本發(fā)明是在國家科學(xué)基金會(huì)授予之補(bǔ)助編號：DBI-0953902下由政府支持進(jìn)行。政府于本發(fā)明中具有特定權(quán)利。

與申請相關(guān)之交叉參考

本申請案主張于2014年7月3日提申之美國專利申請案14/324,019之優(yōu)先權(quán)，所述申請案于此通過引用整體并入本文中。

發(fā)明背景

自動(dòng)化組織學(xué)實(shí)驗(yàn)室儀器已以相對快速且一致的方式大幅改善病理實(shí)驗(yàn)室處理組織樣品的能力，特別是活檢樣品。這些成果亦稍微降低對熟練組織學(xué)人員之依賴且提升診斷材料的品質(zhì)。相似地，在其所有的限制下，目前載片掃描(slide-scanning)科技的發(fā)展已開始實(shí)現(xiàn)組織樣品的遠(yuǎn)距觀察及數(shù)位儲(chǔ)存。但用于常規(guī)病理分析之傳統(tǒng)石蠟(paraffin)包埋、切片機(jī)切割、蘇木精-伊紅(H&E)染色切片有些部分局限了使組織活檢發(fā)展在速度、品質(zhì)及完成度更為進(jìn)步的能力。

組織樣品的目測檢查仍然為組織診斷分析的主流，但輔助研究的作用逐漸增加，例如取自遺傳及蛋白質(zhì)體學(xué)的數(shù)據(jù)。這種趨勢依賴充足且適當(dāng)保存之組織的可得性，其與較小樣品及較快速的結(jié)果之利益競爭。此外，不完整的樣品分析、制備的人為因素、非量化的解讀、受限的成長模式資訊以及冗長的手動(dòng)制備程序?yàn)槿梭w樣品之傳統(tǒng)基于載片的組織學(xué)分析的一些部分，其限制了病理學(xué)的進(jìn)展。這些與病理評估中慣例的初始診斷步驟特別地相關(guān)，初始診斷通常為核心活檢或細(xì)針穿刺。

許多可選擇的組織處理及成像方法已被提出并提到傳統(tǒng)處理技術(shù)之限制。較近期的方法包含高解析度x射線電腦斷層掃描(Zehbe等人，2010,J.R.Soc.Interface 7:49-59；Ritman,2011,Annu.Rev.Biomed.Eng.13:531-552)以及光學(xué)同調(diào)斷層掃描(Zysk等人，2007,J.Biomed.Opt.12:051403-051403-21；Bizheva等人，2005,J.Biomed.Opt.10:11006-11006-07)。這些方法具有可使用于未經(jīng)處理之新鮮組織且允許完整的3維目測檢查而不改變組織及適于進(jìn)一步特性化之優(yōu)點(diǎn)。目前，尚未有適于常規(guī)病理學(xué)評估之能夠產(chǎn)生足夠解析度及對比度的影像之技術(shù)。

多光子顯微鏡(Multiphoton microscopy(MPM))，另一方面，具有提供極佳細(xì)胞細(xì)節(jié)之影像的能力，為用于研究樣品分析之常用、有效的方法。短脈沖激光光的使用亦允許二次諧波產(chǎn)生(second-harmonic generation(SHG))的同步定位，使同時(shí)產(chǎn)生重復(fù)的不對稱蛋白結(jié)構(gòu)如膠原及類淀粉蛋白(amyloid)之可量化影像變成可能。不幸地，雖然使用于MPM之長波長可比共聚焦顯微鏡于更深的組織成像，但傳統(tǒng)方法中以福馬林固定之樣本僅能在最多為50μm之深度才可達(dá)到清晰影像。先前嘗試?yán)肕PM透過固定組織成像，已使用連續(xù)切片(Ragan等人，2007,J.Biomed.Opt.12:014015-014015-9)或連續(xù)組織切除(Dechet等人，1999,J.Urol.162:1282-1284)，不是非常勞動(dòng)密集就是在成像的過程中會(huì)導(dǎo)致組織樣本的破壞，使它們在常規(guī)臨床使用上無法發(fā)展。

外科手術(shù)的很大一部分涉及術(shù)中顯微鏡咨詢，咨詢主要用于判斷手術(shù)是否需要額外切除或調(diào)整，根據(jù)腫瘤類型之特性或是否有在邊緣之惡性腫瘤。錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)相當(dāng)高─例如，重復(fù)手術(shù)、不必要的程序造成的永久身體傷害、甚至是死亡。然而，術(shù)中顯微鏡之現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法有許多周知的限制，通常是以冷凍切片進(jìn)行。其中主要為特定組織類型對冷凍的抗性以及與快速冷凍過程相關(guān)的型態(tài)變形，產(chǎn)生非常差的影像品質(zhì)，在許多情況下完全排除它們的使用。

以上提到的點(diǎn)顯示用于未切割且未包埋樣品成像之新穎的組織處理方法是被需要的。組織清洗為有用的方法，其實(shí)際且顯著地提高用于光學(xué)切片顯微鏡各種模式之成像的可用深度。過去在獲得具有清晰度之深度高解析度影像的成果局限在小部分的應(yīng)用。這些過去的方法未成功發(fā)展出可達(dá)到足以適當(dāng)實(shí)施常規(guī)病理學(xué)及許多研究工作種類所需速度之處理方法。它們也尚未能夠準(zhǔn)確地重現(xiàn)在形態(tài)學(xué)評估經(jīng)訓(xùn)練的專家習(xí)慣理解之色彩種類。

因此，可在相對短的時(shí)間內(nèi)取得深度組織的高解析度影像之實(shí)用的新處理方法仍然被需要。此外，這些深度影像需要以讓它們能夠被病理學(xué)家及微解剖研究者可立即辨識之方式取得。本發(fā)明滿足此未完成之需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一種處理組織樣品之方法被描述。所述方法包含取得組織樣品，以及將該組織樣品與包括至少一種固定劑及至少一種熒光染料之固定溶液接觸之步驟。在一實(shí)施例中，所述方法包含將該組織樣品與清洗溶液接觸之步驟。在另一實(shí)施例中，所述方法更包含成像組織樣品以產(chǎn)生組織樣品之視覺影像之步驟。在另一實(shí)施例中，所述至少一種熒光染料選自伊紅、DAPI、SYTOX綠色、吖啶橙(acridine orange)、羅丹明B(rhodamine B)、碘化丙啶(propidium iodide)及赫斯特染料(Hoechst dye)所組成之群組。在另一實(shí)施例中，所述至少一種固定劑系Methacarn氏液。在另一實(shí)施例中，所述固定溶液更包括滲透促進(jìn)劑。在另一實(shí)施例中，所述使組織樣品與固定溶液接觸之步驟約于45℃實(shí)行。在另一實(shí)施例中，所述固定溶液更包括紅血球細(xì)胞溶解劑。在另一實(shí)施例中，所述使組織樣品與固定溶液接觸之步驟在約1小時(shí)的期間內(nèi)實(shí)行。在另一實(shí)施例中，所述使組織樣品與固定溶液接觸之步驟在少于15分鐘的期間內(nèi)實(shí)行。在另一實(shí)施例中，所述清洗溶液包括苯甲醇及苯甲酸苯甲酯。在另一實(shí)施例中，苯甲醇與苯甲酸苯甲酯之比例約為1:2。在另一實(shí)施例中，所述使組織樣品與清洗溶液接觸之步驟在少于10分鐘的期間內(nèi)實(shí)行。在另一實(shí)施例中，在成像后部分經(jīng)固定及部分經(jīng)清洗之組織放置于固定劑中。在另一實(shí)施例中，所述使組織樣品與固定溶液接觸以及使組織樣品與清洗溶液接觸之步驟在約1.5小時(shí)的期間內(nèi)實(shí)行。在另一實(shí)施例中，所述組織樣品在取得組織樣品之前經(jīng)固定。

亦描述一種成像組織樣品之方法。所述方法包含以下步驟：取得組織樣品，將組織樣品與包括至少一種熒光染料的固定溶液接觸，使組織樣品與清洗溶液接觸，以及產(chǎn)生組織樣品影像，其系藉由測量組織樣品的熒光強(qiáng)度值，以及將強(qiáng)度值轉(zhuǎn)換為有效光學(xué)密度，使光學(xué)密度重建產(chǎn)生的組織樣品影像中之染色的色彩。在一實(shí)施例中，所述組織樣品影像系使用光學(xué)切片顯微鏡所產(chǎn)生。在許多實(shí)施例中，所述光學(xué)切片顯微鏡顯微鏡系選自多光子顯微鏡(MPM)、共軛焦顯微鏡、結(jié)構(gòu)照明顯微鏡、超解析顯微鏡、選擇性平面照明顯微鏡(selective plane illumination microscope(SPIM))、側(cè)平面照明顯微鏡(side-plane illumination microscope)、轉(zhuǎn)盤式共軛焦顯微鏡以及反褶積顯微鏡(deconvolution microscope)所組成之群組。在另一實(shí)施例中，所述產(chǎn)生組織樣品影像之步驟更包括二次諧波產(chǎn)生(SHG)。在另一實(shí)施例中，所述樣品影像系三維(3-D)樣品影像。在另一實(shí)施例中，所述樣品影像系在大于50μm的樣品深度取得。在另一實(shí)施例中，所述強(qiáng)度值系利用指數(shù)偽著色制程(exponential pseudo-coloration process)轉(zhuǎn)換為有效光學(xué)密度。

本發(fā)明亦關(guān)于一種樣本夾持裝置。所述樣品夾持裝置包括包含可壓縮材料之第一平板，以及包含窗口之第二平板，其中所述窗口包括透明材料。在一實(shí)施例中，所述可壓縮材料具有封閉周邊的外形。在另一實(shí)施例中，所述可壓縮材料具有固體塊的外形。在一實(shí)施例中，所述第一平板及第二平板系設(shè)計(jì)成適合于顯微鏡載物臺之尺寸。在一實(shí)施例中，所述第一平板及第二平板藉由耳片及相應(yīng)的插槽彼此接合。在一實(shí)施例中，所述可壓縮材料系多孔的。在許多實(shí)施例中，所述可壓縮材料系選自海綿、泡沫、網(wǎng)狀物、橡膠、聚合物及軟木塞所組成之群組。

本發(fā)明亦關(guān)于一種成像樣本之系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包括本發(fā)明之樣本夾持裝置以及顯微鏡。所述顯微鏡包括激光源、掃描機(jī)構(gòu)、掃描透鏡、管透鏡、顯微鏡物鏡以及雙軸精密微調(diào)移動(dòng)平臺(translation stage)，其中所述顯微鏡雙軸精密微調(diào)移動(dòng)平臺適于呈現(xiàn)本發(fā)明之樣本夾持裝置所夾持之樣本于顯微鏡物鏡下。在一實(shí)施例中，所述顯微鏡更包括光束整型器。在一實(shí)施例中，所述顯微鏡更包括至少一個(gè)分光鏡，用于反射熒光。在一實(shí)施例中，所述顯微鏡更包括至少一個(gè)偵測器，用于偵測傳送之光訊號。在一實(shí)施例中，所述顯微鏡更包括至少一個(gè)發(fā)射濾光片。在許多實(shí)施例中，所述顯微鏡激光源系選自飛秒激光(femtosecond laser)、皮秒激光(picosecond laser)、脈沖光纖激光及不可調(diào)激光所組成之群組。在一實(shí)施例中，所述顯微鏡激光具有800nm之中心波長。在許多實(shí)施例中，所述顯微鏡掃描機(jī)構(gòu)系選自共振檢流計(jì)(resonant galvanometer)及具有鏡面之旋轉(zhuǎn)多邊形所組成之群組。在一實(shí)施例中，所述顯微鏡物鏡具有至少為0.8之?dāng)?shù)值孔徑。在一實(shí)施例中，所述顯微鏡物鏡具有至少為500μm之視野。

本發(fā)明亦關(guān)于一種處理組織樣品之套組。所述套組包括至少一種固定溶液，所述固定溶液包括至少一種固定劑、至少一種熒光染料以及實(shí)行本發(fā)明之方法之操作指南材料。在一實(shí)施例中，所述至少一種固定溶液系Methacarn氏液。在一實(shí)施例中，所述至少一熒光染料系選自伊紅、DAPI、SYTOX綠色、吖啶橙、羅丹明B、碘化丙啶及赫斯特染料所組成之群組。在一實(shí)施例中，所述套組更包括至少一種清洗溶液。在一實(shí)施例中，所述至少一種清洗溶液包括苯甲醇及苯甲酸苯甲酯。在一實(shí)施例中，所述套組更包括樣本夾持裝置，其具有包括可壓縮材料之第一平板以及包括窗口之第二平板，其中所述窗口包括一透平材料。在一實(shí)施例中，所述套組更包括如本文別處所述之本發(fā)明的系統(tǒng)。

附圖說明

配合所附圖示閱讀時(shí)，下列本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例之詳細(xì)敘述將更明顯易懂。為了說明本發(fā)明，圖示中顯示的為目前優(yōu)選之實(shí)施例。然而，應(yīng)理解的是，本發(fā)明并不限于圖示所示實(shí)施例之確切排列及手段。

