液；將候選化合物暴露于培養(yǎng)物和/或懸浮液；將培養(yǎng)物和/或懸浮液暴露于提供體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境的介質(zhì)，如包含生理濃度或表明具有與生理濃度類似的結(jié)合特征的蛋白質(zhì)濃度的組分如一種蛋白質(zhì)或多種蛋白質(zhì)的介質(zhì)；以及確定培養(yǎng)物和/或懸浮液吸收的候選化合物的量，從而評(píng)估化合物的布置和/或評(píng)估化合物的影響以預(yù)測(cè)候選化合物的體內(nèi)布置和/或影響。
在一些實(shí)施方式中，提供了評(píng)估候選化合物在體外培養(yǎng)物和/或懸浮液中的布置以預(yù)測(cè)候選化合物的體內(nèi)布置的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括：提供細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液；將候選化合物暴露于培養(yǎng)物和/或懸浮液；將培養(yǎng)物和/或懸浮液暴露于提供體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境的介質(zhì)；以及確定培養(yǎng)物和/或懸浮液吸收的候選化合物的量，從而評(píng)估化合物的布置以預(yù)測(cè)候選化合物的體內(nèi)布置。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液包含適合模擬細(xì)胞的人工膜系統(tǒng)。在一些實(shí)施方式中，人工膜系統(tǒng)在與支持細(xì)胞的共同培養(yǎng)物中模擬細(xì)胞，其中，支持細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞和/或庫柏法細(xì)胞(kupffercell)。在一些實(shí)施方式中，由人工膜系統(tǒng)模擬的細(xì)胞選自由小泡、肝細(xì)胞、源自肝臟的細(xì)胞、腎細(xì)胞、胃腸細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、心臟細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂細(xì)胞和肺細(xì)胞組成的組。在一些實(shí)施方式中，由人工膜系統(tǒng)模擬的細(xì)胞包含細(xì)胞系，可選地其中，細(xì)胞系選自由
在一些實(shí)施方式中，提供了篩選候選化合物對(duì)膽分泌的敏感性的方法。在一些實(shí)施方式中，該方法包括：提供包含適合模擬細(xì)胞的人工膜系統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液和至少一種膽小管；將候選化合物暴露于細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液；將細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液暴露于提供體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境的介質(zhì)；以及確定至少一種膽小管中的候選化合物的量，從而篩選候選化合物對(duì)膽分泌的敏感性。在一些實(shí)施方式中，確定至少一種膽小管中的候選化合物的量包括：同時(shí)暴露于細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液一段足以吸收候選化合物和預(yù)選定量的用于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的標(biāo)記底物的時(shí)間；洗滌細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液；以及檢測(cè)存在于至少一種膽小管中的標(biāo)記底物的量來評(píng)估候選化合物和標(biāo)記底物之間對(duì)通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的膽分泌的競(jìng)爭(zhēng)，其中，與預(yù)選定量的標(biāo)記底物相比至少一種膽小管中存在降低量的標(biāo)記底物表示候選化合物對(duì)通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的膽分泌的敏感性。在一些實(shí)施方式中，人工膜系統(tǒng)在與支持細(xì)胞的共同培養(yǎng)物中模擬細(xì)胞，其中，支持細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞和/或庫柏法細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，由人工膜系統(tǒng)模擬的細(xì)胞選自由小泡(vesicle)、肝細(xì)胞、源自肝臟的細(xì)胞、腎細(xì)胞、胃腸細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、心臟細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂細(xì)胞和肺細(xì)胞組成的組。在一些實(shí)施方式中，由人工膜系統(tǒng)模擬的細(xì)胞包含細(xì)胞系，可選地其中，細(xì)胞系選自由
在一些實(shí)施方式中，提供了篩選候選化合物對(duì)膽分泌的敏感性的方法。在一些實(shí)施方式中，該方法包括：建立第一和第二細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液和至少一種膽小管，第一和第二培養(yǎng)物和/或懸浮液各自包含適合模擬細(xì)胞的人工膜系統(tǒng)，第一培養(yǎng)物和/或懸浮液具有完整的膽小管以及第二培養(yǎng)物和/或懸浮液具有破壞的膽小管；將候選化合物暴露于第一培養(yǎng)物和/或懸浮液和第二培養(yǎng)物和/或懸浮液一段足以允許吸收候選化合物的時(shí)間；將第一培養(yǎng)物和/或懸浮液和第二培養(yǎng)物和/或懸浮液暴露于提供體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境的介質(zhì)；洗滌和裂解第一培養(yǎng)物和/或懸浮液和第二培養(yǎng)物和/或懸浮液；以及確定存在于由步驟(d)中的每種培養(yǎng)物和/或懸浮液得到的裂解物中的候選化合物的量以及使用每種培養(yǎng)物和/或懸浮液裂解物中的候選化合物的量評(píng)估候選化合物對(duì)膽分泌的敏感性。在一些實(shí)施方式中，該方法包括：將候選化合物暴露于第一培養(yǎng)物和/或懸浮液和第二培養(yǎng)物和/或懸浮液中的每一種持續(xù)一段足以允許吸收候選化合物的時(shí)間(t)；將第一培養(yǎng)物和/或懸浮液和第二培養(yǎng)物和/或懸浮液暴露于提供體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境的介質(zhì)；洗滌和裂解第一和第二培養(yǎng)物和/或懸浮液中的每一種的第一部分和第二部分；測(cè)量存在于由步驟(iii)中的第一和第二培養(yǎng)物和/或懸浮液中的每一種得到的裂解物中的候選化合物的量；作為存在于來自具有完整的膽小管的第一培養(yǎng)物和/或懸浮液和具有破壞的膽小管的第二培養(yǎng)物和/或懸浮液的裂解物中的候選化合物的量的差值計(jì)算膽小管中的質(zhì)量；以及使用步驟(iv)中計(jì)算的質(zhì)量評(píng)估候選化合物對(duì)膽分泌的敏感性。在一些實(shí)施方式中，人工膜系統(tǒng)在與支持細(xì)胞的共同培養(yǎng)物中模擬細(xì)胞，其中，支持細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞和/或庫柏法細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，由人工膜系統(tǒng)模擬的細(xì)胞選自由小泡、肝細(xì)胞、源自肝臟的細(xì)胞、腎細(xì)胞、胃腸細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、心臟細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂細(xì)胞和肺細(xì)胞組成的組。在一些實(shí)施方式中，由人工膜系統(tǒng)模擬的細(xì)胞包含細(xì)胞系，可選地其中，細(xì)胞系選自由
在一些實(shí)施方式中，提供了評(píng)估候選化合物在體外培養(yǎng)物和/或懸浮液中的影響以預(yù)測(cè)候選化合物的體內(nèi)影響的方法。在一些實(shí)施方式中，該方法包括：提供細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液；將細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液暴露于至少一種候選化合物至少一次；將細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液暴露于提供體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境的介質(zhì)；以及評(píng)估暴露至少一種候選化合物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液的影響以預(yù)測(cè)候選化合物的體內(nèi)影響。在一些實(shí)施方式中，該方法包括提供包含適合模擬細(xì)胞的人工膜系統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液和至少一種膽小管。在一些實(shí)施方式中，人工膜系統(tǒng)在與支持細(xì)胞的共同培養(yǎng)物中模擬細(xì)胞，其中，支持細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞和/或庫柏法細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，由人工膜系統(tǒng)模擬的細(xì)胞選自由小泡、肝細(xì)胞、源自肝臟的細(xì)胞、腎細(xì)胞、胃腸細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、心臟細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂細(xì)胞和肺細(xì)胞組成的組。在一些實(shí)施方式中，由人工膜系統(tǒng)模擬的細(xì)胞包含細(xì)胞系，可選地其中，細(xì)胞系選自由