專利或申請文件包含至少一個(gè)彩色附圖。在提出請求及繳納所需費(fèi)用的情況下，官方將提供具有彩圖知本專利或?qū)＠暾埞_之副本。

圖1描述說明用于處理及成像樣品之示例性方法之流程圖。

圖2，包含圖2A-2D，描述清洗(clearing)之例子的影像。乳房(圖2A)及肝臟(圖2B)之福馬林固定的組織切片于苯甲醇/苯甲酸苯甲酯清洗操作規(guī)程(protocol)之前及之后(分別為圖2C及圖2D)。注意帶有一些殘留色素之幾乎完全透明的乳房組織樣本及半透明的肝臟樣本。隔線間距為0.9cm。

圖3，包含圖3A-3D，描述澄清的正常人類組職之多光子顯微鏡影像。樣本在脫水步驟期間經(jīng)SYTOX綠色或吖啶橙核酸染料染色。圖3A為在中等功率所獲得之前列腺組織樣品的影像。圖3A為在高功率所獲得之肝臟組織樣品的影像。圖3C為在中等功率所獲得之乳房組織樣品的影像。圖3D為在中等功率所獲得之腎臟組織樣品的影像。影像來自范圍200至500μm之深度。型態(tài)細(xì)節(jié)與深度在1mm時(shí)相當(dāng)。

圖4，包含圖4A-4C，描述腎臟切片之多通道(multichannel data)數(shù)據(jù)。圖4A為來自細(xì)胞質(zhì)的訊號所控制之內(nèi)部熒光的影像。圖4B為主要強(qiáng)調(diào)細(xì)胞核DNA及一些細(xì)胞質(zhì)RNA的反轉(zhuǎn)核酸熒光通道的影像。圖4C為結(jié)合內(nèi)部熒光及細(xì)胞核熒光(灰階)以及為紅色之二次諧波產(chǎn)生通道的影像，顯示膠原纖維在正常腎小球周圍的分布。

圖5為顯示偽著色(pseudo-colorization)之影像。前列腺切片于經(jīng)清洗的組織上以SYTOX綠色在約500μm的深度以多光子顯微鏡取得(如第4圖所示)，經(jīng)處理以模擬蘇木精-伊紅切片。

圖6，包含圖6A-6D，描述澄清(clarified)組織之多光子顯微鏡(MPM)后的蘇木精-伊紅(H&E)染色之影像。樣品切片來自與圖3所述之相同樣本，包含前列腺(圖6A)、肝臟(圖6B)、乳房(圖6C)及腎臟(圖6D)，在組織的清洗及MPM成像后，與傳統(tǒng)石蠟包埋、切割及H&E染色比未顯示可察覺的退化或其它視覺改變(ori MPM成像最終放大率×20[圖6A、6C及6D]及×50[圖6B])。

圖7，包含圖7A-7B，描述顯示苯甲醇/苯甲酸苯甲酯清洗及SYTOXGreen染色與傳統(tǒng)免疫組織化學(xué)于人類腎組織的相容性的例子之影像。圖7A為描述細(xì)胞角蛋白(CK)7染色的正常腎臟細(xì)胞之影像，顯示于下行髓索(descending medullary cord)轉(zhuǎn)變?yōu)殛栃匀旧念A(yù)期模式。圖7B為描述以CK20適當(dāng)缺乏相同腎組織的染色之影像(原始放大率×4[圖5A及5B])。

圖8，包含圖8A-8C，描述3-D重建正常人類組織之代表性大區(qū)塊。圖8A為描述正常人類肝臟約1-mm立方截面的影像，其系藉由多光子顯微鏡于未經(jīng)染色經(jīng)清洗的組織上(僅內(nèi)部熒光，低功率)所取得。圖8B為描述與正常人類乳房組織尺寸相似的區(qū)塊之影像，其經(jīng)固定、清洗及以核酸染料SYTOX Green(低功率)染色。圖8C為來自正常人類腎臟的膠原(約200×200×40μm)的3-D重建代表影像。

圖9，包含圖9A-9C，描述各種組織樣品。圖9A為未經(jīng)清洗的樣品之影像。圖9B為以傳統(tǒng)組織清洗方法產(chǎn)生之樣品的影像，傳統(tǒng)組織清洗方法涉及乙醇的增加梯度(50％、75％、100％)，接著浸入己烷，接著進(jìn)入比例為1:2之苯甲醇:苯甲酸苯甲酯，在1.25小時(shí)的期間內(nèi)執(zhí)行。圖9C描述利用本發(fā)明方法處理相同時(shí)間1.25小時(shí)之樣品的影像。于時(shí)間1.25小時(shí)(15分鐘清洗后處理)，比起傳統(tǒng)處理，以本發(fā)明方法之清洗顯示較深的清洗(較小的未清洗體積核心)。傳統(tǒng)方法亦顯示熒光染料滲出至BABB中(紅色調(diào)至液體)。

圖10為描述在1.5小時(shí)時(shí)具有深度之正常化平均染料之染色的曲線圖。在時(shí)間1.5小時(shí)，相較于如圖9所述之乙醇/己烷/BABB的傳統(tǒng)處理，使用本發(fā)明方法之組織處理顯示顯著較佳的染料滲透。

圖11，包含圖11A-11B，描述使用傳統(tǒng)處理方法及本發(fā)明方法處理之組織的影像。圖11A為使用傳統(tǒng)處理方法處理之組織的一系列影像。圖11B為使用本發(fā)明處理方法處理之組織的一系列影像。本發(fā)明之方法以便宜的染料組合產(chǎn)生較佳的細(xì)胞核及蛋白質(zhì)熒光訊號的分離，以及在深度500μm處顯示改善的細(xì)節(jié)且具有顯著較少的細(xì)胞萎縮。

圖12為一系列影像，其描述使用Methacarn氏液或甲醇處理組織樣品，且以熱或未以熱處理的影像。

圖13為描述以Methacarn氏液、僅以甲醇以及未以熱處理之樣品的正?；旧珡?qiáng)度相對于深度之曲線圖。

圖14，包含圖14A-14C，描述利用偽-H&E處理之組織的影像。圖14A為以細(xì)胞核染色處理之組織的影像。圖14B為以蛋白質(zhì)熒光處理之組織的影像。圖14C為利用圖14A及14B所示之影像以對數(shù)矩陣轉(zhuǎn)換的反演(inversion)成像之組織的影像。

圖15描述利用本發(fā)明之方法制備之一系列組織樣品的影像。

圖16為描述本發(fā)明的示例性樣本夾持裝置之示意圖。

圖17為描述本發(fā)明的示例性顯微鏡系統(tǒng)的光學(xué)布局之示意圖。

實(shí)施方式

應(yīng)理解的是，本發(fā)明之圖示及說明書已經(jīng)簡化，以說明對于清楚理解本發(fā)明相關(guān)之元件，同時(shí)為了簡明之目的，刪除了許多所屬技術(shù)領(lǐng)域中與組織學(xué)、組織處理等相關(guān)之其它元件。所屬技術(shù)領(lǐng)域之技術(shù)人員可能辨識出實(shí)行本發(fā)明所欲及/或所需之其它元件及/或步驟。然而，因?yàn)榇祟愒安襟E在所屬技術(shù)領(lǐng)域中為公知的，且因?yàn)樗鼈儾⑽从兄趯Ρ景l(fā)明之更佳理解，故本文中不提供此類元件及步驟的討論。本文之揭露針對所屬技術(shù)領(lǐng)域之技術(shù)人員知曉之對于此類元件及方法的所有變化及修改。盡管與本文中描述之類似或等效的方法、材料及組成均可用于本發(fā)明的實(shí)踐或測試中，但是以下描述的是優(yōu)選之方法及材料。

定義

除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與所屬技術(shù)領(lǐng)域之技術(shù)人員通常理解相同的含義。盡管與本文中描述之類似或等效的任一方法及材料均可用于本發(fā)明的實(shí)踐或測試中，但以下描述優(yōu)選之方法及材料。

如本文中所使用的，下列術(shù)語于此部分中具有與其相關(guān)之涵義。

本文中使用之冠詞“一(a)”及“一(an)”代表文章的一個(gè)或一個(gè)以上(即，至少一個(gè))的語法對象。舉例而言，“一元件”表示一個(gè)元件或一個(gè)以上的元件。

本文中使用之“約”及“大約”，當(dāng)代表可測量之?dāng)?shù)值如數(shù)量、持續(xù)的時(shí)間等，指的是包含從指定的數(shù)值之±20％或±10％，或優(yōu)選地±5％，甚至更佳地±1％，以及還更佳地±0.1％的偏差，因?yàn)榇朔N偏差對于實(shí)行揭露之方法為適當(dāng)?shù)摹?/p>

術(shù)語“異常(abnormal)”，當(dāng)使用于生物體、組織、細(xì)胞或其組成時(shí)，指的是那些生物體、組織、細(xì)胞或其組成與那些表現(xiàn)“正?！?預(yù)期的)各個(gè)特性的那些生物體、組織、細(xì)胞或其組成在至少一可觀察或偵測之特性(例如，年齡、處理、時(shí)間等)上不同。對于細(xì)胞或組織類性而言為正常或預(yù)期的特性，在不同的細(xì)胞或組織類型中可能為異常的。

“疾病(disease)”為動(dòng)物的健康狀態(tài)，其中動(dòng)物無法維持恒定狀態(tài)，且其中若疾病未改善，則所述動(dòng)物的健康持續(xù)惡化。

相較之下，動(dòng)物的“失調(diào)(disorder)”為動(dòng)物能夠維持恒定狀態(tài)，但相較于沒有所述失調(diào)的情況下動(dòng)物的健康狀態(tài)較不利之健康狀態(tài)。未經(jīng)治療時(shí)，失調(diào)不一定會(huì)造成動(dòng)物健康狀態(tài)的進(jìn)一步減退。

術(shù)語“病患”、“對象”、“個(gè)體”等于本文中可互換使用，且代表體外(in vitro)或原位(in situ)的任一動(dòng)物或其細(xì)胞，適用于本文所述之方法。在某些非限定之實(shí)施例中，病患、對象或個(gè)體為人類。

如本文中所使用，術(shù)語“固定(fixation)”代表暫停細(xì)胞降解之任一程序，例如藉由蛋白質(zhì)交聯(lián)或脫水抑制酶功能。

如本文中所使用，術(shù)語“脫水”代表從樣品移除水以藉由此種作用幫助成像的制備，如抑制酶功能及/或制造至少部分地與疏水液體互溶之溶劑環(huán)境。

如本文中所使用，用詞“BABB”代表苯甲醇以及苯甲酸苯甲酯的溶液。例如，BABB可代表苯甲醇及苯甲酸苯甲酯的溶液，其中苯甲醇比上苯甲酸苯甲酯的比例約為1:2。

如本文中所使用，術(shù)語“組織”指的是衍生自生物體的任一結(jié)構(gòu)。此術(shù)語亦包含從生物體切除或移除的任一結(jié)構(gòu)。如本文中所使用，衍伸出“組織”的生物體不須只限于人類，反之此術(shù)語包含衍伸自任一生物體的組織。關(guān)于人類，此術(shù)語包含衍伸自活人或是尸體的結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施例中，組織衍伸自哺乳類動(dòng)物，包含但不限于，人類、大鼠、小鼠及綿羊。

如本文中所使用，術(shù)語“深度成像”代表成像在距離表面大于一般可取得與傳統(tǒng)切割薄片組織相關(guān)之對比及解析程度的距離?？扇〉弥疃入S著組織類型以及固定的存在及類型而不同。為了實(shí)際目的即于本文中，深代表約大于50μm之深度。

范圍：于本揭露中，發(fā)明的許多態(tài)樣可以范圍的格式呈現(xiàn)。應(yīng)理解的是，范圍格式的描述僅是為了方便及簡潔，且不應(yīng)被解釋為對本發(fā)明范圍之不彈性的限制。因此，范圍的描述應(yīng)被認(rèn)為已具體地揭露所有可能的子范圍以及于該范圍內(nèi)的個(gè)別數(shù)值。例如，范圍的描述如1至6應(yīng)被認(rèn)為已具體地揭露例如從1至3、從1至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3至6等之子范圍，以及在該范圍內(nèi)的個(gè)別數(shù)值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。此適用于關(guān)于寬度的范圍。

描述

本發(fā)明關(guān)于組織制備及影像分析之方法，其允許組織樣品深度成像的實(shí)際實(shí)施。本文所述之方法降低組織處理的步驟數(shù)量、降低處理組織所需時(shí)間以及改善樣品的清晰度及對比度，因而允許樣品的深度組織成像。如文中說明，本發(fā)明之方法提供活檢尺寸樣本之完全的可視化(visualization)，且不需要費(fèi)時(shí)且勞動(dòng)密集之后清洗(post-clearing)步驟，因而通過形態(tài)學(xué)評估減少活檢之間的時(shí)間。在非限定的例子中，經(jīng)清洗的活檢樣本可提供病理學(xué)家直接可視化或掃描影像分布。在另一非限定的例子中，主要診斷可基于影像進(jìn)行，若需要可隨后進(jìn)行研究。在另一非限定的例子中，樣本可部分地經(jīng)固定及部分地經(jīng)清洗用于術(shù)中(intra-operative)評估或用于需要快速目測檢查之任一其它的臨床方案。在又一些實(shí)施例中，部分經(jīng)固定之樣本之后可被完全地固定，以及部分經(jīng)清洗之樣本之后可被完全地清洗。