在本公開的主題的一些實(shí)施方式中，從選自由以下各項(xiàng)組成的組的來源分離細(xì)胞：小鼠、大鼠、兔子、人、猴子、類人猿、貓、狗、豬(pig)、食用豬(hog)、牛(cattle)、公牛(oxen)、綿羊、馬、火雞、雞、魚、鴨子和鵝。在本公開的主題的一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)物和/或懸浮液進(jìn)一步包含長期培養(yǎng)物和/或懸浮液。在本公開的主題的一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)物和/或懸浮液包含微管網(wǎng)絡(luò)。在本公開的主題的一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)物和/或懸浮液的特征為具有選自由集群(cluster)、聚集體(aggregate)、至少一層細(xì)胞和它們的組合的組成的組的構(gòu)造。在本公開的主題的一些實(shí)施方式中，將細(xì)胞包埋(embed)在基質(zhì)中。在本公開的主題的一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)物和/或懸浮液進(jìn)一步包含夾心培養(yǎng)物和/或懸浮液，夾心培養(yǎng)物和/或懸浮液包含至少一層細(xì)胞和可選地至少一層細(xì)胞內(nèi)的至少一種膽小管。在本公開的主題的一些實(shí)施方式中，夾心培養(yǎng)物和/或懸浮液進(jìn)一步包含長期夾心培養(yǎng)物和/或懸浮液。在本公開的主題的一些實(shí)施方式中，將至少一層細(xì)胞夾在兩層基質(zhì)之間。在本公開的主題的一些實(shí)施方式中，基質(zhì)選自由生物基質(zhì)介質(zhì)、合成的基質(zhì)介質(zhì)、與支持細(xì)胞類型的共同培養(yǎng)物和它們的組合組成的組。在本公開的主題的一些實(shí)施方式中，生物基質(zhì)介質(zhì)選自由膠原蛋白、層粘連蛋白、源自基膜的復(fù)合物、它們的衍生物和它們的組合組成的組。
在本公開的主題的一些實(shí)施方式中，提供體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境的介質(zhì)包括包含生理濃度或具有類似于生理濃度的特征的濃度的組分的介質(zhì)。在本公開的主題的一些實(shí)施方式中，組分選自包括源自小鼠、大鼠、兔子、人、猴子、類人猿、貓、狗、豬、食用豬、牛、公牛、綿羊、馬、火雞、雞、魚、鴨子或鵝的白蛋白、β-脂蛋白、α-1-酸性糖蛋白、血漿或血清、膽酸或膽酸的混合物、膽紅素和它們的組合的組。
在本公開的主題的一些實(shí)施方式中，在多孔板的至少一個(gè)孔中進(jìn)行該方法。在本公開的主題的一些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括同時(shí)篩選多種候選化合物。在本公開的主題的一些實(shí)施方式中，包含生理濃度的蛋白質(zhì)的介質(zhì)包含調(diào)節(jié)候選化合物的性質(zhì)的另一種化合物。在本公開的主題的一些實(shí)施方式中，暴露步驟中的任一種的任何組合可以以任何順序或同時(shí)發(fā)生。
本公開的主題的一個(gè)目的是提供評(píng)估候選化合物在體外培養(yǎng)物和/或懸浮液中的布置和/或影響以預(yù)測(cè)候選化合物的體內(nèi)布置和/或影響的方法。
在上文中陳述了本公開的主題的一個(gè)目的，其通過本公開的主題完全或部分地實(shí)現(xiàn)，隨著結(jié)合在以下最優(yōu)描述的所附實(shí)施例進(jìn)行描述。其他目的將變得明顯。
具體實(shí)施方式
在下文中將更充分地描述本文公開的主題，其中描述了一些而不是本公開的主題的全部實(shí)施方式。實(shí)際上，本公開的主題可以以許多不同的形式體現(xiàn)，而不應(yīng)當(dāng)解釋為限于本文中給出的實(shí)施方式；相反，提供這些實(shí)施方式，使得本公開將滿足可應(yīng)用的法律要求。
根據(jù)本公開的主題的一些實(shí)施方式，提供了在細(xì)胞外添加生理或其他相關(guān)水平的組分如蛋白質(zhì)(經(jīng)?？傮w上稱作白蛋白)以接近于體內(nèi)環(huán)境的方法，因?yàn)橥ǔＱ獫{蛋白質(zhì)和/或其他組分涉及結(jié)合藥物、化學(xué)品和內(nèi)源化合物。具體地，更加體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境將指示更加體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)濃度和化合物動(dòng)力學(xué)(隨時(shí)間改變)。細(xì)胞內(nèi)濃度和動(dòng)力學(xué)兩者是評(píng)估細(xì)胞過程的變化和測(cè)試細(xì)胞結(jié)果的驅(qū)動(dòng)因素。這些過程包括化合物的吸收、化合物的流出(efflux)(在肝臟的情況下，基底側(cè)(basolateral)和微管(canalicular))、化合物的細(xì)胞內(nèi)濃度、化合物的代謝、化合物的誘導(dǎo)潛力和化合物的毒性。通過該方法得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是出乎意料的且產(chǎn)生使用本領(lǐng)域的目前方法不能預(yù)測(cè)的結(jié)果。
典型地，在使用肝細(xì)胞或相關(guān)的細(xì)胞系(懸浮的、鋪板的、夾心培養(yǎng)的(sandwich-cultured)或其他3d模型、caco-2、mdck、opti-targettm(optiviabiotechnology，menlopark，加利福尼亞，美國)、hμrelfluxtm(hμrelcorporation，northbrunswick，新澤西州，美國)和在商品名
典型地，在其中細(xì)胞外側(cè)不存在蛋白質(zhì)的條件下評(píng)估實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)評(píng)估測(cè)試化合物的肝吸收率和膽分泌(biliaryexcretion)。這經(jīng)常是出于實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單的原因，以及典型地，將單獨(dú)確定的游離分?jǐn)?shù)應(yīng)用于這些結(jié)果。
根據(jù)本公開的主題，認(rèn)識(shí)到盲目地將游離分?jǐn)?shù)校正因子(freefractioncorrectionfactor)應(yīng)用于肝細(xì)胞測(cè)量(如吸收、膽分泌(biliaryexcretion)、肝膽清除率(hepatobiliaryclearance)或細(xì)胞內(nèi)濃度)不能提供范圍內(nèi)的(insofar)生理數(shù)據(jù)。實(shí)際上，在具體的實(shí)施例中，觀察到添加蛋白質(zhì)可以改變，經(jīng)常是顯著地改變化合物吸收進(jìn)入細(xì)胞的藥物動(dòng)力學(xué)，改變吸收蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)，以及改變熱力學(xué)結(jié)合參數(shù)。當(dāng)單獨(dú)確定游離分?jǐn)?shù)時(shí)，不考慮或不可以考慮這些參數(shù)。最終，假設(shè)吸收率與非結(jié)合的藥物濃度成比例，這在許多情況下可能是錯(cuò)誤的。實(shí)際上，本文表明了添加蛋白質(zhì)并不總是具有預(yù)期影響，即在存在蛋白質(zhì)的情況下觀察的化合物的吸收和細(xì)胞內(nèi)濃度不匹配預(yù)測(cè)的吸收。該觀察是未預(yù)料到的。
實(shí)際上，如本文的實(shí)施例部分所表明和討論的，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)出乎意料地表明對(duì)于一些化合物，在存在接近于體內(nèi)環(huán)境的條件下如存在蛋白質(zhì)的情況下，不能通過用由單獨(dú)的研究(兩步方法)得到的游離分?jǐn)?shù)值調(diào)節(jié)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)體內(nèi)膽清除率和肝臟細(xì)胞內(nèi)濃度。相反，在存在接近于體內(nèi)環(huán)境的條件，例如但不限于生理濃度的蛋白質(zhì)的情況下進(jìn)行評(píng)估，確定了用于這些參數(shù)的體內(nèi)相關(guān)的值。因此，如本文所表明的，在有些情況下，估計(jì)或計(jì)算(與觀察相對(duì))膽清除率和肝臟細(xì)胞內(nèi)濃度可以是出乎意料地和顯著地高估或低估的。
因此，在一些實(shí)施方式中，本文提供了采用結(jié)合了體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境(例如蛋白質(zhì)和/或其他組分結(jié)合效應(yīng))與細(xì)胞內(nèi)布置和/或影響評(píng)估如肝細(xì)胞布置和/或毒性的整合系統(tǒng)的方法。