部分地，本發(fā)明提供影像分析之方法，其允許與傳統(tǒng)組織學(xué)染色實(shí)質(zhì)上沒有區(qū)別之影像的重現(xiàn)。此方法提供模擬常見病理學(xué)染色樣品的影像，使影像可精確及有效率的解讀。與一般使用之顏色分離演算法(color separation algorithm)相反，本文所述方法利用樣品的熒光反轉(zhuǎn)這些顏色分離技術(shù)，不論是固有的或由熒光染料產(chǎn)生的，忠實(shí)地重現(xiàn)包含一般染色產(chǎn)生之組織的預(yù)期著色之影像，例如蘇木精/伊紅及瑞特/吉姆薩(wright/giemsa)，使影像可輕易地被病理學(xué)家解讀。與偽染色過去的努力相反，本文所述方法使用指數(shù)轉(zhuǎn)換方程式，使熒光發(fā)射的光學(xué)質(zhì)量更接近地匹配(match)以薄切片傳統(tǒng)照明之光吸收的那些。如文中證實(shí)，本發(fā)明之方法產(chǎn)生的影像與當(dāng)前組織學(xué)方法產(chǎn)生的那些具有相似的解析度及視野(field of view)，提供相似于一般使用之組織學(xué)染色取得之對比度，且在沒有明顯不良反應(yīng)的情況下允許后續(xù)的傳統(tǒng)處理。本文所述之多通道方法(multichannel method)提供直接的偽著色(pseudocolorization)，其以類似傳統(tǒng)染色的方法表現(xiàn)形態(tài)，使病理學(xué)家可輕易地辨識顯著的組織學(xué)特征。

關(guān)于活檢，在保持充足用于額外染色或分子分析的組織以及充分的蘇木精及伊紅(H&E)組織學(xué)之間存在權(quán)衡(trade-off)。傳統(tǒng)物理性石蠟包埋及切割的組織學(xué)技術(shù)之必然稀少的抽樣可能遺漏重要特征。例如，結(jié)腸息肉可能被遺漏、前列腺癌的小病灶可能未被診斷，以及局灶性腎病變可能不明顯。此問題因需要丟棄完整切片的最初區(qū)塊削屑(shaving)而復(fù)雜化，尤其于不完全包埋之樣本中。本文所述方法排除使用當(dāng)前組織學(xué)方法時(shí)發(fā)生的這些問題，同時(shí)允許活檢樣本之完整或深度部分的影像重建。

在快速分析的情況下，許多與組織冷凍及切片相關(guān)之人為因素及困難可藉由呈現(xiàn)的方法使未冷凍、未切割之組織可視化而克服。相較于其它利用光學(xué)切片顯微鏡使未冷凍、未切割之新鮮組織可視化相關(guān)的努力，本文所述方法完全地解決源自差的折射率指數(shù)匹配及慢的染料滲透之挑戰(zhàn)，其妨礙用于任一其它已知技術(shù)之實(shí)際診斷的充分解析度及深度之影像。

方法

在一態(tài)樣中，本發(fā)明提供處理及成像組織學(xué)樣品之方法。在一實(shí)施例中，所述方法包含取得樣品之步驟。樣品通?？蔀槿我活愋椭畼悠贰＠?，樣品可為細(xì)胞或細(xì)胞群、生物體、組織、細(xì)胞溶解物、細(xì)胞培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器(bioreactor)樣品等。在一優(yōu)選例子中，樣品為組織樣品。在另一實(shí)施例中，樣品為液體樣品，其中細(xì)胞成分已經(jīng)濃縮，例如藉由離心或過濾。組織之非限定的例子包含皮膚、肌肉、腸、乳房、心臟、腎臟、肺臟、肝臟、皮膚、胎盤、前列腺、胰臟、子宮、骨頭、骨髓、腦、胃臟、肌肉、軟骨、淋巴結(jié)、脂肪組織、扁桃腺、膽囊及脾臟，以及腦脊液、胸膜液、腹水或滑液的細(xì)胞成分。在一實(shí)施例中，組織為肝臟組織。在另一實(shí)施例中，組織為腎臟組織。在另一實(shí)施例中，組織為乳房組織。在另一實(shí)施例中，組織為前列腺組織。樣品可透過所屬技術(shù)領(lǐng)域已知之任一方法取得，如所屬技術(shù)領(lǐng)域之技術(shù)人員可理解的。在一些實(shí)施例中，樣品是在手術(shù)、活檢、細(xì)針抽吸、培養(yǎng)或尸檢期間取得。在一實(shí)施例中，樣品為新鮮的樣品。在另一實(shí)施例中，樣品為經(jīng)固定之樣品。在一實(shí)施例中，在取得組織樣品之前，組織樣品經(jīng)固定。

圖1描述說明處理及成像樣品之示例性方法1000的流程圖。方法1000包含取得樣品1010，以及使樣品1020接觸固定溶液。在一優(yōu)選實(shí)施例中，樣品為組織樣品。在某些實(shí)施例中，固定溶液包含至少一脫水劑及至少一熒光染料。在一實(shí)施例中，方法1000包含清洗樣品1030，藉由使樣品接觸清洗溶液以提供用于成像樣品1040之增加的深度及清晰度。在一實(shí)施例中，樣品在與包含固定劑或脫水劑及至少一種熒光染料之溶液接觸之前先經(jīng)固定。在另一實(shí)施例中，新鮮的組織直接地放置于固定/脫水液體以及染料(dye)或多個(gè)染料(dyes)之組合中。在一些實(shí)施例中，成像樣品之步驟與額外的成像方法一起實(shí)行，例如，二次諧波產(chǎn)生(SHG)(第1圖)。在一實(shí)施例中，樣本可部分地經(jīng)固定以用于術(shù)中(intra-operative)評估或用于需要快速目測檢查之任一其它的臨床方案。部分經(jīng)固定之樣本之后可被完全地固定。在另一實(shí)施例中，樣本可部分地經(jīng)清洗以用于術(shù)中評估或用于需要快速目測檢查之任一其它的臨床方案。部分經(jīng)清洗之樣本之后可被完全地清洗。

在一態(tài)樣中，本發(fā)明之方法更包含脫水樣品之步驟。脫水有助于將水從樣品去除，使得具有低水溶性之清洗劑可接著被使用。應(yīng)理解的是，脫水劑或脫水溶液亦可作為固定劑或用于固定樣品。如本文中使用，術(shù)語“脫水劑”代表水互溶(water-miscible)之無水液體。脫水劑之非限定的例子包含醇，如甲醇、乙醇及丙醇。在一實(shí)施例中，脫水劑為Methacarn氏液(methacarn)。在另一實(shí)施例中，脫水劑為甲醇。在一實(shí)施例中，脫水步驟用作固定劑且在沒有預(yù)先固定樣品的情況下進(jìn)行。在另一些實(shí)施例中，脫水步驟在樣品的固定之后實(shí)行。在一實(shí)施例中，脫水步驟在利用包含福馬林(formalin)之固定溶液固定樣品之后實(shí)行。

脫水步驟可實(shí)行任一合適之時(shí)間長度。時(shí)間的長度通常可為適于使樣品、或一部分的樣品與清洗劑互溶之任一合適的時(shí)間長度。時(shí)間的長度通常也可為適于保存樣品或保存一部分的樣品之任一合適的時(shí)間長度。在某些實(shí)施例中，時(shí)間的期間可為約1分鐘、約15分鐘、約30分鐘、約1小時(shí)、約2小時(shí)、約3小時(shí)、約4小時(shí)、約5小時(shí)、約6小時(shí)、約12小時(shí)、或約24小時(shí)。在一實(shí)施例中，脫水步驟實(shí)行約1小時(shí)的期間。在另一實(shí)施例中，脫水步驟實(shí)行約12至16小時(shí)的期間。

在一態(tài)樣中，本發(fā)明之方法包含固定樣品之步驟。組織樣品可利用所屬技術(shù)領(lǐng)域中已知的任一方法固定。在一實(shí)施例中，使樣品與固定劑接觸以固定樣品。在另一實(shí)施例中，使樣品與固定溶液接觸以固定樣品。在一實(shí)施例中，固定溶液包含至少一固定劑。在一實(shí)施例中，固定劑為脫水劑。在另一實(shí)施例中，固定溶液為脫水劑。在另一實(shí)施例中，固定溶液包含至少一固定劑及至少一滲透劑。固定劑之非限定的例子包含醛(例如，甲醛(多聚甲醛、福馬林)、戊二醛、丙烯醛(acrolein)(acrylic aldehyde)、乙二醛(glyoxal、diformyl)、丙二醛(malonaldehyde)(malonic dialdehyde)、二乙酰基(2,3-丁二酮)及多醛；醇(即，蛋白質(zhì)變性劑；例如，乙酸、甲醇、乙醇)、聚乙烯醇、重金屬氧化劑(即，金屬離子及復(fù)合物；例如，四氧化鋨、鉻酸)；機(jī)制未知的試劑，例如，氯-s-迭氮(chloro-s-triazides)、氰尿酰氯、碳二亞胺、二異氰酸酯、二亞胺基酯、焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)(diethyl oxydiformate、ethoxyformic anhydrate)、苦味酸、氯化汞(mercuric chloride)(corrosive sublimate、bichloride of mercury)及汞的其它鹽類、及丙酮。在一實(shí)施例中，使用固定劑組合。這類組合產(chǎn)生所屬技術(shù)領(lǐng)域之技術(shù)人員已知之制劑(formulation)，例如，Carnoy's固定劑、Methacarn氏液、Wolman's溶液、Rossman氏液、Gendre氏液、Bouin液、Zenker氏液、Helly氏液、B5固定劑、Susa液、Elftman氏液、Swank及Davenport氏固定劑、Lillie氏乙醇硝酸鉛及氯化十六烷基吡啶(C.P.C.)。添加劑可包含但不限于，這類全體例如，單寧酸、苯酚、過渡金屬鹽(鋅)、鑭、鋰、鉀。在一實(shí)施例中，固定劑為Methacarn氏液。在另一實(shí)施例中，固定劑為福馬林。在另一實(shí)施例中，固定劑為乙醇。在另一實(shí)施例中，固定劑為甲醇。在另一實(shí)施例中，固定劑為聚乙烯醇。在另一實(shí)施例中，固定劑為甲醛。在另一實(shí)施例中，樣品的固定于活體外(ex vivo)進(jìn)行。

在一些實(shí)施例中，至少一種熒光染料于固定步驟期間添加至樣品中，造成樣品同時(shí)固定及染色。在另一些實(shí)施例中，至少一種熒光染料于脫水步驟期間添加至樣品中，造成樣品同時(shí)脫水及染色。熒光染料的結(jié)合消除了對處理后染色之需要，其為傳統(tǒng)樣品制備之耗時(shí)的步驟。熒光染料可在固定步驟期間直接地加入樣品中。例如，熒光染料可加入固定溶劑中。在另一實(shí)施例中，熒光染料于固定步驟完成后加入至樣品中。在一實(shí)施例中，固定溶液包含固定劑及熒光染料。在另一實(shí)施例中，固定溶液包含至少一脫水劑及至少一種熒光染料。在一實(shí)施例中，熒光染料在脫水步驟期間直接加入地樣品中。在一實(shí)施例中，處理組織樣品之方法包含取得組織樣品，以及使組織樣品與包含至少一種脫水劑及至少一種熒光染料之固定溶液接觸。

所屬技術(shù)領(lǐng)域之技術(shù)人員將理解本發(fā)明預(yù)期與固定步驟相容之任一熒光染料之使用。熒光染料的例子包含但不限于，POPO-1、TOTO-3、TAMRA、BOXTO、BEBO、SYBR DX、SYTOX染料、SYTO染料、Alexa染料、熒光素、羅丹明(rhodamine)、碘化丙啶、赫斯特染料、四甲基羅丹明、R-藻紅蛋白、Cy-3、Cy-5、Cy-7、Texas Red、Phar-Red、別藻藍(lán)蛋白(APC)、熒光素胺、伊紅、丹酰基、傘形酮、5-羧基熒光素(FAM)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基熒光素(JOE)、6羧基羅丹明(R6G)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)、4-(4'-二甲基胺基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)、5-(2'-胺基乙基)胺基萘-1-磺酸(EDANS)、8-苯胺基-1-萘磺酸銨鹽(ANS)、4-乙酰胺基-4'-異硫氰酸芪-2,2'二磺酸、吖啶、異硫氰酸吖啶、吖啶橙(N,N,N',N'-四甲基吖啶-3,6-二胺)、R-胺基-(3-乙烯基磺酰基)苯基萘二甲酰亞胺-3,5-二磺酸鹽(Lucifer Yellow VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)馬來酰亞胺、鄰胺基苯甲酰胺、Brilliant Yellow、香豆素、7-胺基-4-甲基香豆素、7-胺基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)、四氯四溴熒光素(cyanosine)、2-(4-脒基苯基)-1H-吲哚-6-甲脒(DAPI)、5',5”-二溴鄰苯三酚-磺酞(Bromopyrogallol Red)、7-二乙基胺基-3-(4'-異硫氰基苯基)-4-甲基香豆素二乙烯三胺五乙酸酯、4,4'-二異硫氰酸二氫-芪-2,2'-二磺酸、4,4'-二異硫氰酸芪-2,2'-二磺酸、4-二甲基胺基苯基偶氮苯基-4'-異硫氰酸酯(DABITC)、伊紅異硫氰酸酯、赤蘚紅B、赤蘚紅異硫氰酸酯、乙啶、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)胺基熒光素(DTAF)、QFITC(XRITC)、熒光胺IR144、IR1446、Malachite Green異硫氰酸酯、4-甲基傘形酮、鄰甲酚酞、硝基酪胺酸、副玫瑰紅(pararosaniline)、Phenol Red、B-藻紅蛋白、鄰苯二甲醛、芘、芘丁酸酯、琥珀酰亞胺基1-丁酸芘酯、Reactive Red 4(Cibacron.RTM.Brilliant Red 3B-A)、麗絲胺羅丹明B磺酰氯(lissamine rhodamine B sulfonyl chloride)、羅丹明B、羅丹明123、羅丹明X、磺酰羅丹明B、磺酰羅丹明101、磺酰羅丹明101的磺酰氯衍生物、四甲基羅丹明、噻唑橙、核黃素、玫紅酸及鋱螯合衍生物(terbium chelate derivative)。在一實(shí)施例中，熒光染料為伊紅。在另一實(shí)施例中，熒光染料為DAPI。在另一實(shí)施例中，熒光染料為SYTOX綠色。在另一實(shí)施例中，熒光染料為吖啶橙。在另一實(shí)施例中，熒光染料為羅丹明B。在另一實(shí)施例中，熒光染料為SYTO染料。在另一實(shí)施例中，熒光染料為碘化丙啶。在另一實(shí)施例中，熒光染料為赫斯特染料。

在某些實(shí)施例中，熒光染料可選擇地染色特定的細(xì)胞器或細(xì)胞的成分。在一實(shí)施例中，熒光染料為細(xì)胞核染料。細(xì)胞核染料之非限定的例子包含DAPI、SYTOX染料、SYTO染料、碘化丙啶、吖啶橙及赫斯特染料。在一實(shí)施例中，細(xì)胞核染料為DAPI。在另一實(shí)施例中，熒光染料為蛋白質(zhì)染料。蛋白質(zhì)染料的例子包含但不限于，伊紅、羅丹明B(RhB)及ANS。在另一實(shí)施例中，細(xì)胞的內(nèi)部熒光用以成像細(xì)胞蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施例中，熒光是從至少一細(xì)胞核染料及至少一蛋白質(zhì)染料的組合所產(chǎn)生。在另一實(shí)施例中，熒光是從細(xì)胞核染料及內(nèi)部熒光所產(chǎn)生。在一實(shí)施例中，所述至少一蛋白質(zhì)染料為伊紅。

在某些實(shí)施例中，型態(tài)保存劑在固定步驟及/或脫水步驟期間添加至樣品中。在某些實(shí)施例中，型態(tài)保存劑加強(qiáng)細(xì)胞的核結(jié)構(gòu)地維持，使其可在接續(xù)的細(xì)胞學(xué)染色維持細(xì)胞膜完整及/或減少固定或脫水期間之萎縮或腫脹。與固定步驟相容之任一型態(tài)保存劑可于發(fā)明中使用，如同所屬技術(shù)領(lǐng)域之技術(shù)人員可理解的。型態(tài)保存劑之非限定的例子包含乙酸、三氯乙酸、甲醛、二惡烷(dioxane)、氯仿等。在一優(yōu)選實(shí)施例中，型態(tài)保存劑為氯仿。型態(tài)保存劑可于固定步驟期間直接地加入樣品中?；蛘?，型態(tài)保存劑可加入固定溶液中。在一實(shí)施例中，固定溶液包含約0％至約50％的型態(tài)保存劑。在另一實(shí)施例中，固定溶液包含約5％至約15％的型態(tài)保存劑。在另一實(shí)施例中，固定溶液包含約10％的型態(tài)保存劑。在另一實(shí)施例中，固定溶液包含約20％至約40％的型態(tài)保存劑。在一優(yōu)選實(shí)施例中，固定溶液包含約30％的型態(tài)保存劑。

在一些實(shí)施例中，滲透促進(jìn)劑可在固定步驟及/或脫水步驟期間加入樣品中。滲透促進(jìn)劑加速染料進(jìn)入樣品的較深部分，同時(shí)整體改善染色過程。滲透促進(jìn)劑亦可加速固定劑、脫水劑及/或清洗劑的滲透。滲透促進(jìn)劑之非限定的例子包含酸，例如乙酸、包含乙酸的Methacarn氏液、亞砜(sulphoxide)如二甲基亞砜(DMSO)、氮酮、吡咯烷酮、丙二醇、脂肪酸、精油、磷脂質(zhì)、s-可力丁(collidine)及介面活性劑如Tween。在一實(shí)施例中，固定溶液包含約0％至約75％的滲透促進(jìn)劑。在另一實(shí)施例中，固定溶液包含約0％至約25％的滲透促進(jìn)劑。在另一實(shí)施例中，固定溶液包含約5％至約15％的滲透促進(jìn)劑。在一優(yōu)選實(shí)施例中，固定溶液包含約10％的滲透促進(jìn)劑。

在一些實(shí)施例中，滲透促進(jìn)劑為至少一種酸。在一些實(shí)施例中，酸為有機(jī)酸。有機(jī)酸之非限定的例子包含乙酸、冰醋酸、乳酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、檸檬酸、3-羥基丙酸、乙醇酸或甲酸。在一實(shí)施例中，酸為乙酸。乙酸對于提升固定的速度是有用的，其對于快速的樣品處理是重要的，同時(shí)亦顯著改善利用任一種類切片影像形式之經(jīng)清洗的樣品的影像品質(zhì)及深度。乙酸對于溶解紅血球細(xì)胞亦為有用的，使血紅素得以移除，血紅素對顯著地阻礙樣品的清洗，由于其在常規(guī)熒光成像的典型可作用波長范圍中之寬的光吸收特性。在一實(shí)施例中，固定樣品的步驟更包含添加細(xì)胞溶解劑(lysing agent)于樣品中。在特定實(shí)施例中，固定樣品的步驟更包含添加紅血球細(xì)胞溶解劑于樣品中。在另一實(shí)施例中，脫水樣品的步驟更包含添加細(xì)胞溶解劑于樣品中。在另一實(shí)施例中，固定溶液更包含紅血球細(xì)胞溶解劑。在一優(yōu)選實(shí)施例中，紅血球細(xì)胞溶解劑為乙酸。在另一些實(shí)施例中，酸為無機(jī)酸。所述溶液更包含至少一有機(jī)溶劑。有機(jī)溶劑之非限定的例子包含甲醇、無水甲醇、氯仿、二氯甲烷、乙醇、異丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、己烷、己烯、辛烷、戊烷、環(huán)己烷、異辛烷、二甲苯(鄰、間或?qū)?以及1-己烯。在一實(shí)施例中，有機(jī)溶劑為無水甲醇。甲醇對于組織處理是有用的，其藉由防止酶作用及分解同時(shí)最大限度地保存基因及蛋白質(zhì)體資訊。在另一實(shí)施例中，有機(jī)溶劑為氯仿。在一實(shí)施例中，所述溶液包含兩種有機(jī)溶劑及酸。作為非限定之實(shí)施例，固定溶液包含約60％的無水甲醇、約30％的氯仿及約10％的冰醋酸，其亦已知為Methacarn氏液。當(dāng)與熒光染料及清洗組合時(shí)，Methacarn氏液對于組織學(xué)評估之人類樣品的深度熒光組織切片，以及對于產(chǎn)生精確組織學(xué)評估所需之對比度為有用的。

固定步驟可在可提升快速組織處理的任一條件下實(shí)行，例如增加化學(xué)反應(yīng)及擴(kuò)散的速率之條件，如同所屬技術(shù)領(lǐng)域之技術(shù)人員可理解的。在一些實(shí)施例中，固定步驟于高溫下實(shí)行。如本文所使用，術(shù)語“高溫(elevated temperature)”代表高于地球大氣中感受之溫度，優(yōu)選為高于30℃。在一實(shí)施例中，高溫在約20℃至約75℃的范圍。在另一實(shí)施例中，高溫在約35℃至約50℃的范圍。在另一實(shí)施例中，高溫范圍為約45℃。在一非限定的例子中，為了加速擴(kuò)散、化學(xué)反應(yīng)或溫度，固定、脫水及/或染色在微波照射下實(shí)行。

固定步驟可實(shí)行任一合適的時(shí)間長度。時(shí)間的長度通?？蔀檫m于保存樣品之任一合適的時(shí)間長度。在某些實(shí)施例中，時(shí)間的期間可為約1分鐘、約5分鐘、約10分鐘、約15分鐘、約30分鐘、約1小時(shí)、約2小時(shí)、約3小時(shí)、約4小時(shí)、約5小時(shí)、約6小時(shí)、約12小時(shí)、或約24小時(shí)。在一實(shí)施例中，固定步驟實(shí)行約1小時(shí)的期間。在另一實(shí)施例中，脫水步驟實(shí)行約12至16小時(shí)的期間。在另一實(shí)施例中，固定步驟在約數(shù)周至數(shù)年的過程中實(shí)行。

在一實(shí)施例中，本發(fā)明之方法包含同時(shí)固定、脫水及使樣品接觸包含至少一種脫水劑及至少一種熒光染料之脫水溶液以染色樣品之步驟。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明之方法包含同時(shí)脫水及使樣品接觸包含至少一種脫水劑及至少一種熒光染料之脫水溶液以染色樣品之步驟。

在另一態(tài)樣中，本發(fā)明之方法更包含清洗樣品之步驟。清洗樣品提供樣品影像增加的深度及清晰度。在一實(shí)施例中，清洗步驟在沒有固定步驟下實(shí)行。在一些實(shí)施例中，所述步驟包含使樣品與清洗溶液接觸以清洗樣品之步驟。作為非限定之實(shí)施例，樣品之清洗是以折射系數(shù)高于水的清洗溶液取代水，其更接近于蛋白質(zhì)及細(xì)胞器的折射系數(shù)，因而劇烈地減少光散射，并使成像之深度可在毫米而非微米。在一實(shí)施例中，清洗溶液包含至少一溶劑?？墒褂萌我蝗軇┯谇逑慈芤褐?，只要清洗溶液的整體折射系數(shù)高于水的折射系數(shù)，且溶劑不破壞樣品的細(xì)胞成分型態(tài)。在一實(shí)施例中，清洗溶液的折射系數(shù)在約1.4至約1.6之范圍。在另一實(shí)施例中，清洗溶液的折射系數(shù)在約1.33至約1.49之范圍。在另一實(shí)施例中，清洗溶液的折射系數(shù)約大于1.4。在另一實(shí)施例中，清洗溶液的折射系數(shù)約大于1.5。在一實(shí)施例中，清洗溶液更包含與水混溶且具有高折射系數(shù)之試劑。

在一些實(shí)施例中，所述溶劑為有機(jī)溶劑。有機(jī)溶劑之非限定的例子可作為清洗溶劑，包含苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、二甲苯、檸檬烯、苯、甲苯、氯仿、石油醚、二硫化碳、四氯化碳、二惡烷、甘油、糖溶液、二苯甲基醚、丁香油及雪松油。在一實(shí)施例中，溶劑為苯甲醇。在另一實(shí)施例中，溶劑為苯甲酸苯甲酯。在另一實(shí)施例中，溶劑為二甲苯。在另一實(shí)施例中，溶劑為甘油。在另一實(shí)施例中，溶劑為糖溶液。在另一實(shí)施例中，溶劑為二苯甲基醚。在另一實(shí)施例中，溶劑為已烷。

在一些實(shí)施例中，清洗溶液包含第一溶劑及第二溶劑。在一實(shí)施例中，第一溶劑及第二溶劑的比例在約100:1至約1:100的范圍。在另一實(shí)施例中，第一溶劑及第二溶劑的比例在約10:1至約1:10的范圍。在另一實(shí)施例中，第一溶劑及第二溶劑的比例在約5:1至約1:5的范圍。在一較佳實(shí)施例中，第一溶劑及第二溶劑的比例約為1:2。在一些實(shí)施例中，溶劑為有機(jī)溶劑。在一特定實(shí)施例中，清洗溶液包含苯甲醇及苯甲酸苯甲酯。在一實(shí)施例中，苯甲醇及苯甲酸苯甲酯的比例約為1:2。