在一些實(shí)施方式中，本公開的主題包括將候選化合物暴露于培養(yǎng)物和/或懸浮液；以及將培養(yǎng)物和/或懸浮液暴露于提供體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境的介質(zhì)，如包含生理濃度或具有類似于生理濃度的特征如結(jié)合特征的濃度的組分(如蛋白質(zhì)和/或其他組分)的介質(zhì)。本公開的主題的一些實(shí)施方式包括將候選化合物和組分同時(shí)暴露于吸收介質(zhì)中。實(shí)際上，本公開的主題包括暴露步驟以任何順序或同時(shí)的任何組合。在一些實(shí)施方式中，介質(zhì)包含蛋白質(zhì)并包含可以調(diào)節(jié)候選化合物的性質(zhì)的另一種組分。因此，在一些實(shí)施方式中，在包含蛋白質(zhì)的介質(zhì)的存在下，可以將培養(yǎng)物和/或懸浮液暴露于推斷的誘導(dǎo)劑或抑制劑，然后用包含候選化合物但不包含蛋白質(zhì)的介質(zhì)進(jìn)行評(píng)估。進(jìn)一步地，在一些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)可以是生理濃度或確定為具有與在生理蛋白質(zhì)濃度下觀察到的那些類似的結(jié)合特征的濃度的蛋白質(zhì)(白蛋白、α-1-酸性糖蛋白)的混合物。還包含直接由感興趣的物種得到的血清或血漿。
在本公開的主題的一些實(shí)施方式中，可以將肝細(xì)胞培養(yǎng)物如夾心培養(yǎng)的肝細(xì)胞用于評(píng)估感興趣的化合物如藥物化合物的肝吸收率和膽分泌。如美國專利第6,780,580號(hào)(通過引用將其全部?jī)?nèi)容結(jié)合于此)中公開的，篩選感興趣的化合物例如治療組合物是令人期望的，因?yàn)檫@種化合物可以通過膽分泌過程大規(guī)模地被吸收和分泌，借此它們具有賦予受試者治療效果的最小機(jī)會(huì)。因此期望建立用于化合物對(duì)肝細(xì)胞吸收和膽分泌的敏感性的體外測(cè)試，以促進(jìn)消除來自作為評(píng)估過程初期的治療劑的進(jìn)一步評(píng)估的具有不希望的高敏感性的化合物。相應(yīng)地，因?yàn)楦渭?xì)胞的培養(yǎng)物保持反映體內(nèi)肝細(xì)胞的期望的功能性質(zhì)，所以它們提供篩選感興趣的化合物對(duì)膽分泌敏感性的模型。通過引用也將以下美國專利文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容結(jié)合于此：美國專利號(hào)7,601,494；美國專利號(hào)7,682,781；美國專利號(hào)7,604,934；美國專利號(hào)8,367,630；和公開的美國專利申請(qǐng)?zhí)杣s-2010-0035293-a1。
如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解的，為了在期望水平下精確地模型化體內(nèi)生物過程，細(xì)胞(例如但不限于肝細(xì)胞)的體外培養(yǎng)物和/或懸浮液應(yīng)在結(jié)構(gòu)和功能上與體內(nèi)細(xì)胞(例如但不限于肝細(xì)胞)類似。因此，在本公開的培養(yǎng)物和/或懸浮液的一些實(shí)施方式中，建立在體內(nèi)顯示的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)。例如，根據(jù)本公開的主題提供了運(yùn)輸系統(tǒng)如竇狀小管(sinusoidal)或微管(canalicular)運(yùn)輸系統(tǒng)、或竇狀小管和微管運(yùn)輸系統(tǒng)兩者的建立。特別地，根據(jù)本公開的主題提供細(xì)胞(例如但不限于肝細(xì)胞)培養(yǎng)物和/或懸浮液中的至少一種膽小管的建立。培養(yǎng)物和/或懸浮液可以包含多種膽小管。多種膽小管可以包含微管網(wǎng)絡(luò)。至少一種膽小管或微管網(wǎng)絡(luò)的建立可以允許培養(yǎng)的細(xì)胞(例如但不限于肝細(xì)胞)分泌膽汁和膽組分至至少一種膽小管，這與體內(nèi)的膽分泌類似。
除了微管運(yùn)輸系統(tǒng)，建立了體外肝臟或肝臟相關(guān)的培養(yǎng)物中的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。肝臟相關(guān)物可以包括旨在模擬細(xì)胞的完全的人工膜系統(tǒng)，如小泡、或細(xì)胞系如
根據(jù)本公開的主題還提供了在細(xì)胞(如但不限于肝細(xì)胞)培養(yǎng)物和/或懸浮液中建立的正常的新陳代謝能力，包括代謝酶表達(dá)和活性。因此，培養(yǎng)物可以包含基本上反映體內(nèi)細(xì)胞(包括但不限于肝細(xì)胞)新陳代謝的代謝能力。本公開的主題提供了例如，但不限于在體外細(xì)胞(如但不限于肝細(xì)胞)培養(yǎng)物和/或懸浮液中的i階段代謝酶如多種p450同功酶、ii階段代謝酶如udp-葡醛酸轉(zhuǎn)移酶(udp-glucuronosyltransferase)(ugt)、和負(fù)責(zé)初級(jí)膽酸(primarybileacid)結(jié)合至牛磺酸和甘氨酸的其他酶的正常表達(dá)、功能和活性。
因此，在一些實(shí)施方式中，本文提供了評(píng)估候選化合物在體外培養(yǎng)物和/或懸浮液中的布置以預(yù)測(cè)候選化合物的體內(nèi)布置的方法。在一些實(shí)施方式中，這種方法可以包括提供細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液；將候選化合物暴露于培養(yǎng)物和/或懸浮液；將培養(yǎng)物和/或懸浮液暴露于提供體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境的介質(zhì)，如包含生理濃度或具有類似于生理濃度的特征如結(jié)合特征的濃度的組分(如蛋白質(zhì)和/或其他組分)的介質(zhì)；以及確定培養(yǎng)物和/或懸浮液吸收的候選化合物的量，從而評(píng)估化合物的布置以預(yù)測(cè)候選化合物的體內(nèi)布置。確定培養(yǎng)物和/或懸浮液中吸收的候選化合物的量從而評(píng)估布置可以進(jìn)一步包括確定候選化合物的細(xì)胞內(nèi)濃度、確定肝臟積聚、確定膽分泌和/或確定膽清除。
在一些實(shí)施方式中，提供了篩選候選化合物對(duì)膽分泌的敏感性的方法。這種篩選候選化合物對(duì)膽分泌的敏感性的方法可以包括提供細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液(如但不限于包含適于模擬細(xì)胞的人工膜系統(tǒng)的懸浮液)和至少一種膽小管；將候選化合物暴露于細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液；將細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液暴露于提供體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境的介質(zhì)，如包含生理濃度或具有類似于生理濃度的特征如結(jié)合特征的濃度的組分(如蛋白質(zhì)和/或其他組分)的介質(zhì)；以及確定在至少一種膽小管中候選化合物的量，從而篩選候選化合物對(duì)膽分泌的敏感性。
在一些實(shí)施方式中，確定在至少一種膽小管中的候選化合物的量的步驟可以包括同時(shí)暴露于細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液一段足以吸收候選化合物和預(yù)選定量的用于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的標(biāo)記底物的時(shí)間，洗滌細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液，以及檢測(cè)存在于至少一種膽小管中的標(biāo)記底物的量來評(píng)估候選化合物和標(biāo)記底物之間對(duì)通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的膽分泌的競(jìng)爭(zhēng)。在一些實(shí)施方式中，與預(yù)選定量的標(biāo)記底物相比至少一種膽小管中存在降低量的標(biāo)記底物表示候選化合物對(duì)通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的膽分泌的敏感性。在一些實(shí)施方式中，通過計(jì)算培養(yǎng)物和/或懸浮液的膽清除值確定在至少一種膽小管中的候選化合物的量。
另外，在一些方面，以上方法中的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液可以包含單獨(dú)的或與支持細(xì)胞如例如成纖維細(xì)胞和/或庫柏法細(xì)胞(kupffercell)共同培養(yǎng)的適合模擬細(xì)胞的人工膜系統(tǒng)。由人工膜系統(tǒng)模擬的細(xì)胞可以例如包括小泡(vesicle)、肝細(xì)胞、源自肝臟的細(xì)胞、腎細(xì)胞、胃腸細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、心臟細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂細(xì)胞和/或肺細(xì)胞。此外，在一些方面，由人工膜系統(tǒng)模擬的細(xì)胞可以包含細(xì)胞系。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞系選自包含