清洗步驟可在可提升樣品的快速清洗之任一條件下實(shí)行，如同所屬技術(shù)領(lǐng)域之技術(shù)人員可理解的。在一些實(shí)施例中，清洗步驟于高溫下實(shí)行。在一實(shí)施例中，高溫在約20℃至約75℃的范圍。在另一實(shí)施例中，高溫在約35℃至約50℃的范圍。在另一實(shí)施例中，溫度約為22℃。

清洗步驟可實(shí)行任一合適之時(shí)間長度。時(shí)間的長度通?？蔀檫m于達(dá)成充分降低光散射得以在樣品中所欲深度進(jìn)行成像之任一合適的時(shí)間長度。在某些實(shí)施例中，時(shí)間的期間可為約1分鐘、約5分鐘、約10分鐘、約15分鐘、約30分鐘、約1小時(shí)、約2小時(shí)、約3小時(shí)、約4小時(shí)、約5小時(shí)、約6小時(shí)、約12小時(shí)、或約24小時(shí)。在一實(shí)施例中，清洗步驟實(shí)行約2分鐘至約1小時(shí)。在一實(shí)施例中，清洗步驟實(shí)行約2分鐘。在一實(shí)施例中，清洗步驟實(shí)行約30分鐘。在一實(shí)施例中，清洗步驟實(shí)行約12小時(shí)。

在一實(shí)施例中，清洗步驟更包含于添加清洗溶液之前添加溶劑至樣品的步驟。在一些實(shí)施例中，所述溶劑為有機(jī)溶劑。在一實(shí)施例中，溶劑為醇。醇對于脫水樣品是有用的。醇之非限定的例子包含甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、乙基丁醇、叔丁醇、二惡烷、乙二醇、丙酮及戊醇。在一較佳實(shí)施例中，溶劑為甲醇。在一實(shí)施例中，溶劑與滲透促進(jìn)劑一起添加。滲透促進(jìn)劑之非限定的例子包含乙酸、聚乙二醇(PEG)、單-及二亞甲基乙二醇(dimethyleneglycol)、丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)等，介面活性劑如二甲基亞砜(DMSO)、聚氧乙烯脫水山梨醇酯(例如，TWEEN如TWEEN 80)、二甲基磺基琥珀酸鈉、溫和的家用洗滌劑等。在一實(shí)施例中，滲透促進(jìn)劑選自乙酸、DMSO及TWEEN所組成之群組。溶劑與滲透促進(jìn)劑的組合添加藉由改善互溶性及滲透性增加以BABB清洗之速率，且亦消除逐漸降低醇濃度之梯度濃度的需求。

部分地，本發(fā)明提供快速地處理組織樣品之方法。時(shí)間的長度通常可為適于固定樣品及清洗樣品之任一合適的時(shí)間長度。時(shí)間的長度通常也可為適于固定一部分的樣品及清洗一部分的樣品之任一合適的時(shí)間長度。在某些實(shí)施例中，時(shí)間的期間可為約1分鐘、約5分鐘、約10分鐘、約15分鐘、約30分鐘、約1小時(shí)、約2小時(shí)、約3小時(shí)、約4小時(shí)、約5小時(shí)或約6小時(shí)。在一實(shí)施例中，固定樣品及清洗樣品之步驟實(shí)行約1小時(shí)至約2小時(shí)。在一實(shí)施例中，固定樣品及清洗樣品之步驟在約1.5小時(shí)的期間內(nèi)實(shí)行。

在另一態(tài)樣中，本發(fā)明之方法更包含成像樣品之步驟。在一實(shí)施例中，成像樣品之步驟更包含產(chǎn)生組織樣品之視覺影像。樣品可利用與本文所述之樣品處理方法相容之任一成像方法進(jìn)行成像。優(yōu)選之成像方法包含以熒光為基礎(chǔ)的切片成像方法。相較于破壞性3-D組織學(xué)方式如著色塑料包埋系統(tǒng)及整體載玻片成像(whole slide imaging(WSI))，這些以熒光為基礎(chǔ)的方法為非破壞性的，使得樣品得以保存用于輔助研究如免疫染色及分子研究。以熒光為基礎(chǔ)的切片成像方法之例子包含但不限于，多光子顯微鏡(MPM)、側(cè)平面照明顯微鏡、傳統(tǒng)共軛焦顯微鏡、轉(zhuǎn)盤式共軛焦顯微鏡、結(jié)構(gòu)照明顯微鏡等。于動(dòng)物組織中(Parra等人，2010,J.Biomed.Opt.15:036017-036017-5；Vesuna等人，2011,J.Biomed.Opt.16:106009-106009-6；Fu等人，2009,Gastroenterology 137:453-465)，藉由結(jié)合MPM及光學(xué)清洗，成像的深度可增加以超過使用較傳統(tǒng)方法，如福馬林固定，制備之樣品。在一實(shí)施例中，樣品是利用多光子顯微鏡(MPM)成像。在另一實(shí)施例中，樣品是利用共軛焦顯微鏡成像。在另一實(shí)施例中，樣品是利用結(jié)構(gòu)照明顯微鏡成像。在另一實(shí)施例中，樣品是利用選擇性平面照明顯微鏡成像。在另一實(shí)施例中，樣品是利用反褶積顯微鏡(deconvolution microscopy)成像。在另一實(shí)施例中，樣品是利用超解析顯微鏡成像。在另一實(shí)施例中，樣品是利用側(cè)平面照明顯微鏡成像。在另一實(shí)施例中，樣品是利用轉(zhuǎn)盤式共軛焦顯微鏡成像。在一實(shí)施例中，成像組織樣品的方法包含取得組織樣品，將組織樣品與包含至少一熒光染料之固定溶液接觸，將組織樣品與清洗溶液接觸，以及藉由測量組織樣品的熒光的強(qiáng)度值以產(chǎn)生組織樣品影像，以及將強(qiáng)度值轉(zhuǎn)換為有效光學(xué)密度，使光學(xué)密度重建產(chǎn)生的組織樣品影像中之染色的色彩之步驟。

本發(fā)明之成像方法提供用于成像分析的方法，其允許與傳統(tǒng)組織學(xué)染色實(shí)質(zhì)上沒有區(qū)別之影像的重現(xiàn)。在一實(shí)施例中，所述方法涉及多通道方法，其中來自樣品的熒光之強(qiáng)度值利用指數(shù)偽著色制程被轉(zhuǎn)換成光學(xué)密度，指數(shù)偽著色制程為對數(shù)偽著色制程(logarithmic pseudo-coloring process)的反演，其中熒光的強(qiáng)度值被轉(zhuǎn)換為紅色、綠色及藍(lán)色通道之光學(xué)密度。在一實(shí)施例中，成像樣品的步驟更包含測量樣品的熒光強(qiáng)度值，以及將強(qiáng)度值轉(zhuǎn)換為有效光學(xué)密度以重現(xiàn)樣品影像中的染色之色彩之步驟。在一實(shí)施例中，一或多個(gè)熒光通道的強(qiáng)度值被轉(zhuǎn)換為一或多個(gè)偽著色顯示通道中的有效光學(xué)密度，其是利用指數(shù)偽著色制程，其中產(chǎn)生光學(xué)密度之公式包含對來自熒光的強(qiáng)度值的功率之常數(shù)，如同所屬技術(shù)領(lǐng)域之技術(shù)人員可理解的。以數(shù)字表示地：

Ch1＝C₁^(a₁N+b₁P)

Ch2＝C₂^(a₂N+b₂P)

Ch3＝C₃^(a₃N+b₃P)

其中Ch1、Ch2、Ch3為色彩顯示通道，如紅色、綠色及藍(lán)色；C₁、C₂、C₃為正常數(shù)；a₁、a₂、a₃、b₁、b₂、b₃為可能為正或負(fù)的常數(shù)；以及N及P為記錄自不同熒光通道之熒光強(qiáng)度。在一實(shí)施例中，強(qiáng)度值是利用指數(shù)偽著色制程轉(zhuǎn)換為有效光密度。

對數(shù)偽著色反褶積制程(logarithmic color deconvolution process)之例子，請參照Ruifrok and Johnston,2001,Anal.Quant.Cytol.Histol.23:291-299，其于此通過引用整體并入本文中。

在一實(shí)施例中，熒光為來自樣品的內(nèi)部(intrinsic)熒光。在另一實(shí)施例中，熒光為來自熒光染料的熒光。在一實(shí)施例中，熒光染料為細(xì)胞核染料。在另一實(shí)施例中，熒光染料為蛋白質(zhì)染料。使用的通道數(shù)量可依需要達(dá)成之所欲影像而改變，如同所屬技術(shù)領(lǐng)域之技術(shù)人員可理解的。在一實(shí)施例中，通道的數(shù)量為兩個(gè)通道。在一特定的實(shí)施例中，兩個(gè)通道為內(nèi)部熒光通道及熒光核酸染料通道。在另一實(shí)施例中，兩個(gè)通道為熒光核酸染料通道及熒光蛋白質(zhì)染料通道。在一非限定的例子中，內(nèi)部熒光，主要由交聯(lián)的蛋白質(zhì)發(fā)出且對應(yīng)通?？山逵傻鞍踪|(zhì)染色如伊紅而達(dá)成之染色，可通過使用福馬林作為固定劑來加強(qiáng)，其為促進(jìn)正常色彩重現(xiàn)的特征，是藉由改善此通道的訊號雜訊比(signal to noise)并促進(jìn)與核酸熒光之分離。

本發(fā)明之成像方法亦提供模擬常見病理學(xué)染色的樣品影像，產(chǎn)生精確且有效之影像解讀。利用本發(fā)明之方法可重現(xiàn)之病理學(xué)染色的例子包含但不限于，蘇木精、伊紅、瑞特(wright)、吉姆薩(giemsa)、Masson's trichrome、Jones、三色(trichrome)、過碘酸希夫(periodic acid Schiff(PAS))及網(wǎng)狀蛋白染色。病理學(xué)染色的組合亦可利用本發(fā)明之方法進(jìn)行重現(xiàn)。在一實(shí)施例中，病理學(xué)染色的組合為蘇木精及伊紅(H&E)。在另一實(shí)施例中，病理學(xué)染色的組合為瑞特及吉姆薩。

在一些實(shí)施例中，成像樣品的步驟與額外的成像方法一起實(shí)行，造成多模態(tài)成像(multi-modal imaging)。在一實(shí)施例中，額外的成像方法為高次諧波產(chǎn)生(higher-order harmonic generation)。高次諧波產(chǎn)生允許額外的專業(yè)組織學(xué)染色之重現(xiàn)，例如，膠原染色如三色染色及銀染如Jones染色。在一實(shí)施例中，高次諧波產(chǎn)生為二次諧波產(chǎn)生(SHG)。SHG產(chǎn)生自不對稱重復(fù)蛋白質(zhì)如膠原之多光子激發(fā)，且與成像方法組合，例如MPM，可使用于膠原纖維化及類淀粉蛋白(amyloid)的簡易辨識及定量。在一實(shí)施例中，額外的成像方法為熒光壽命成像(Fluorescence Lifetime Imaging)。熒光壽命成像可藉由區(qū)分具有不同生命周期特性之熒光團(tuán)，用于提供MPM額外的對比度。在另一實(shí)施例中，額外的成像方法使用多種熒光抗體。多種熒光抗體可用于提供實(shí)行免疫組織化學(xué)的潛力，于在相同細(xì)胞上具有可偵測之多種抗原的未切割樣品中。在另一實(shí)施例中，成像方法與二極體激光一起使用。請參照Dechet等人，2003,J.Urol.169:71-74及Durfee等人，2012,Opt.Express 20:13677-13683，其各自于此通過引用整體并入本文中。所屬技術(shù)領(lǐng)域中已知用于增加樣品成像的掃描速率之其它技術(shù)亦可使用于成像步驟中，如同所屬技術(shù)領(lǐng)域之技術(shù)人員可理解的。非限定的例子包含多光束掃描系統(tǒng)、時(shí)間多工(spatiotemporal multiplexing)、時(shí)域聚焦(temporal focusing)。請參照Bewersdorf等人，1998,Opt.Lett.23:655-657、Amir等人，2007,Opt.Lett.32-1731-1733、Oron等人，2005,Opt.Express 13:1468-1476以及Zhu等人，2005,Opt.Express 13:2153-2159，其各自于此通過引用整體并入本文中。在另一實(shí)施例中，成像步驟利用視頻成像即時(shí)實(shí)行。

本發(fā)明之方法提供與較傳統(tǒng)的組織學(xué)方法(例如樣品僅以福馬林固定處理)相比下較深的樣品深度所取得之樣品的清楚、高品質(zhì)影像。在一實(shí)施例中，樣品影像在約100nm至約2cm的樣品深度下取得。在另一實(shí)施例中，樣品影像在約100nm至約500μm的樣品深度下取得。在另一實(shí)施例中，樣品影像在約100nm至約1cm的樣品深度下取得。在另一實(shí)施例中，樣品影像在約50μm至約500μm的樣品深度下取得。在另一實(shí)施例中，樣品影像在約100nm至約100μm的樣品深度下取得。在另一實(shí)施例中，樣品影像在約200μm的樣品深度下取得。在另一實(shí)施例中，樣品影像在約100μm的樣品深度下取得。

在一實(shí)施例中，樣品的成像提供數(shù)位樣品數(shù)據(jù)。此數(shù)位數(shù)據(jù)接著可被儲(chǔ)存以供后續(xù)分配，例如咨詢及健康紀(jì)錄，因而改善用于進(jìn)一步評估或再評估之影像的可得性。此外，數(shù)位樣品數(shù)據(jù)能夠保持?jǐn)?shù)據(jù)的完整性，與可能遺失或損壞且無法數(shù)位儲(chǔ)存之實(shí)體樣品相反。

在一實(shí)施例中，樣品影像為三維(3-D)樣品影像。3-D影像可利用所屬技術(shù)領(lǐng)域中任一已知方法產(chǎn)生，所屬技術(shù)領(lǐng)域之技術(shù)人員可理解的。在一實(shí)施例中，3-D樣品影像從整個(gè)活檢產(chǎn)生。在另一實(shí)施例中，從整個(gè)活檢產(chǎn)生之3-D樣品影像提供用于診斷疾病的定量方式。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明之3-D樣品影像提供于成像樣品中細(xì)微形態(tài)之簡易辨識。例如，3-D樣品影像改善于多種情況下發(fā)現(xiàn)之纖維化之定量及定性分析，例如，肝硬化、高血壓性腎病、間質(zhì)性肺病及卵巢癌，超過所屬技術(shù)領(lǐng)域目前已知之其它二維(2-D)組織學(xué)方法。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明之3-D樣品影像被用于診斷惡性生長(malignant growth)。在一實(shí)施例中，本發(fā)明之方法提供3-D樣品影像的全旋轉(zhuǎn)控制。惡性生長的診斷通常依賴目測生長模式，特別是于以腺體為基礎(chǔ)之失調(diào)，例如，前列腺癌及乳癌。此種分析主要以二維方向?yàn)榛A(chǔ)，其可能需要病理學(xué)家反復(fù)觀測連續(xù)的(期望地)切片以供診斷。在這些2D方法中，目視檢查可能因樣品的粗劣包埋及不同方向而更加復(fù)雜化。在非限定的例子中，本發(fā)明之3-D樣品影像用于診斷肝轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌以及用于子宮內(nèi)膜異常之診斷。在另一非限定的例子中，來自經(jīng)清洗組織之MPM成像的3-D重建可使用于完整活檢尺寸的組織樣本上且亦可用于產(chǎn)生膠原纖維化之可定量的特征。3-D樣品影像之其它非限定的例子包含辨識腺體細(xì)胞生長中低級的異常，如具有前列腺及乳房的贅瘤形成(neoplasia)，評估腫瘤入侵的深度，如判斷膀胱活檢中肌肉入侵的深度，以及較完整的纖維化定量評估，在腎臟和肝臟活檢中特別重要。

樣本夾持裝置

在另一態(tài)樣中，發(fā)明是關(guān)于樣本夾持裝置。所述裝置是用于夾持組織學(xué)樣品以及利于組織學(xué)樣品之處理及成像。在一實(shí)施例中，裝置適于本文其它地方所述之本發(fā)明方法的使用。

現(xiàn)在請參照第1圖，描述示例性樣本夾持裝置10。樣本夾持裝置10包含第一平板12及第二平板18。第一平板12包含窗口14、可壓縮材料16及耳片(tab)20。第二平板18包含窗口14及插槽(slot)22。

第一平板12及第二平板18可包含任一合適的材料。例如，第一平板12及第二平板18包含實(shí)質(zhì)上堅(jiān)硬的材料，如玻璃、金屬塑料等。第一平板12及第二平板18可包含任一合適的尺寸。在一實(shí)施例中，第一平板12及第二平板18包含相同長度11及寬度13。在一實(shí)施例中，第一平板12及第二平板18的尺寸經(jīng)設(shè)計(jì)，使它們配合任一顯微鏡載物臺。例如，在一實(shí)施例中，長度11可在40mm及100mm之間。在另一實(shí)施例中，寬度13可在20mm及80mm之間。在一實(shí)施例中，長度11為75mm且寬度13為25mm。

樣本夾持裝置10包含用于夾持及觀察樣本之窗口14。窗口14可包含任一合適的材料。例如，窗口14可包含透明材料，如玻璃或透明塑料。在某些實(shí)施例中，窗口14可包實(shí)質(zhì)上堅(jiān)固之任一其它材料，如金屬或不透明塑料。在一實(shí)施例中，第一平板12及第二平板18均包含透明窗口14。在另一實(shí)施例中，僅第一平板12包含透明窗口14。在又一實(shí)施例中，僅第二平板18包含透明窗口14。

第一平板12包含可壓縮材料16?？蓧嚎s材料16放置于第一平板12頂部。在一實(shí)施例中，可壓縮材料16粘合或以其它方式固定于第一平板12。在一實(shí)施例中，可壓縮材料16之尺寸經(jīng)設(shè)計(jì)使其形成周邊(perimeter)。例如，可壓縮材料16可形成窗口14的形狀的周邊。在另一實(shí)施例中，可壓縮材料16之尺寸經(jīng)設(shè)計(jì)使其為固體塊(solid block)。例如，可壓縮材料16可為具有窗口14的形狀之固體塊?？蓧嚎s材料16可包含任一合適的材料，包含但不限于：泡沫、橡膠、海綿、聚合物、軟木塞等。在一實(shí)施例中，可壓縮材料16包含間隙或縫隙(slit)，使液體能夠通過它。在另一實(shí)施例中，可壓縮材料16包含多孔材料，使液體能夠通過它。多孔材料之非限定的例子包含但不限于：固體泡沫、海綿、塑料網(wǎng)狀物等。多孔材料之孔洞尺寸可被選擇以控制液體傳輸?shù)乃俾?。例如，孔洞尺寸直徑可?0μm及1mm之間。

第一平板12包含藉由一機(jī)構(gòu)以夾持其與第二平板18距離一固定距離。在一實(shí)施例中，所述機(jī)構(gòu)包括耳片(tab)及相應(yīng)的插槽(reciprocal slot)。例如，第一平板12可包含至少兩個(gè)耳片20，且第二平板18可包含至少兩個(gè)插槽22。在另一實(shí)施例中，第一平板12可包含至少兩個(gè)插槽，且第二平板18可包含至少兩個(gè)耳片。在一實(shí)施例中，耳片20的數(shù)量與插槽22的數(shù)量相符。耳片20之尺寸經(jīng)設(shè)計(jì)使它們可裝配于插槽22內(nèi)。在一實(shí)施例中，耳片20包含鋸齒(teeth)24，使當(dāng)耳片20與插槽22接合(engage)時(shí)，鋸齒24可提供摩擦阻力以固定耳片20于插槽22內(nèi)。在又一實(shí)施例中，鋸齒24提供摩擦阻力以可逆地固定耳片20于插槽22內(nèi)。

使用樣本夾持裝置之方法

在另一態(tài)樣中，發(fā)明關(guān)于牢固地夾持樣本用于樣品處理之方法。發(fā)明亦關(guān)于牢固地夾持樣本用于成像之方法。

在一實(shí)施例中，所述方法使用樣本夾持裝置10以牢固地夾持樣本于樣品處理。在一實(shí)施例中，樣本可放置于第一平板12的窗口14上，使樣本被包含可壓縮材料16的周邊圍繞。第二平板18藉由接合耳片20至插槽22而固定于插槽22，使可壓縮材料16完全地接觸第二平板18。在一實(shí)施例中，當(dāng)?shù)谝黄桨?2及第二平板18固定在一起時(shí)，樣品不會(huì)壓靠在任一表面上?？蓧嚎s材料16包含多孔材料使液體可在樣品處理期間進(jìn)出樣本夾持裝置。例如，樣本夾持裝置可全地浸入樣品處理液體中以培養(yǎng)樣本于液體中。

在另一實(shí)施例中，樣本放置于第一平板12(未繪示)上的可壓縮材料之固體塊上。第二平板18藉由接合耳片20至插槽22而固定于第一平板12，使可壓縮材料的固體塊壓靠在第二平板18上?？蓧嚎s材料的固體塊包含多孔材料使液體可在樣品處理期間貫穿塊傳輸，使液體與樣本接觸。例如，樣本夾持裝置可全地浸入樣品處理液體中以培養(yǎng)樣本于液體中。

在一實(shí)施例中，所述方法使用樣本夾持裝置10以牢固地夾持樣本用于成像。樣本放置于第一平板12的窗口14上，使樣本被包含可壓縮材料16的周邊圍繞。第二平板18藉由接合耳片20至插槽22而固定于第一平板12。第二平板18可降低于樣本上，使樣本被壓靠于第一平板12及第二平板18的窗口14上。由于被壓靠在兩個(gè)窗口14上，樣本因而被固定。樣本夾持裝置10接著可放置于任一合適的成像系統(tǒng)上，且樣本可以通過窗口14中的至少一個(gè)成像。

在另一實(shí)施例中，樣本放置于于第一平板12(未繪示)上的可壓縮材料16之固體塊上。第二平板18藉由接合耳片20至插槽22而固定于第一平板12。第二平板18可降低于樣本上，使樣本被壓靠于第一平板12上的可壓縮材料16之固體塊及第二平板18的窗口14上，因此固定樣本。樣本夾持裝置10接著可放置于任一合適的成像系統(tǒng)上，且樣本可以通過窗口14中的至少一個(gè)成像。

顯微鏡系統(tǒng)

在另一態(tài)樣中，本發(fā)明關(guān)于用于樣本的2-D及3-D成像之顯微鏡系統(tǒng)。在一實(shí)施例中，顯微鏡系統(tǒng)適于本文其它地方所述之本發(fā)明方法的使用。

現(xiàn)在請參照第17圖，描述示例性顯微鏡系統(tǒng)30。顯微鏡系統(tǒng)包含激光32、光束整型器34、旋轉(zhuǎn)多邊形36、掃描透鏡38、管透鏡40、顯微鏡物鏡41、分光鏡A 42、分光鏡B 44、復(fù)數(shù)個(gè)發(fā)射濾光片46、負(fù)數(shù)個(gè)偵測器48及雙軸精密微調(diào)移動(dòng)平臺(translation stage)50。顯微鏡系統(tǒng)30可更包含通常用于其它類似顯微鏡系統(tǒng)中的任一元件，如取景器、電源、鏡臺操縱機(jī)構(gòu)、自動(dòng)聚焦機(jī)構(gòu)、自動(dòng)化系統(tǒng)等。

激光32包含激光源，其提供例如用于樣本標(biāo)記之染料的多光子激發(fā)。激光32可包含任一合適的激光，如飛秒或皮秒脈沖光纖激光，或具有可調(diào)為染料之最佳激發(fā)的中心波長之任一其它短脈沖激光。或者，中心波長可為不可調(diào)的(non-tunable)，但可對應(yīng)適于激發(fā)用于染色樣品之波長進(jìn)行選擇。在一實(shí)施例中，中心波長為800nm。

由激光32發(fā)射的激光光束通過光束整型器34。在一實(shí)施例中，光束整型器34擴(kuò)大激光光束至照明顯微鏡物鏡41之后孔徑所需的寬度。在另一實(shí)施例中，光束整型器34可改變激光光束的輪廓，或例如，具有高斯光束輪廓(Gaussian beam profile)之激光光束在通過光束整型器34后可改變以具有平頂輪廓，其造成顯微鏡物鏡41之后孔徑的較有效照明。

通過光束整型器34的激光光束藉由具有復(fù)數(shù)個(gè)鏡面之旋轉(zhuǎn)多邊形36快速地掃描角度。在許多實(shí)施例中，藉由通?？捎糜诳焖俟馐鴴呙柚?dāng)?shù)種共振掃描機(jī)構(gòu)的任一種可快速地掃描光束角度。用于快速光束掃描之共振掃描機(jī)構(gòu)之非限定的例子包含共振檢流計(jì)和數(shù)位微鏡裝置。

快速掃描的激光光束利用掃描透鏡38及管透鏡40成像于顯微鏡物鏡41的后孔徑。在一實(shí)施例中，掃描透鏡38為遠(yuǎn)心透鏡。在一實(shí)施例中，掃描透鏡38為F-theta透鏡。在許多實(shí)施例中，掃描透鏡38可為任一合適的透鏡，當(dāng)與管透鏡40結(jié)合使用時(shí)其成像從旋轉(zhuǎn)多邊形36的表面至顯微鏡物鏡41的后孔徑之角度掃描光束。