在本文描述的方法中的任一種中使用標(biāo)記底物的情況下，這種標(biāo)記底物可以包含選自由以下各項(xiàng)組成的組的化合物：熒光生成化合物(fluorogeniccompound)、發(fā)熒光的化合物(fluorescentcompound)、化學(xué)發(fā)光化合物(chemiluminescentcompound)、比色化合物(colorimetriccompound)、放射性標(biāo)記化合物和/或它們的組合。
在一些實(shí)施方式中，提供了篩選候選化合物對(duì)膽分泌的敏感性的進(jìn)一步的方法。這種方法可以包括建立第一和第二細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液和至少一種膽小管，第一培養(yǎng)物和/或懸浮液具有完整的膽小管以及第二培養(yǎng)物和/或懸浮液具有破壞的膽小管。這種方法可以進(jìn)一步包括將候選化合物暴露于第一培養(yǎng)物和/或懸浮液和第二培養(yǎng)物和/或懸浮液一段足以允許吸收候選化合物的時(shí)間；將第一和第二培養(yǎng)物和/或懸浮液暴露于提供體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境的介質(zhì)，如包含生理濃度或具有類似于生理濃度的特征如結(jié)合特征的濃度的組分(如蛋白質(zhì)和/或其他組分)的介質(zhì)；洗滌和裂解第一培養(yǎng)物和/或懸浮液和第二培養(yǎng)物和/或懸浮液；以及確定存在于由每種培養(yǎng)物和/或懸浮液得到的裂解物中的候選化合物的量以及使用每種培養(yǎng)物和/或懸浮液裂解物中的候選化合物的量評(píng)估候選化合物對(duì)膽分泌的敏感性。
在一些實(shí)施方式中，每種第一和第二培養(yǎng)物和/或懸浮液可以包含適合模擬細(xì)胞的人工膜系統(tǒng)。另外，在一些方面，以上方法中的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液包含單獨(dú)的或與支持細(xì)胞如例如成纖維細(xì)胞和/或庫柏法細(xì)胞共同培養(yǎng)的適合模擬細(xì)胞的人工膜系統(tǒng)。由人工膜系統(tǒng)模擬的細(xì)胞可以例如包括小泡、肝細(xì)胞、源自肝臟的細(xì)胞、腎細(xì)胞、胃腸細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、心臟細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂細(xì)胞和/或肺細(xì)胞。此外，在一些方面，由人工膜系統(tǒng)模擬的細(xì)胞可以包含細(xì)胞系。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞系選自包含
在一些實(shí)施方式中，采用第一和第二細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液的該方法可以進(jìn)一步包括將候選化合物暴露于第一培養(yǎng)物和/或懸浮液和第二培養(yǎng)物和/或懸浮液中的每一個(gè)持續(xù)足以允許吸收候選化合物的時(shí)間(t)；將第一和第二培養(yǎng)物和/或懸浮液暴露于提供體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境的介質(zhì)，如包含生理濃度或具有類似于生理濃度的特征如結(jié)合特征的濃度的組分(如蛋白質(zhì)和/或其他組分)的介質(zhì)；洗滌和裂解第一培養(yǎng)物和/或懸浮液和第二培養(yǎng)物和/或懸浮液中的每一個(gè)的第一部分和第二部分；測(cè)量存在于由第一培養(yǎng)物和/或懸浮液和第二培養(yǎng)物和/或懸浮液中的每一個(gè)得到的裂解物中的候選化合物的量；作為存在于來自具有完整的膽小管的第一培養(yǎng)物和/或懸浮液和具有破壞的膽小管的第二培養(yǎng)物和/或懸浮液的裂解物中的候選化合物的量的差值計(jì)算膽小管中的質(zhì)量；使用計(jì)算的質(zhì)量評(píng)估候選化合物對(duì)膽分泌的敏感性。
在一些實(shí)施方式中，提供了評(píng)估候選化合物在體外培養(yǎng)物和/或懸浮液中的影響以預(yù)測(cè)候選化合物的體內(nèi)影響的方法。在一些實(shí)施方式中，這些方法可以包括提供細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液；將細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液暴露于至少一種候選化合物至少一次；將細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液暴露于提供體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境的介質(zhì)，如包含生理濃度或具有類似于生理濃度的特征如結(jié)合特征的濃度的組分(如蛋白質(zhì)和/或其他組分)的介質(zhì)；以及評(píng)估暴露至少一種候選化合物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液的影響以預(yù)測(cè)候選化合物的體內(nèi)影響。在一些實(shí)施方式中，以上方法中評(píng)估的影響可以包括傳導(dǎo)(conduction)和其他類型的研究(新陳代謝、誘導(dǎo)和毒性)；新陳代謝研究，包括代謝物id和新陳代謝穩(wěn)定性(母體壽命)；基因調(diào)節(jié)(誘導(dǎo)/抑制)；p450和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白藥物相互作用；亞細(xì)胞積聚和游離的或總的(結(jié)合+游離的)細(xì)胞內(nèi)濃度(例如細(xì)胞核、線粒體)；和/或毒理學(xué)影響。
此外，在一些方面，這種方法可以進(jìn)一步包括提供包含適合模擬細(xì)胞的人工膜系統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液以及至少一種膽小管。在一些方面，以上方法中的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液可以包含單獨(dú)的或與支持細(xì)胞如例如成纖維細(xì)胞和/或庫柏法細(xì)胞共同培養(yǎng)的適合模擬細(xì)胞的人工膜系統(tǒng)。由人工膜系統(tǒng)模擬的細(xì)胞可以例如包括小泡、肝細(xì)胞、源自肝臟的細(xì)胞、腎細(xì)胞、胃腸細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、心臟細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂細(xì)胞和/或肺細(xì)胞。此外，在一些方面，由人工膜系統(tǒng)模擬的細(xì)胞可以包含細(xì)胞系，例如但不限于選自包含
在一些方面，公開的方法中的培養(yǎng)物和/或懸浮液可以進(jìn)一步包括長期培養(yǎng)物和/或懸浮液。培養(yǎng)物和/或懸浮液可以包含微管網(wǎng)絡(luò)。培養(yǎng)物和/或懸浮液的特征可以為具有選自由集群(cluster)、聚集體(aggregate)、至少一層細(xì)胞和它們的組合組成的組的構(gòu)造。在一些實(shí)施方式中，可以將細(xì)胞包埋在基質(zhì)中。
此外，在一些方面，公開的方法中的培養(yǎng)物和/或懸浮液可以進(jìn)一步包含夾心培養(yǎng)物和/或懸浮液，夾心培養(yǎng)物和/或懸浮液包含至少一層細(xì)胞和可選地至少一層細(xì)胞內(nèi)的至少一種膽小管。夾心培養(yǎng)物和/或懸浮液可以進(jìn)一步包含長期的夾心培養(yǎng)物和/或懸浮液?？梢詫⒅辽僖粚蛹?xì)胞夾在兩層基質(zhì)之間，其中，基質(zhì)可以選自由生物基質(zhì)介質(zhì)、合成的基質(zhì)介質(zhì)、與支持細(xì)胞類型的共同培養(yǎng)物和它們的組合組成的組。生物基質(zhì)介質(zhì)可以選自由膠原蛋白、層粘連蛋白、源自基膜的復(fù)合物(basementmembrane-derivedcomplex)、它們的衍生物和它們的組合組成的組。
在本文公開的方法的任一種中，在一些實(shí)施方式中，可以將培養(yǎng)物和/或懸浮液暴露于多種候選化合物。在本文公開的方法的一些實(shí)施方式中，可以將培養(yǎng)物和/或懸浮液重復(fù)暴露于一種或多種候選化合物。
通過舉例但不是限制，在本文公開的方法中，可以以生理濃度或具有與生理濃度類似的特征如結(jié)合特征的濃度添加的組分(如蛋白質(zhì))可以包括源自代表性或期望的受試者如小鼠、大鼠、兔子、人、猴子、類人猿、貓、狗、豬、食用豬、牛、公牛、綿羊、馬、火雞、雞、魚、鴨子或鵝的白蛋白、α-1-酸性糖蛋白、β-脂蛋白、膽紅素、膽酸或膽酸的混合物、和/或血漿或血清。另外，在一些方面，提供體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境的介質(zhì)，如包含生理濃度或具有與生理濃度類似的特征如結(jié)合特征的濃度的組分(如蛋白質(zhì)和/或其他組分)的介質(zhì)可以包含調(diào)節(jié)候選化合物的性質(zhì)的另一種化合物。另外，包含膽酸或膽酸的混合物、膽紅素、β-脂蛋白、和蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)混合物的介質(zhì)可以包含調(diào)節(jié)候選化合物的性質(zhì)的另一種化合物。進(jìn)一步地，除了生理濃度之外的組分(如蛋白質(zhì)和/或其他組分)的濃度還包括可能更高或更低但是具有類似的效果的濃度。因此，在一些實(shí)施方式中，還提供了具有類似的效果如類似的結(jié)合效果的非生理濃度。
在本文描述的方法中，可以在多孔板的至少一個(gè)孔中進(jìn)行這種方法。在這種方法中，可以同時(shí)篩選多種候選化合物。此外，在公開的方法中，暴露步驟中的任一種的任何組合可以以任何順序或同時(shí)發(fā)生。