在一實(shí)施例中，顯微鏡系統(tǒng)30包含分光鏡A 42，使得物鏡收集的熒光可藉由分光鏡A反射，以由一或多個(gè)偵測器48收集?；蛘?，光束路徑可經(jīng)選擇使得分光鏡A用于將激發(fā)激光光束反射至顯微鏡物鏡的后孔徑，以傳輸收集之熒光至偵測器48。在一實(shí)施例中，熒光或SHG可被收集作為透射光，在具有或不具有收集透鏡(未繪示)及偵測器48的狀況下。偵測器48可為對適當(dāng)波長敏感之任一偵測器。例如，在一實(shí)施例中，偵測器48可包含光電倍增管。顯微鏡系統(tǒng)30可進(jìn)一步包含分光鏡B 44或向不同的偵測器48發(fā)送不同顏色的熒光所需之任意數(shù)量之額外的分光鏡。在一實(shí)施例中，顯微鏡系統(tǒng)30可視需要更包含任意數(shù)量之發(fā)射濾光片46，其中放置于偵測器48前面的發(fā)射濾光器46抑制雜散激光光及其它光干擾。

在許多實(shí)施例中，顯微鏡系統(tǒng)30包含至少一顯微鏡物鏡41。在一實(shí)施例中，顯微鏡物鏡41與高折射系數(shù)浸入介質(zhì)相容。在許多實(shí)施例中，顯微鏡物鏡41與具有1.45至1.6之間之系數(shù)的高折射系數(shù)浸入介質(zhì)相容。在一實(shí)施例中，顯微鏡物鏡41與具有1.54之系數(shù)的高折射系數(shù)浸入介質(zhì)相容。在一實(shí)施例中，顯微鏡物鏡41與浸入介質(zhì)相容，其為如文中其它地方所述之BABB清洗劑。在一實(shí)施例中，具有反轉(zhuǎn)的顯微鏡排列之顯微鏡系統(tǒng)30包含顯微鏡物鏡41，其于面向樣品的一側(cè)上具有相對寬且平坦的外觀，使浸入流體可容易地保持在顯微鏡物鏡41及樣品盒10之間。

在一實(shí)施例中，顯微鏡物鏡41包含用于具有短的景深(depth-of-field)的高質(zhì)量光學(xué)軸向切片之?dāng)?shù)值孔徑。在一實(shí)施例中，數(shù)值孔徑至少為0.8。在另一實(shí)施例中，數(shù)值孔徑至少為1.0。

在一實(shí)施例中，顯微鏡物鏡41包含用于成像樣品的大視野。在一實(shí)施例中，顯微鏡物鏡41具有為20x的視野。在另一實(shí)施例中，顯微鏡物鏡41具有大于20x的視野。

樣品可放置于用于成像之雙軸精密微調(diào)移動(dòng)平臺50上。雙軸精密微調(diào)移動(dòng)平臺50相對于顯微鏡物鏡41的位置可調(diào)整至任一位置以成像樣品的不同區(qū)域以及調(diào)整焦距。例如，在許多實(shí)施例中，雙軸精密微調(diào)移動(dòng)平臺50可調(diào)整使得顯微鏡物鏡41及樣品之間的工作距離在100μm及2mm之間。在一實(shí)施例中，工作距離可調(diào)整為至少100μm以達(dá)到有效深度，使得完整的光學(xué)切片可從表面不規(guī)則之具有顯著峰及谷的樣品中取得。

使用顯微鏡系統(tǒng)之方法

在另一態(tài)樣中，發(fā)明關(guān)于利用本發(fā)明之顯微鏡系統(tǒng)成像樣品之方法。所述方法使激光光束通過顯微鏡系統(tǒng)30，使得顯微鏡物鏡41聚焦激光光束于放置在雙軸精密微調(diào)移動(dòng)平臺50上的樣品之單一點(diǎn)上。在一些實(shí)施例中，旋轉(zhuǎn)多邊形36使激光光束快速地掃描穿過樣品的路線。在另一些實(shí)施例中，共振檢流計(jì)引導(dǎo)激光光束快速地掃描穿過樣品的路線。

在一實(shí)施例中，激光光束快速地掃描穿過樣品以階梯線性方式(光柵掃描)，使得連續(xù)掃描產(chǎn)生矩形的2-D影像。在又一實(shí)施例中，在2-D影像取得后，雙軸精密微調(diào)移動(dòng)平臺可沿著成像平面移動(dòng)，使得第二矩形2-D影像可藉由快速地掃描激光光束以階梯線性方式穿過樣品而取得。雙軸精密微調(diào)移動(dòng)平臺可沿著成像平面移動(dòng)于進(jìn)一步增加的步驟中，使得復(fù)數(shù)個(gè)矩形2-D影像可被取得，直到在給定成像平面之樣本的整個(gè)剖面已被測定(interrogated)。復(fù)數(shù)個(gè)矩形2-D影像利用所屬技術(shù)領(lǐng)域已知的任一方法結(jié)合在一起，例如，以顯微鏡軟體產(chǎn)生樣品的完整剖面影像。在一實(shí)施例中，具有部分重迭的2-D影像有助于樣品剖面的自動(dòng)集合。

在又一些實(shí)施例中，樣本可相對于物鏡41軸向調(diào)動(dòng)，使得于給定成像平面取得2-D影像的方法可被重復(fù)，呈現(xiàn)樣品之不同剖面的影像。在一實(shí)施例中，取得連續(xù)的矩形2-D影像剖面，直到樣品的完整體積已被測定。

發(fā)明之套組

發(fā)明包含套組，其包含發(fā)明之方法內(nèi)有用之成分以及操作指南材料，其描述例如，如本文其它地方所述之處理組織樣品的方法。所述套組可包含實(shí)行發(fā)明方法有用之試劑。例如，套組包含試劑如固定劑、染料及清洗溶液。套組可更包含實(shí)行發(fā)明方法有用之裝置。例如，套組可包含發(fā)明之樣本夾持裝置及顯微鏡系統(tǒng)，如本文其它地方所述。

在一實(shí)施例中，試劑以濃縮形式被提供，使得套組的重量及尺寸可降低且溶液僅需稀釋即可使用。在另一實(shí)施例中，套組更包含(優(yōu)選為無菌的)凍干形式之試劑的成分。例如，成分可為適于復(fù)原及立即使用之預(yù)測量。所述套組可更包含一或多個(gè)額外的成分如復(fù)原容器，以及額外的試劑如去離子水、洗滌緩沖液等。

在某些實(shí)施例中，所述套組包含操作指南材料。操作指南材料可包含刊物、記錄、圖表或可用于傳達(dá)本文所述之裝置或套組之有用性的任一其它表達(dá)工具。發(fā)明之套組的操作指南材料可，例如，固定于包含一或多個(gè)對期望之程序可能必要之器具的包裝上?；蛘撸僮髦改喜牧峡膳c包裝分開運(yùn)送，或者可藉由通訊網(wǎng)路如互聯(lián)網(wǎng)為電子可取得的。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例

將藉由參考下列實(shí)驗(yàn)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅為了說明的目的而提供，除非特別說明，并非意圖限制本發(fā)明。因此，絕不應(yīng)將本發(fā)明理解為限于下列實(shí)施例，而應(yīng)理解為包含由于本文提供的教示而變得顯而易見之任一及所有變化。

實(shí)施例1：未經(jīng)切割、包埋之組織活檢樣品的高解析度、2-及3-維成像

本文描述之結(jié)果證明了清洗劑及熒光染料之結(jié)合對于完整活檢樣本之多光子成像之臨床應(yīng)用是有用的，附上來自SHG之附加的資訊內(nèi)容。從內(nèi)部熒光及外部核酸染料均可實(shí)現(xiàn)優(yōu)異的細(xì)胞對比度。多通道成像有助于偽著色制程，其模擬傳統(tǒng)染色的樣貌。來自經(jīng)清洗的組織之MPM成像的三維重建可用于完整活檢尺寸的組織樣本，且亦可用于產(chǎn)生膠原纖維化之可量化的特征。

現(xiàn)在描述使用于這些實(shí)驗(yàn)的材料及方法。

組織清洗及染色

人類組織樣本取自肝臟、腎臟、乳房及前列腺切除之廢棄病理組織。樣品在清洗之前于4％甲醛溶液中固定，持續(xù)不同的時(shí)間范圍，從數(shù)小時(shí)至數(shù)天。約1cm×5mm×2mm之隨機(jī)組織切片直接浸入含10μM DAPI及0.5體積％的伊紅之Methacarn氏液1小時(shí)。接著將樣品進(jìn)入比例為1:2之苯甲醇/苯甲酸苯甲酯1小時(shí)。

成像

多光子成像，包含內(nèi)部熒光、細(xì)胞核熒光染色及SHG，之取得是使用以可調(diào)式80-MHz–脈沖Ti:Sapphire激光(Mai Tai,Spectra-Physics,Mountain View,California)、3軸機(jī)動(dòng)顯微鏡載物臺(ASI Imaging,Eugene,Oregon)及裝有數(shù)值孔徑為0.5的×5Nikon物鏡(AZ-Plan Fluor 5x,Nikon Corp,Tokyo,Japan)之Olympus BX51直立顯微鏡頭為基礎(chǔ)之客制家用顯微鏡。

內(nèi)部及核酸染料熒光均藉由使用脈沖寬度為100fsec的740nm入射光而產(chǎn)生。500nm波長分光鏡將內(nèi)部從外源熒光分離，兩者均藉由使用光電倍增管(H7422,Hamamatsu,Bridgewater,New Jersey)偵測。顯微鏡頭包含經(jīng)修改的光學(xué)收集過濾箱以容納光電倍增管。藉由使用370/20帶通濾波器(Chroma Technologies,Rockingham,Vermont)于傳輸中收集二次諧波產(chǎn)生。使用可調(diào)式3軸支架(New Focus,Santa Clara,California)以手動(dòng)定位SHG光電倍增管(Hamamatsu HC-125-02)。

控制及影像收集使用ScanImage軟體(Howard Hughes Medical Institute,Janelia Farm Research Campus,Ashburn,Virginia)(Pologruto等人，2003,Biomed.Eng.Online 2:13)實(shí)行。以512×512解析度進(jìn)行聚焦，以每行(line)1毫秒的掃描時(shí)間，得到大約每秒2個(gè)畫面的畫面更新率(frame rate)。收集的影像解析度為2056×2056或1024×1024于1至6的縮放因子，取決于所需的放大倍率。每個(gè)切片平均4及8個(gè)畫面之間，每個(gè)切片的總擷取時(shí)間為20秒。入射激光強(qiáng)度藉由Pockels細(xì)胞于激發(fā)路徑中手動(dòng)調(diào)節(jié)。以1-至5-μm步長以16位元深度收集堆迭，并使用ImageJ軟體(開發(fā)于國立衛(wèi)生研究院，貝塞斯達(dá)，馬里蘭州)處理。1mm立方體重建的總成像時(shí)間大約為6小時(shí)。后影像處理涉及轉(zhuǎn)換為8位元、影像反轉(zhuǎn)、使用內(nèi)建的“亮度/對比度”外掛(plug-in)對隨機(jī)樣品切片進(jìn)行手動(dòng)整體對比度調(diào)整，以及應(yīng)用內(nèi)建的“平滑”功能。

偽著色藉由反轉(zhuǎn)Ruifrok及Johnston提出的矩陣轉(zhuǎn)換方法(Ruifrok and Johnston,2001,Anal.Quant.Cytol.Histol.23:291-299)加以實(shí)行。簡言之，將來自內(nèi)部熒光及細(xì)胞核染色之強(qiáng)度值轉(zhuǎn)換為紅色、綠色及藍(lán)色通道中的光學(xué)密度，其是根據(jù)H&E公布之矩陣值，使用MATLAB(MathWorks,Natick,Massachusetts)。內(nèi)部熒光強(qiáng)度被分配至伊紅通道(E)，而核酸染色被分配至蘇木精通道(H)。在影像正?；涂s放以實(shí)現(xiàn)足夠的對比度之后，組合的偽彩色影像之紅色(R)、綠色(G)及藍(lán)色(B)通道值如下計(jì)算：

R＝10^(-(0.644E+0.093H))

G＝10^(-(0.717E+0.954H))

B＝10^(-(0.267E+0.283H))

傳統(tǒng)組織學(xué)

石蠟包埋、切片及H&E染色藉由使用已建立之技術(shù)以Tissue-Tek VIP組織處理器(Sakura,Torrance,California)實(shí)行。細(xì)胞角蛋白(CK)7及CK20的免疫組織化學(xué)染色使用市售抗體，且以標(biāo)準(zhǔn)的市售免疫組織化學(xué)設(shè)備(Dako,Glostrup,Denmark)實(shí)行。

現(xiàn)在描述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

清洗允許以SYTOX綠色或吖啶橙染色之樣本在福馬林固定之人類前列腺、肝臟、乳房及腎臟樣品深入大于500μm之具有優(yōu)異細(xì)胞及細(xì)胞核解析度的成像(第2-3圖)。多光子影像顯示易于辨識的特征，與H&E染色的組織之切片相當(dāng)，其可適于目測病理診斷，不用額外的形態(tài)訓(xùn)練。正常前列腺腺體結(jié)構(gòu)容易地以足夠的細(xì)胞核細(xì)節(jié)被看見(第3A圖)。相似地，肝臟組織的高功率圖產(chǎn)生可辨識的染色質(zhì)模式及細(xì)胞質(zhì)細(xì)節(jié)(第3B圖)。乳房虛擬切片顯示可區(qū)分的管狀及腺體結(jié)構(gòu)(第3C圖)。腎臟樣品顯示清楚的腎小球結(jié)構(gòu)及在鄰近小管中可見的細(xì)胞核及細(xì)胞的細(xì)節(jié)(第3D圖)。清洗在較少細(xì)胞密度的組織如乳腺及前列腺中是最完整的，但在使用BABB清洗操作規(guī)程下，甚至腎臟及肝臟亦充分地清洗，顯示良好的的形態(tài)細(xì)節(jié)于深入福馬林固定的組織之1mm。