根據(jù)本公開的主題可以采用的代表性計(jì)算包括計(jì)算膽分泌指數(shù)和膽清除率值。在一些實(shí)施方式中，膽分泌指數(shù)(biliaryexcretionindex)(bei)表示吸收至肝細(xì)胞(即分泌到膽汁)中的化合物的百分比，以及膽清除率值表示清除到膽汁中的化合物的可能性且是清除化合物進(jìn)入體內(nèi)膽汁的的最佳預(yù)測(cè)物。在一些實(shí)施方式中，bei是如下候選化合物的吸收和分泌的計(jì)算：100％x{(具有完整的膽小管的培養(yǎng)物中的吸收-僅在不含ca2+培養(yǎng)物(ca2+-freeculture)中的肝細(xì)胞內(nèi)的吸收)/(具有完整的膽小管的培養(yǎng)物中的吸收)}。在一些實(shí)施方式中，如下進(jìn)行膽清除計(jì)算：(具有完整的膽小管的培養(yǎng)物中的吸收-僅在不含ca2+培養(yǎng)物中的肝細(xì)胞內(nèi)的吸收)/(培育時(shí)間×緩沖介質(zhì)中的候選化合物的濃度)。在一些實(shí)施方式中，可以作為培養(yǎng)介質(zhì)中的膽小管中的質(zhì)量和曲線下面積(auc)的比值計(jì)算膽清除率值，其中，auc代表從時(shí)間0至?xí)r間t的介質(zhì)中的候選化合物的積分(可以以任何期望的單位測(cè)量時(shí)間，且通常以分鐘測(cè)量時(shí)間)。實(shí)際上，術(shù)語auc可以涉及以下等式：
在pharmacokinetics,secondedition(marceldekker,inc.1982),bygibaldiandperrier,(pp.13-14)中闡述了該等式。
雖然認(rèn)為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完全理解以下術(shù)語，但是闡述以下定義以有助于解釋本公開的主題。
“體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境”是模擬或接近于與用于評(píng)估根據(jù)本公開的主題的候選化合物的體外布置和/或影響相關(guān)的體內(nèi)條件的環(huán)境。例如，體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞外環(huán)境可以提供生理濃度或具有與生理濃度類似的特征如結(jié)合特征的濃度的組分(如蛋白質(zhì)和/或其他組分)，結(jié)合特征包括除了蛋白質(zhì)結(jié)合的“緊密(tightness)”之外的結(jié)合程度(由締合常數(shù)(associationconstant)ka或離解常數(shù)(dissociationconstant)kd表示)。
術(shù)語“布置(disposition)和/或影響(effect)”的組合包括但不限于以下：吸收清除率；基底側(cè)流出物清除率(basolateraleffluxclearance)；微管流出物清除率(canaliculareffluxclearance)；新陳代謝清除率(metabolicclearance)；細(xì)胞內(nèi)濃度；化合物動(dòng)力學(xué)；毒理學(xué)效果；代謝物id和新陳代謝穩(wěn)定性(母體壽命)；基因調(diào)節(jié)(誘導(dǎo)/抑制)；p450和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白藥物相互作用；亞細(xì)胞積聚和游離的或總的(結(jié)合+游離的)細(xì)胞內(nèi)濃度(例如細(xì)胞核、線粒體)和總體膽清除率。術(shù)語“布置和/或影響”的組合還包括藥物動(dòng)力學(xué)(pk)，可以將其廣義地定義為(1)有機(jī)體或系統(tǒng)是如何對(duì)感興趣的化合物作用的和(2)培養(yǎng)物和/或懸浮液系統(tǒng)中的所有附加的清除率(additiveclearance)(吸收、流出、新陳代謝)。實(shí)際上，術(shù)語“布置和/或影響”的組合可以包括任何期望的評(píng)估，在閱讀本公開后，這對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
術(shù)語“不含鈣的緩沖液(calcium-freebuffer)”旨在涉及基本上不含鈣的任何緩沖液。不含鈣的緩沖液的非限制性實(shí)例是不含鈣的hank平衡鹽溶液。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以了解的，基本上不含鈣的任何合適的緩沖液都落在本公開的主題的范圍內(nèi)。采用不含鈣的緩沖液提供用于根據(jù)本公開的主題的一些實(shí)施方式的破壞的膽小管。
短語“正常的代謝功能”、“正常的代謝活動(dòng)”和“期望的代謝特征”在本文中互換使用并旨在涉及在正常的體內(nèi)基礎(chǔ)條件下細(xì)胞例如但不限于肝細(xì)胞中的包括在代謝途徑和代謝反應(yīng)中的酶的活性、功能和/或表達(dá)。
術(shù)語“功能性質(zhì)”包括賦予包括在有機(jī)體、細(xì)胞或生物化學(xué)反應(yīng)的生物學(xué)中的指定功能的任何生物學(xué)性質(zhì)。根據(jù)本公開的主題，功能性質(zhì)可以包括酶活性、酶功能、酶表達(dá)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能、和負(fù)責(zé)酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)路徑。
術(shù)語“化合物”、“候選化合物”、“感興趣的化合物”或“藥物化合物”在本文中可互換使用并旨在涉及任何化合物(外源給予的或內(nèi)源產(chǎn)生的)，其中，化合物的新陳代謝、毒性、肝吸收或?qū)δ懛置诘拿舾行缘奶卣魇橇钊似谕?。示例性的化合物、感興趣的化合物或藥物化合物包括生物體內(nèi)異物(xenobiotic)如藥物和其他治療劑、致癌物和環(huán)境污染物以及生物體內(nèi)物質(zhì)(endobiotic)如類固醇、膽酸、脂肪酸和前列腺素。
作為治療劑的感興趣的化合物對(duì)治療溫血的脊椎動(dòng)物是有用的。因此，本公開的主題涉及哺乳動(dòng)物和鳥類。
提供了哺乳動(dòng)物的治療，如人、以及由于遭受危險(xiǎn)(如西伯利亞老虎)而具有重要性、具有經(jīng)濟(jì)重要性(在農(nóng)場(chǎng)中飼養(yǎng)的用于人消耗的動(dòng)物)和/或具有對(duì)人來說的社會(huì)重要性(作為寵物或動(dòng)物園中的動(dòng)物)的那些哺乳動(dòng)物，例如除人之外的食肉動(dòng)物(如貓和狗)、豬類(豬(pig)、食用豬(hog)和野豬(wildboar))、反芻動(dòng)物(如牛(cattle)、公牛(oxen)、綿羊、長頸鹿、鹿、山羊、野牛(bison)和駱駝)和馬。還提供了鳥類的治療，包括遭受危險(xiǎn)的、動(dòng)物園中飼養(yǎng)的那些種類的鳥、以及飛禽、和更具體地馴化的飛禽、即家禽如火雞、雞、鴨子、鵝、珠雞(guineafowl)等的治療，因?yàn)樗鼈兺瑯訉?duì)人來說具有經(jīng)濟(jì)重要性。因此，提供了家畜的治療，包括但不限于馴化的豬類(豬和食用豬)、反芻動(dòng)物、馬、家禽等。
短語“評(píng)估毒理學(xué)效果(evaluatingtoxicologicaleffect)”旨在涉及定量和/或定性測(cè)量化合物對(duì)細(xì)胞例如但不限于肝細(xì)胞的一種或多種毒性作用的任何合適的方法。
術(shù)語“膽分泌(biliaryexcretion)”旨在涉及生物過程，其中，通過被肝細(xì)胞吸收并經(jīng)由膽小管分泌從受試者的循環(huán)系統(tǒng)中除去物質(zhì)，即吸收和流出。例如，通過肝細(xì)胞的內(nèi)源運(yùn)輸系統(tǒng)介導(dǎo)吸收進(jìn)入肝細(xì)胞，肝細(xì)胞的內(nèi)源運(yùn)輸系統(tǒng)包括但不限于ntcp、oatp1和oatp2。通過流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)分泌進(jìn)入膽小管，流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括但不限于mrp2、mdr3、pgp和bsep。膽小管是肝臟組織內(nèi)的結(jié)構(gòu)，其接收來自肝細(xì)胞的分泌的組分并將膽汁運(yùn)輸至膽管(bileduct)用于從受試者中除去。
本公開的方法可以包括建立肝細(xì)胞的夾心培養(yǎng)物，其中，在兩層基質(zhì)之間形成至少一個(gè)肝細(xì)胞層。雖然作為夾心培養(yǎng)物的構(gòu)造是用于培養(yǎng)物的優(yōu)選的構(gòu)造，但是對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的任何合適的構(gòu)造都在本公開的主題的范圍內(nèi)。例如，培養(yǎng)物和/或懸浮液中的細(xì)胞(如但不限于肝細(xì)胞)的集群、聚集體或其他聯(lián)合體(association)或分組(grouping)落在本公開的主題的范圍內(nèi)，其中形成至少一種膽小管，并且其中建立了細(xì)胞(如但不限于肝細(xì)胞)的功能性質(zhì)。另外，與其他細(xì)胞類型如庫柏法細(xì)胞和成纖維細(xì)胞或源自原始間充質(zhì)(primitivemesenchyme)的其他細(xì)胞類型共同培養(yǎng)的細(xì)胞(如但不限于肝細(xì)胞)也在本公開的主題的范圍內(nèi)?？蛇x地，培養(yǎng)物和/或懸浮液構(gòu)造有助于形成反映體內(nèi)肝細(xì)胞的多種膽小管。還可選地，培養(yǎng)物構(gòu)造有助于形成微管網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步地，培養(yǎng)物構(gòu)造可選地有助于設(shè)立具有與體內(nèi)細(xì)胞(如但不限于肝細(xì)胞)的那些基本類似的希望的代謝特征的細(xì)胞(如但不限于肝細(xì)胞)的培養(yǎng)物。同樣，可選地建立期望的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)和功能，使得與體內(nèi)細(xì)胞(如但不限于肝細(xì)胞)的那些基本類似。
另外，在夾心構(gòu)造中，可以將細(xì)胞(如但不限于肝細(xì)胞)培養(yǎng)在兩層基質(zhì)或支架之間的單層中。但是，也可以將細(xì)胞(如但不限于肝細(xì)胞)包埋在基質(zhì)中或其可以通過基質(zhì)垂直、水平、對(duì)角線、或它們的任何組合非均勻地延伸，從而形成一維、二維和三維聚集體。另外，可以在生物反應(yīng)器系統(tǒng)、微環(huán)境或三維支架如但不限于三維流通系統(tǒng)(flow-throughsystem)中建立培養(yǎng)物和/或懸浮液。參見例如griffithandnaughton,(2002)science295:1009-1014。因此可以通過混合細(xì)胞(如但不限于肝細(xì)胞)與適當(dāng)?shù)幕|(zhì)以及將混合物插入到合適的培養(yǎng)物容器如多孔板或培養(yǎng)室(culturechamber)中形成細(xì)胞(如但不限于肝細(xì)胞)培養(yǎng)物和/或懸浮液。
雖然膠原蛋白是用于細(xì)胞(如但不限于肝細(xì)胞)的培養(yǎng)物和/或懸浮液的代表性基底或支架，但是對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的無論是天然的、合成的或它們的組合的任何合適的基底或支架都在本公開的主題的范圍內(nèi)。例如，其他生物基底，包括但不限于層粘連蛋白和在注冊(cè)商標(biāo)
在閱讀本公開后對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的細(xì)胞(如但不限于肝細(xì)胞)的任何合適的來源都在本公開的主題的范圍內(nèi)。示例性的來源包括以上列出的溫血脊椎動(dòng)物。具體地，示例性的來源包括但不限于人、大鼠、小鼠、猴子、類人猿、貓、狗、豬(pig)、食用豬(hog)、牛、公牛、綿羊、馬、火雞、雞、鴨子和鵝。
可以將培養(yǎng)的細(xì)胞(如但不限于肝細(xì)胞)培養(yǎng)為“長期培養(yǎng)物和/或懸浮液”?！伴L期培養(yǎng)物和/或懸浮液”旨在涉及培養(yǎng)了至少約12個(gè)小時(shí)的細(xì)胞(如但不限于肝細(xì)胞)。可選地，“長期培養(yǎng)物和/或懸浮液”旨在涉及培養(yǎng)了至少約24小時(shí)、至少約48小時(shí)、或至少約72小時(shí)的細(xì)胞(如但不限于肝細(xì)胞)。還可選地，“長期培養(yǎng)物和/或懸浮液”旨在涉及培養(yǎng)了至少約96小時(shí)、至少約一周、或至少約28天的細(xì)胞(如但不限于肝細(xì)胞)。長期培養(yǎng)有助于培養(yǎng)物和/或懸浮液內(nèi)膽小管的形成和功能性質(zhì)如代謝路徑的建立。
雖然在上文中作為代表性培養(yǎng)物描述了肝細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液，但是本公開的主題提供感興趣的任何細(xì)胞或單獨(dú)的或與可以調(diào)節(jié)公開的細(xì)胞類型的功能的支持細(xì)胞的細(xì)胞類型的任何組合的培養(yǎng)和用途。因此，在閱讀本公開后，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以改寫上文中針對(duì)任何期望的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液的用途所提供的描述和方法。代表性的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液包括但不限于包含選自由肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、胃腸細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、肌細(xì)胞、心臟細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和肺細(xì)胞組成的組的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或懸浮液。根據(jù)本公開的主題的一些實(shí)施方式，提供了單一或多種細(xì)胞類型與提供支撐基質(zhì)(如但不限于成纖維細(xì)胞)或功能(如但不限于庫柏法細(xì)胞)的其他細(xì)胞的共同培養(yǎng)物。
按照長期專利法慣例，當(dāng)在本申請(qǐng)中(包括權(quán)利要求中)使用時(shí)，術(shù)語“一種”和“一個(gè)”是指“一種或多種”。
除非另外指出，否則應(yīng)將說明書和權(quán)利要求中使用的表達(dá)成分、反應(yīng)條件等的量的所有數(shù)字理解為在所有情況下通過術(shù)語“約”修飾。相應(yīng)地，除非指出相反，否則在本說明書和所附權(quán)利要求中闡述的數(shù)字參數(shù)是近似的，其可以根據(jù)試圖通過本公開的主題得到的期望的性質(zhì)改變。
如在本文中使用的，術(shù)語“約”當(dāng)涉及數(shù)值或質(zhì)量、重量、時(shí)間、體積、濃度或百分比的量時(shí)，旨在包括從指定量，在一些實(shí)施方式中±20％、在一些實(shí)施方式中±10％、在一些實(shí)施方式中±5％、在一些實(shí)施方式中±1％、在一些實(shí)施方式中±0.5％、和在一些實(shí)施方式中±0.1％的變化，因?yàn)檫@種變化適合進(jìn)行公開的方法。
如在本文中使用的，術(shù)語“和/或”當(dāng)用于列舉實(shí)體(entity)的上下文時(shí)，是指單獨(dú)或組合存在的實(shí)體。因此，例如，短語“a、b、c與/和d”包括單獨(dú)的a、b、c和d，而且包括a、b、c和d的任何和所有組合和亞組合。
與“包含”、“含有”或“特征為”同義的術(shù)語“包括”是包括在內(nèi)的和開放式的且不排除另外的、未列舉的元件或方法步驟?！鞍ā笔菣?quán)利要求語言中使用的本領(lǐng)域術(shù)語，其意味著提供了指定的元件(namedelement)，但是可以添加其他元件且其仍形成權(quán)利要求范圍內(nèi)的構(gòu)造或方法。
如在本文中使用的，短語“由……組成”不包括權(quán)利要求中沒有指定的任何元件、步驟或成分。當(dāng)短語“由……組成”出現(xiàn)在權(quán)利要求主體語句中而不是緊接在前導(dǎo)詞(preamble)之后時(shí)，其僅限制該語句中闡述的元件；其他元件不排除于作為整體的權(quán)利要求。
如本文所使用的，短語“基本由…組成”將權(quán)利要求的范圍限制在指定的材料或步驟加上不會(huì)實(shí)質(zhì)上影響要求保護(hù)的主題的基本和新特征的那些。
關(guān)于術(shù)語“包括”、“由……組成”和“基本上由……組成”，其中在說明書中使用了這三個(gè)術(shù)語中的一個(gè)，本公開的內(nèi)容和要求保護(hù)的主題可以包括另兩種術(shù)語中的任一個(gè)的使用。
如在本文中使用的，“顯著”或“顯著的”涉及兩個(gè)或更多個(gè)實(shí)體之間存在非隨機(jī)關(guān)聯(lián)的概率的統(tǒng)計(jì)分析。為了確定關(guān)系是否是“顯著的”或具有“顯著”，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)操作來計(jì)算表達(dá)為“p值”的概率。認(rèn)為落在用戶定義的截止點(diǎn)下的那些p值是顯著的。在一些實(shí)施方式中，認(rèn)為小于或等于0.05、在一些實(shí)施方式中小于0.01、在一些實(shí)施方式中小于0.005和在一些實(shí)施方式中小于0.001的p值是顯著的。相應(yīng)地，認(rèn)為大于或等于0.05的p值是不顯著的。
實(shí)施例
以下討論比較在存在和不存在不同類型的蛋白質(zhì)的情況下多種化合物的肝膽(hepatobiliary)布置的多個(gè)示例性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。包括以下實(shí)施例來舉例說明本公開的主題的代表模式。按照本公開，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將了解以下實(shí)施例旨在僅是代表性的，并且可以在不背離本公開的主題的精神和范圍的情況下采用多種改變、修改和變更。
實(shí)施例1
選定化合物的游離分?jǐn)?shù)值的評(píng)估
最初，首先使用平衡滲析法識(shí)別多種化合物，其具有一定范圍內(nèi)的游離分?jǐn)?shù)(freefraction)(也稱為未結(jié)合分?jǐn)?shù)(fractionunbound))。游離分?jǐn)?shù)是認(rèn)為在溶液中熱力學(xué)游離的化合物的量/認(rèn)為熱力學(xué)結(jié)合至白蛋白的量。例如，0.428的游離分?jǐn)?shù)表示在這些條件下約43％的化合物是未結(jié)合的并游離在溶液中的。這些值示于表1中。
表1.選定化合物的游離分?jǐn)?shù)值
實(shí)施例2
大鼠肝細(xì)胞中測(cè)量的內(nèi)在膽清除率的評(píng)估