多光子激光激發(fā)及熒光細(xì)胞核染料的使用亦允許樣本的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及膠原成分之分離。例如，以第4圖所示之腎臟影像說明，內(nèi)部熒光對應(yīng)于細(xì)胞結(jié)構(gòu)且允許對腎小球血管系統(tǒng)及小管細(xì)胞結(jié)構(gòu)的清楚評估(第4A圖)。核酸染色通道允許細(xì)胞核之獨(dú)立評估(第4B圖)。結(jié)合這2個(gè)通道

藉由插入膠原鏈(偽著色為紅色)將這2個(gè)通道與SHG結(jié)合，使得存在于正常人類腎臟中的低水平膠原帶可清楚地被觀察(第4C圖)。亦可能于以MPM取得之熒光染色的樣品影像上復(fù)制H&E型的色彩(第5圖)。多個(gè)通道可單獨(dú)地匹配于模擬H&E效果之相應(yīng)色調(diào)。

清洗及熒光染色對于后續(xù)之組織的石蠟包埋、切片及H&E染色沒有任何可察覺的影響。第3圖顯示的相同樣本經(jīng)由傳統(tǒng)組織學(xué)技術(shù)進(jìn)一步處理，且沒有顯示可辨識的形態(tài)學(xué)不良影響(第6圖)。此外，腎臟組織的CK7及CK20的免疫組織化學(xué)染色顯示CK7對于下行(descending)髓質(zhì)腎小管之預(yù)期中的特異性，而未結(jié)合CK20(第7圖)。因此，在使用BABB作為清洗劑及SYTOX綠色或吖啶橙作為熒光細(xì)胞核染色后，這些抗體的敏感性及特異性清楚地維持。

數(shù)位影像的取得亦允許1mm厚的組織塊的3維重建。肝臟的內(nèi)部熒光之全尺寸3-D重建提供了對正常組織生長更完整的觀點(diǎn)，如第8A圖中呈現(xiàn)之肝臟重建。準(zhǔn)確評估腫瘤生長邊緣的潛力是明顯的。每4μm獲得之細(xì)胞核熒光掃描亦允許乳腺的樹狀結(jié)構(gòu)的可視化，如第8B圖所示。

膠原纖維及脂肪對細(xì)胞核染料波長的透明度有利于這些大型重建，其可藉由ImageJ 3-D體積渲染外掛于標(biāo)準(zhǔn)64位元之筆記型電腦上輕易地旋轉(zhuǎn)及操縱。此外，肝臟及腎臟中SHG訊號的3維重建(第8C圖)證實(shí)了在不需額外的組織處理的情況下實(shí)行完整樣本的纖維化定量分析之能力。如預(yù)期的，SHG朝向激光激發(fā)遠(yuǎn)端的組織的部分(最接近偵測器)較亮，但于1mm厚的組織整體中產(chǎn)生解析之膠原細(xì)節(jié)。

以福馬林以物理石蠟包埋的固定的傳統(tǒng)技術(shù)以及組織學(xué)的切片機(jī)切片已順利地使用于常規(guī)病理學(xué)評估達(dá)一個(gè)多世紀(jì)。它們成功的一部分可歸功于福馬林固定的容易使用及容許失誤的性質(zhì)，結(jié)合石蠟包埋與一系列簡單且便宜的染色技術(shù)的相容性。福馬林固定、石蠟包埋的載玻片的持續(xù)成功之其它重要因素為福馬林固定提供長期的保存以及病理學(xué)家的累積經(jīng)驗(yàn)，其提升解釋的準(zhǔn)確性及一致性。

然而，仍然存在與目前樣本處理方法及這些病理學(xué)家的評估相關(guān)之眾多的限制。對于活檢，這些包含一般直接可視之有限數(shù)量的組織、保留組織以進(jìn)行輔助測試的期望及檢查多個(gè)載玻片所需之時(shí)間的作用。非罕見地，需要額外的組織評估，但是對再切割及程度的要求延誤診斷。再者，它們通常仍導(dǎo)致僅取樣一部分組織，同時(shí)降低用于日益重要的免疫染色及分子分析之組織可用性。此外，不完美的包埋造成組織廢物且可能阻礙詮釋，且切割步驟本身便產(chǎn)生可能妨礙評估的人為因素。未包埋及未切割的組織成像解決了這些傳統(tǒng)的處理限制。它提供了可目視整個(gè)活檢樣本的機(jī)會(huì)，降低由于不完整采樣而遺失重要特征之可能性，且保留用于輔助測試的組織。

分析未切割、未包埋樣本的其它優(yōu)點(diǎn)與節(jié)省時(shí)間及精力有關(guān)。包埋、切割及染色為組織處理中最耗費(fèi)時(shí)間及勞力的一些步驟(Busea,2007,Ann.Diagn.Pathol.11:206-211；Hassell et al.,2010,BMC Clin.Pathol.10:2；Busea,2009,Ann.Diagn.Pathol.14:107-124)，需要具有專業(yè)知識之人員。雖然自動(dòng)化及以微波為基礎(chǔ)的組織處理已允許一些場所開始提供與診斷同一天的一些活檢樣品，但脫水后及清洗步驟是滿足部分供應(yīng)商及病人對形態(tài)學(xué)評估的快速轉(zhuǎn)變的漸增的需求之障礙。

所探索的組織活檢評估中感興趣的另一方面為3維結(jié)構(gòu)的可視化。先前從組織制造大的3-D數(shù)據(jù)集的嘗試使用產(chǎn)生差的對比度、差的深度滲透或在3-D體積成像時(shí)相繼移除組織之方法(Zysk等人，2007,J.Biomed.Opt.12:051403-051403-21；Bizheva等人，2005,J.Biomed.Opt.10:11006-11006-07；Ragan等人，2007,J.Biomed.Opt.12:014015-014015-9；Dechet等人，1999,J.Urol.162:1282-1284)。因此，過去的3-D重建技術(shù)未能改善傳統(tǒng)組織學(xué)的最重要的限制。然而，使用MPM之經(jīng)清洗的組織的3-D重建顯示優(yōu)異的細(xì)胞對比度、足夠的深度，使得整個(gè)活檢樣本能夠成像且與后續(xù)的傳統(tǒng)處理相容，包含以少數(shù)測試的抗體保存免疫染色能力。

臨床采用新成像技術(shù)的關(guān)鍵障礙來自病理學(xué)家的抗拒，其花費(fèi)數(shù)年于特定組的特殊染色上磨練他們的技巧，以及維持與已建立的臨床實(shí)施完全相容的期望。MPM/清洗方式已產(chǎn)生具有與目前常規(guī)實(shí)施相似之解析度及視野的影像，且提供與通常使用的組織學(xué)染色相似的對比度，但亦允許后續(xù)的傳統(tǒng)處理而未有明顯的不良影響。本文所述之多通道方法亦允許簡單的偽著色，其表現(xiàn)與傳統(tǒng)染色的方法中相似的形態(tài)，允許病理學(xué)家容易地辨識突出的組織學(xué)特征。

實(shí)施例2：示例性組織染色操作規(guī)程

將核心活檢尺寸的組織樣本于福馬林中固定從20分鐘至4周的時(shí)間。接著將樣本直接放置于Methacarn氏液中，其于溶液中添加有10μM DAPI及0.5體積％的伊紅。將樣本于45℃培養(yǎng)60分鐘。將樣本直接轉(zhuǎn)移至100％BABB的溶液中，且培養(yǎng)30分鐘。于BABB浴中成像樣本。第15圖描述根據(jù)此示例性方法制備之組織樣品的影像。

實(shí)施例3：示例性組織染色操作規(guī)程

將核心活檢尺寸的組織樣本直接放置于Methacarn氏液中，其于溶液中添加有10μM DAPI及0.5體積％的伊紅。將樣本于45℃培養(yǎng)60分鐘。將樣本直接轉(zhuǎn)移至100％BABB的溶液中，且培養(yǎng)30分鐘。樣本于BABB浴中成像。

實(shí)施例4：示例性組織染色操作規(guī)程

將樣本于福馬林及10μM DAPI中固定，使用傳統(tǒng)方法或快速福馬林固定方法，例如以微波進(jìn)行。將樣本培養(yǎng)于Methacarn氏液中于40℃持續(xù)60分鐘。將樣本直接轉(zhuǎn)移至100％BABB的溶液中，且培養(yǎng)20分鐘。樣本于BABB浴中成像。

實(shí)施例5：利用發(fā)明之方法產(chǎn)生之示例性組織樣品

第9圖顯示多種組織樣品，例如未經(jīng)清洗之樣品之影像(第9A圖)以及以組織處理之傳統(tǒng)乙醇/己烷/BABB方法產(chǎn)生的樣品(第9B圖)。此傳統(tǒng)方法作為比較實(shí)施例，因?yàn)樗徽J(rèn)為比通常需要數(shù)天至數(shù)周以進(jìn)行充分清洗的替代清洗方法顯著更快。第9C圖描述利用本發(fā)明方法處理之樣品的影像。于時(shí)間1.25小時(shí)時(shí)(清洗后處理15分鐘)，與傳統(tǒng)處理相比，以本發(fā)明之方法的清洗顯示更深的清洗(未清洗的體積的較小核心)。傳統(tǒng)方法亦顯示熒光染料滲出至BABB中(紅色調(diào)至液體)，表示染料結(jié)合降低。

于時(shí)間1.5小時(shí)時(shí)，比起使用增加乙醇濃度的標(biāo)準(zhǔn)試劑組合接著以已烷、接著以BABB清洗之快速處理方法，利用本發(fā)明之方法的組織處理顯示顯著較佳的染料滲透。正常化標(biāo)準(zhǔn)染料染色于1.5小時(shí)時(shí)作為深度的函數(shù)之標(biāo)準(zhǔn)化的平均染料染色描繪于第10圖中。這些結(jié)果證明當(dāng)染料加入脫水步驟時(shí)，在脫水及染色期間使用滲透物可進(jìn)一步增加樣品處理的速率。

第11圖描述利用傳統(tǒng)乙醇/已烷/BABB處理方法(第11A圖)以及使用本發(fā)明之方法(第11B圖)處理之組織的影像。本發(fā)明之方法較佳本發(fā)明之方法以便宜的染料組合產(chǎn)生較佳的細(xì)胞核及蛋白質(zhì)熒光訊號的分離(第11B圖中更亮的細(xì)胞核)，以及在深度500μm處顯示改善的細(xì)節(jié)且具有顯著較少的細(xì)胞萎縮(第11A圖中較小的平均細(xì)胞尺寸)于來自相同正常人類肝臟的這些影像中。傳統(tǒng)處理產(chǎn)生的人為因素使其在臨床解釋是不被接受的。再者，于此圖中的影像是在僅1.5小時(shí)之總處理時(shí)間之后所獲得，比用于臨床組織切片制備之任一常規(guī)方法更快，其包含已知對形態(tài)有不利影響之基于微波的方法，且比目前使用之其它可比較的清洗方法更快。此外，使用本發(fā)明之方法處理的組織是完整的且未包埋于石蠟中，使得它們整體可用于額外的測試，這是使用目前可得之其它處理方法所無法實(shí)現(xiàn)的。

第12圖為一系列圖像，其描述單獨(dú)使用Methacarn氏液或甲醇處理并以熱或未以熱處理的組織樣品的影像。

第13圖為衍生自第12圖之曲線圖，其描述以Methacarn氏液、僅以甲醇及未以熱處理之樣品的正?；療晒馊旧壬仙疃取４藞D顯示使用Methacarn氏液的好處，其包含作為滲透劑之冰醋酸以及用于更佳的染料滲透之熱。

第14圖描述利用偽-H&E處理之組織的影像。第14A圖為以細(xì)胞核染色處理之組織的影像。第14B圖為以蛋白質(zhì)熒光處理之組織的影像。第14C圖是使用第14A及14B圖所描述的影像以熒光強(qiáng)度值的指數(shù)矩陣轉(zhuǎn)換而成像之組織的影像。它近乎完美再現(xiàn)傳統(tǒng)經(jīng)固定、切片、及蘇木精及伊紅染色的病理載片(slide)影像。

本文引用的每一及各個(gè)專利、專利申請及出版物的揭露通過引用全部并入本文中。盡管本發(fā)明己參照具體實(shí)施例進(jìn)行揭示，但是清楚的是，本技術(shù)領(lǐng)域其他技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)本發(fā)明的其它實(shí)施例及變化，而不背離本發(fā)明的真正精神和范圍。所附權(quán)利要求意圖被解釋成包含所有這類實(shí)施例和等效變化。