使用表1所列的化合物，在存在或不存在生理濃度的蛋白質(zhì)(4％牛血清蛋白，bsa)和由wistar大鼠得到的血清的情況下評(píng)估九種化合物的肝吸收、流出(efflux)、細(xì)胞內(nèi)濃度和膽清除率。在緩沖液(無蛋白質(zhì))中、在具有4％bsa的緩沖液中或在大鼠血清中，在1μm的濃度和10分鐘的曝露時(shí)間下在夾心培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞中確定每種化合物的數(shù)據(jù)。具體地，確定的參數(shù)是：總累積量(反映吸收，在+ca條件下確定)、細(xì)胞累積量(在-ca條件下確定，反映細(xì)胞內(nèi)濃度)、膽分泌指數(shù)(bei；表示吸收到肝細(xì)胞中和分泌到膽汁中的化合物的百分比)、和內(nèi)在的膽清除率(intrinsicbiliaryclearance)(表示化合物被消除到膽汁中的可能性且是消除化合物到體內(nèi)膽汁中的最佳預(yù)測(cè)物(predictor))。表2示出了內(nèi)在的膽清除率結(jié)果，其考慮了化合物的吸收和流出兩者。合起來，這些數(shù)據(jù)明顯地示出與在緩沖液中測(cè)量的傳統(tǒng)結(jié)果相比，添加細(xì)胞外蛋白質(zhì)可以產(chǎn)生非常不同的結(jié)果。
表2.在不同的細(xì)胞外條件下大鼠肝細(xì)胞中的內(nèi)在膽清除率
實(shí)施例3
大鼠肝細(xì)胞中測(cè)量(觀察)和計(jì)算(預(yù)測(cè))的內(nèi)在膽清除率的比較
下一步，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來比較在存在細(xì)胞外蛋白質(zhì)的情況下大鼠肝細(xì)胞中的這些相同化合物的膽清除率與在不存在蛋白質(zhì)的情況下測(cè)量的內(nèi)在膽清除率，然后使用表1中的適當(dāng)?shù)挠坞x分?jǐn)?shù)值(預(yù)測(cè)的膽清除率)調(diào)節(jié)。后一種方法是當(dāng)前的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。表3匯總了這些結(jié)果并示出了相比于基于單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的兩步過程，利用一步的整合系統(tǒng)來測(cè)量膽清除率的效果。如果兩步方法是等效的，那么將這些值進(jìn)行比對(duì)。然而，存在許多例外，包括匹伐他汀(pitavastatin)和羅素伐他汀(rosuvastatin)，其中大量低估了預(yù)測(cè)的膽清除率，可能是由于當(dāng)白蛋白存在時(shí)不曾預(yù)料到的吸收變化。還注意到高估了在1μm下的dpdpe的預(yù)測(cè)的膽清除率。在這種情況下可以高估或低估清除率或基本上這些值不等價(jià)的觀察表示當(dāng)評(píng)價(jià)細(xì)胞布置時(shí)，未預(yù)料到的相互相用的性質(zhì)和期望使用整合的方法。
表3.大鼠肝細(xì)胞中測(cè)量(觀察)和計(jì)算(預(yù)測(cè))的內(nèi)在膽清除率的比較
正常地，預(yù)期膽清除率的值中不存在差異(由于該值考慮了蛋白質(zhì)結(jié)合的程度)。從表2可以觀察到，這對(duì)于評(píng)估的許多化合物是正確的，例如甲氨蝶呤(methrotrexate)、纈沙坦(valsartan)、dpdpe、普伐他汀(pravastatin)、狄戈辛(digoxin)和?；悄懰狨?taurocholate)。然而，對(duì)于兩種化合物匹伐他汀和羅素伐他汀，在存在蛋白質(zhì)的情況下預(yù)測(cè)的內(nèi)在膽清除率值比在不存在蛋白質(zhì)的情況下觀察到的值大得多。盡管不一致，但是用血清觀察到的效果類似，表明蛋白質(zhì)組成可以對(duì)化合物的清除率預(yù)測(cè)有影響。
實(shí)施例4
大鼠肝細(xì)胞中測(cè)量(觀察)和計(jì)算(預(yù)測(cè))的細(xì)胞內(nèi)濃度的比較
在不存在或存在蛋白質(zhì)的情況下也可以確定化合物的肝臟細(xì)胞內(nèi)濃度(icc)，其反映吸收、新陳代謝和流出到細(xì)胞外的平衡。以與以上實(shí)施例3類似的方式，可以將在系統(tǒng)內(nèi)使用蛋白質(zhì)的一步方法的比較與來自兩步方法的數(shù)據(jù)比較，在兩步方法中，確定icc并使用表1中的游離分?jǐn)?shù)值調(diào)節(jié)。表4提供了比較使用多種化合物的一步整合方法觀察到的細(xì)胞內(nèi)濃度與當(dāng)首先在不存在蛋白質(zhì)的情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，然后使用來自單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)結(jié)合數(shù)據(jù)調(diào)節(jié)時(shí)預(yù)測(cè)的值的結(jié)果。如果這些方法是等價(jià)的，那么這些值應(yīng)該密切匹配。
表4.大鼠肝細(xì)胞中測(cè)量(觀察)和計(jì)算(預(yù)測(cè))的細(xì)胞內(nèi)濃度的比較
對(duì)于一些化合物，來自單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)結(jié)合信息與在不存在蛋白質(zhì)的情況下得到的細(xì)胞內(nèi)濃度數(shù)據(jù)(預(yù)測(cè)icc)的整合示出與對(duì)于細(xì)胞內(nèi)濃度觀察到的值(觀察的icc)一致。然而，對(duì)于四種化合物(纈沙坦、普伐他汀、匹伐他汀和羅素伐他汀)，不能預(yù)測(cè)細(xì)胞內(nèi)濃度或高估(纈沙坦)或低估(普伐他汀、匹伐他汀和羅素伐他汀)超過50％。在不使用整合系統(tǒng)測(cè)量的情況下，將不可以預(yù)測(cè)多少化合物被吸收到細(xì)胞中和得到的細(xì)胞內(nèi)濃度。
這些數(shù)據(jù)表明對(duì)于一些化合物，通過用由單獨(dú)的研究(兩步方法)得到的游離分?jǐn)?shù)值調(diào)節(jié)不能預(yù)測(cè)在存在蛋白質(zhì)(生理?xiàng)l件)的情況下的體內(nèi)膽清除率和肝臟細(xì)胞內(nèi)濃度。僅通過在生理濃度的蛋白質(zhì)存在的情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以確定這些參數(shù)的體內(nèi)相關(guān)值?；诨衔锏牡鞍踪|(zhì)結(jié)合不能預(yù)測(cè)該效果，因?yàn)槔i沙坦、匹伐他汀和羅素伐他汀全部以類似的程度結(jié)合至bsa。由在單獨(dú)感興趣得到的蛋白質(zhì)結(jié)合數(shù)據(jù)不能容易地預(yù)測(cè)添加蛋白質(zhì)對(duì)纈沙坦的膽清除率的影響。然而，蛋白質(zhì)對(duì)匹伐他汀和羅素伐他汀的膽清除率影響是未預(yù)料到且不能使用來自單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)結(jié)合數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)。僅當(dāng)在存在生理濃度的蛋白質(zhì)的情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以得到對(duì)匹伐他汀和羅素伐他汀的膽清除率參數(shù)的精確估計(jì)。
當(dāng)嘗試在第一次人類研究之前預(yù)測(cè)體內(nèi)清除率時(shí)，對(duì)于膽清除率的精確估計(jì)是有價(jià)值的。針對(duì)真實(shí)的體內(nèi)清除率的更精確的評(píng)估可以產(chǎn)生更好的臨床研究設(shè)計(jì)和降低對(duì)人體中的后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求、以及減少臨床發(fā)展的時(shí)間。
肝臟細(xì)胞內(nèi)濃度是發(fā)生在肝細(xì)胞內(nèi)的任何過程的驅(qū)動(dòng)力。細(xì)胞內(nèi)濃度的變化可以影響發(fā)生在肝細(xì)胞內(nèi)的任何類型的相互作用。這些可以包括但不限于：轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類藥物相互作用；化合物的代謝程度；新陳代謝相互相用；化合物的誘導(dǎo)潛能(新陳代謝或轉(zhuǎn)運(yùn))；和由化合物或其代謝物產(chǎn)生的毒性。
觀察到的蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)濃度的影響可以導(dǎo)致對(duì)化合物效果過高或過低的預(yù)測(cè)，極大地改變預(yù)期的臨床結(jié)果。例如，我們已經(jīng)在替米沙坦(telmisartan)的情況下對(duì)其進(jìn)行了觀察，認(rèn)為替米沙坦基于其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制曲線(profile)具有人膽汁郁積潛能；然而數(shù)據(jù)示出在存在白蛋白的情況下，在存在蛋白質(zhì)的情況下的人肝細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)濃度大于使用由在不存在蛋白質(zhì)的情況下進(jìn)行的研究預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)并使用游離分?jǐn)?shù)乘以100x調(diào)節(jié)的情況。然而，從未實(shí)現(xiàn)足夠高水平的細(xì)胞內(nèi)濃度來導(dǎo)致肝毒性效果。體內(nèi)數(shù)據(jù)支持這些結(jié)論，因?yàn)樘婷咨程共痪哂信c其用途相關(guān)的已知毒性。由于蛋白質(zhì)的影響是不曾預(yù)料到的和不可預(yù)測(cè)的，所以期望在實(shí)驗(yàn)期間將細(xì)胞暴露于蛋白質(zhì)。
另外的實(shí)施例包括在存在或不存在生理濃度的bsa的情況下的肝臟積聚實(shí)驗(yàn)來理解兩種化合物的體內(nèi)毒性的差異，其中體外毒性測(cè)試(在不存在蛋白質(zhì)的情況下進(jìn)行)和其他藥理學(xué)測(cè)試指示兩種密切相關(guān)的化合物應(yīng)具有體內(nèi)毒性的相同可能性。然而，當(dāng)進(jìn)行體內(nèi)測(cè)試時(shí)，兩種化合物具有顯著不同的嚙齒動(dòng)物毒性(肝臟)曲線?；谌淼?血液)暴露，研究員不能解釋該差異。無毒化合物(amg-a)具有cmax濃度和曲線下面積(auc)值，其比有毒化合物(amg-b)高6倍。研究員然后測(cè)量了細(xì)胞內(nèi)肝臟濃度，以及有毒化合物(amg-b)在肝臟中積聚至更大的程度，并具有比amg-a高約15倍的細(xì)胞內(nèi)肝臟濃度。細(xì)胞內(nèi)濃度的差異能夠解釋毒性差異。(hamadehet.al.,chem.res.toxicol.,2010,23(6),pp1025–1033)。
實(shí)施例5
在存在/不存在生理濃度的bsa的情況下amg-a和amg-b的肝臟吸收率和細(xì)胞內(nèi)濃度的評(píng)估
根據(jù)本公開的主題，在不存在或存在生理濃度的蛋白質(zhì)(4％bsa)的情況下在夾心培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞中進(jìn)行確定amg-a和amg-b的肝臟吸收率和細(xì)胞內(nèi)濃度的實(shí)驗(yàn)。在不存在或存在生理濃度的蛋白質(zhì)之間，觀察到兩種化合物的肝臟積聚和細(xì)胞內(nèi)濃度的顯著差異。在不存在生理濃度的蛋白質(zhì)的情況下進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中(表5)，在3和10μm下的amg-a(無毒)的細(xì)胞內(nèi)濃度高于毒性更強(qiáng)的化合物(amg-b)的細(xì)胞內(nèi)濃度。僅當(dāng)在存在生理濃度的蛋白質(zhì)(4％bsa)的情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)濃度(表6)，其中，毒性更強(qiáng)的化合物amg-b的細(xì)胞內(nèi)濃度顯著高于無毒化合物(amg-a)的細(xì)胞內(nèi)濃度。這些結(jié)果表明為了正確地預(yù)測(cè)體內(nèi)效果，需要存在生理濃度的蛋白質(zhì)。由蛋白質(zhì)結(jié)合數(shù)據(jù)不能預(yù)測(cè)在不存在和存在蛋白質(zhì)的情況下兩種化合物的肝臟積聚和細(xì)胞內(nèi)濃度的差異，因?yàn)榻Y(jié)合參數(shù)對(duì)于兩種化合物來說相同。
表5.在不存在蛋白質(zhì)(4％bsa)的情況下評(píng)估的amg-a和amg-b的濃度和時(shí)間依賴性吸收率
表6.在存在蛋白質(zhì)(4％bsa)的情況下評(píng)估的amg-a和amg-b的濃度和時(shí)間依賴性吸收率
對(duì)于肝臟系統(tǒng)，本公開的主題提供了在評(píng)估化合物的肝膽布置和/或影響來預(yù)測(cè)體內(nèi)相關(guān)的膽清除率和細(xì)胞內(nèi)濃度中使用蛋白質(zhì)的能力。另外，本公開的主題提供了在傳導(dǎo)(conduction)和其他類型的研究(新陳代謝、誘導(dǎo)和毒性)使用蛋白質(zhì)，其可以產(chǎn)生更多的體內(nèi)預(yù)測(cè)結(jié)果。因此，在一些實(shí)施方式中，提供了新陳代謝研究，包括代謝物id和新陳代謝穩(wěn)定性(母體壽命)(kilfordetal.,drugmetabdispos,36(7):1194-1197,july2008)；基因調(diào)節(jié)(誘導(dǎo)/抑制)(jacksonetal.chemico-biologicalinteractions,179,263–272,2009)；p450和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白藥物相互作用(包括草藥藥物相互作用)；亞細(xì)胞積聚(pfeiferetal.drugmetabdispos41:1949–1956,november2013)和游離的或總的(結(jié)合+游離的)細(xì)胞內(nèi)濃度(例如細(xì)胞核、線粒體)。在閱讀本公開之后對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是，以上所有內(nèi)容都可以采用實(shí)現(xiàn)體內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)濃度，其是新陳代謝、抑制、誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)和毒性的控制因素。
對(duì)于非肝臟系統(tǒng)，(例如細(xì)胞系如caco-2、mdck以及來自以下的器官特異性的細(xì)胞系：腎臟、胃腸、胰腺、心臟、神經(jīng)元、肺)，本公開的主題提供了使用相關(guān)的蛋白質(zhì)水平以模擬各種生理情形并得出用于測(cè)量化合物細(xì)胞內(nèi)濃度的保護(hù)方法。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的認(rèn)識(shí)和測(cè)量細(xì)胞內(nèi)體積的能力加上使用整合的方法允許預(yù)測(cè)細(xì)胞內(nèi)濃度和化合物布置和/或影響(例如暴露、流出等)。
實(shí)施例6
添加蛋白質(zhì)對(duì)p450藥物代謝酶的ic50確定的影響的評(píng)估
使用新分離的肝細(xì)胞或冷凍的肝細(xì)胞制備夾心培養(yǎng)的肝細(xì)胞(sandwich-culturedhepatocyte)(sch)。將新分離的肝細(xì)胞鋪板在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，沖洗并且用適當(dāng)物種特異性qualyst轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白溶液(qts，durham，北卡羅來納州，美國)適當(dāng)培養(yǎng)介質(zhì)(qualgrotm)飼養(yǎng)。將細(xì)胞保持在適當(dāng)?shù)奈锓N特異性介質(zhì)中直到在感興趣消耗。
按照制造商的解凍說明書解凍冷凍的肝細(xì)胞。隨后在
如以上所描述培養(yǎng)細(xì)胞，通過第6天的培養(yǎng)。在培養(yǎng)第7天，吸出廢(spent)培養(yǎng)介質(zhì)并用含有或不含有4％牛血清白蛋白(bsa)的hbss溫育溶液替換。將包含p450標(biāo)記物底物和氟康唑(fluconazole)或酮康唑(ketoconazole)中的任一種的溫育溶液直接地添加到schh中，總溫育體積為0.5ml。在細(xì)胞培養(yǎng)物培育箱(37℃；5％co2；100％濕度)中進(jìn)行原位溫育，以120rpm搖動(dòng)20-30分鐘。溫育周期之后，收集溫育的溶液并將其存儲(chǔ)在-80℃下直到處理用于生物分析。
分析原位溫育，用于檢測(cè)由咪達(dá)唑侖(midazolam)形成羥基咪達(dá)唑侖(hydoxymidazolam)和由布洛芬(ibuprofen)形成羥基布洛芬(hydroxyibuprofen)的p450介導(dǎo)的代謝物形成。簡(jiǎn)要地，將300μl體積的內(nèi)標(biāo)溶液(包含25nm三唑侖(trazolam)和d3-布洛芬(d3-ibuprofen)的甲醇)和100μl體積的hbss或hbss加4％bsa添加到堆疊在96深孔塊上的蛋白質(zhì)沉淀板中(milliporemdrpnp4；edmmillipore；billerica，馬薩諸塞州，美國)。在離心收集過濾的上清液之前，允許搖動(dòng)板1至2分鐘。蒸發(fā)樣品濾液至干燥，并在200μl樣品稀釋劑、40/60甲醇/10mm乙酸銨中重構(gòu)(reconstitute)樣品以及在平板振動(dòng)器(plateshaker)上混合至少20min。將重構(gòu)的樣品轉(zhuǎn)移至millipore0.45μm濾板(milliporemshvn45)并通過離心過濾到costar3957板中以及在lc-ms/ms分析之前用硅酮capmat(siliconecapmat)密封。
在存在和不存在4％bsa的情況下評(píng)估抑制劑氟康唑(cyp2c9)和酮康唑(cyp3a4)對(duì)schh中的cyp2c9(3-羥基布洛芬)和cyp3a4(羥基咪達(dá)唑侖)酶活性的直接抑制作用。氟康唑(cyp2c9)和酮康唑(cyp3a4)分別將cyp2c9和cyp3a4酶活性降低至對(duì)照的24.4-45.1％和32.0-71.1％。cyp2c9和cyp3a4的陽性對(duì)照抑制劑以預(yù)期的劑量依賴性方式降低酶活性。在與氟康唑的溫育混合物中添加蛋白質(zhì)(4％bsa)的影響的差別導(dǎo)致對(duì)于cyp2c9評(píng)估的ic50從56.2μm降低至27.1μm(表7和8)，而與酮康唑的混合物，對(duì)于cyp3a4評(píng)估的ic50從0.0455μm升高至0.117μm(表9和10)。這強(qiáng)調(diào)了在探針抑制劑或探針底物咪達(dá)唑侖和布洛芬中任一種的情況下，蛋白質(zhì)對(duì)多種化合物的肝吸收率和細(xì)胞內(nèi)濃度具有不同影響。
表7
表8
表9
表10
參考文獻(xiàn)
通過引用將在說明書中引用的參考文獻(xiàn)結(jié)合于本文中至它們補(bǔ)充、解釋、提供背景或教導(dǎo)本文中采用的方法、技術(shù)和/或組合物的程度。
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美國專利號(hào)6,780,580
美國專利號(hào)7,601,494
美國專利號(hào)7,604,934
美國專利號(hào)7,682,781
美國專利號(hào)8,367,630
美國專利申請(qǐng)公開號(hào)us-2010-0035293-a1
將理解在不背離本公開的主題的范圍的情況下可以改變本公開的主題的多個(gè)細(xì)節(jié)。此外，上述描述僅僅是出于舉例說明的目的而不是出于限制的目的。