本領(lǐng)域涉及超分辨成像領(lǐng)域，具體涉及一種飽和共振能量轉(zhuǎn)移超分辨的探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

光學(xué)顯微成像技術(shù)由于能夠?qū)毎_展無損傷、實時動態(tài)的直接觀察，進而揭示紛繁復(fù)雜的生命現(xiàn)象的內(nèi)在機制而備受關(guān)注，是廣泛應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域的重要技術(shù)手段。其發(fā)展貫穿著細胞生物學(xué)發(fā)展的始終，是生命科學(xué)領(lǐng)域的主要推動力之一?？梢哉J為，光學(xué)細胞成像顯微系統(tǒng)的分辨率在很大程度上限制和決定了生物學(xué)在多小的微觀尺度上開展研究。細胞及亞細胞結(jié)構(gòu)大多處于納米尺度，如重要的細胞器核糖體直徑僅有25納米，蛋白質(zhì)分子及復(fù)合物則更是在10納米以下。近年來系統(tǒng)生物學(xué)(Systems Biology)的發(fā)展更是迫切要求細胞成像技術(shù)的分辨率從亞微米尺度(>100納米)進入納米尺度(<100納米)，以從更為深入的角度了解細胞內(nèi)各功能單元及其網(wǎng)絡(luò)的局域和整體組織方式。然而，當(dāng)我們利用光波來進行顯微觀測時，量子力學(xué)中的“測不準(zhǔn)”原理為光學(xué)顯微鏡的分辨率設(shè)置了一道不可逾越的屏障，即所謂的光學(xué)衍射極限。自從1872年德國科學(xué)家阿貝提出光學(xué)衍射極限(即分辨率最高只能為光波長的一半左右)的概念以來，光學(xué)顯微系統(tǒng)的分辨率一直未能得到顯著的提高。目前，傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡的橫向空間分辨率最高僅為200納米，縱向分辨率約為500納米，這很明顯不能達到對細胞內(nèi)細微結(jié)構(gòu)觀察的要求，距離理想的納米分辨率相差甚遠。

近年來人們通過對非線性光學(xué)的探索取得了突破了光學(xué)衍射極限范圍的成像。人們利用那些非微擾的、高度的非線性光學(xué)效應(yīng)來達到超分辨成像，例如受激發(fā)射損耗顯微鏡(stimulated emission depletion microscopy，STED)的超分辨能力來自于熒光飽和淬滅過程中的高度非線性；飽和結(jié)構(gòu)光照明顯 微鏡(Saturated Patterned Excitation Microscopy，SPEM)利用了熒光飽和激發(fā)過程中的高度非線性；而隨機光學(xué)重建顯微術(shù)(Stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)利用出射熒光光子數(shù)與定位精度的非線性關(guān)系等。這些超分辨熒光顯微鏡(Super-Resolution Fluorescence Microscopy)，都可以達到約數(shù)十納米的分辨率，為研究細胞內(nèi)部的精細結(jié)構(gòu)提供了前所未有的手段。

飽和共振能量轉(zhuǎn)移超分辨技術(shù)(Saturated Fluorescence resonance energy transfer(FRET)Microscopy,SFM)使用一對高效熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的分子對作為標(biāo)記，利用該探針的供體熒光對激發(fā)光強產(chǎn)生的高度非線性效應(yīng)，可以在普通的激光共聚焦顯微鏡(confocal)上實現(xiàn)超分辨成像。所使用的FRET對的能量傳遞效率越高，供體熒光與激發(fā)光強之間的非線性度就越大，獲得的超分辨效果也就越好。而能量傳遞的效率與供體和受體之間距離的6次方成倒數(shù)，即距離越小能量傳遞效率越高。因而設(shè)計一個高效率、易標(biāo)記的FRET對探針是SFM實現(xiàn)的重要內(nèi)容。

為實現(xiàn)SFM的細胞內(nèi)成像，需要在目標(biāo)蛋白上標(biāo)記上一對超高效FRET對。由于標(biāo)記技術(shù)的限制，實現(xiàn)這一目的并不容易。因此亟需一種同時滿足在納米尺度上產(chǎn)生超高的FRET效率，并且能夠在細胞內(nèi)表達的FRET對探針，用以實現(xiàn)SFM超高分辨率的活細胞多色成像。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，克服現(xiàn)有技術(shù)中傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡的橫向空間分辨率達不到對細胞內(nèi)細微結(jié)構(gòu)觀察的要求的困難，提供一種應(yīng)用于飽和共振能量轉(zhuǎn)移超分辨(SFM)的探針，產(chǎn)生極高的FRET效率，能被應(yīng)用于普通的激光共聚焦顯微鏡中，突破光學(xué)衍射極限，達到SFM納米尺度的分辨率，同時所述探針不會產(chǎn)生免疫反應(yīng)，能夠?qū)崿F(xiàn)SFM超高分辨率的活細胞多色成像。

高效熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是指當(dāng)兩個熒光團相距在1～10nm之間 時，激發(fā)態(tài)的供體可以將能量通過偶極-偶極相互作用的形式傳遞給基態(tài)的受體。熒光供體與熒光受體之間的FRET效率越高，供體熒光與激發(fā)光強之間的非線性度就越大，獲得的超分辨效果也就越好。而FRET效率與熒光供體與熒光受體之間距離的6次方成倒數(shù)，所以要盡可能地減少兩者之間的舉例以提高FRET效率，獲得超過光學(xué)衍射極限的分辨率。

本發(fā)明提供一種飽和共振能量轉(zhuǎn)移超分辨的探針，其包括以下的組成部分：熒光蛋白、與所述熒光蛋白連接的抗所述熒光蛋白的重鏈單域抗體V_HH和與所述重鏈單域抗體V_HH連接的有機熒光分子，所述有機熒光分子與所述熒光蛋白互為飽和共振能量轉(zhuǎn)移供體和飽和共振能量轉(zhuǎn)移受體。

所述的重鏈單域抗體V_HH(nanobody)是指從駱駝或鯊魚的重鏈抗體中提取出的單鏈抗體片段，其包含了抗體中的一個可變域(VH)，只有完整抗體1/10左右的質(zhì)量。其直徑為2nm，體積為2nm*2nm*3nm，能夠與所述的熒光蛋白進行特異性結(jié)合。同時，所述的重鏈單域抗體V_HH有良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，不會在體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)；所述的重鏈單域抗體V_HH分子質(zhì)量低，能更容易滲透到組織中去。較佳地，所述的重鏈單域抗體V_HH為駱駝重鏈單域抗體V_HH。

所述的熒光蛋白為本領(lǐng)域常規(guī)的熒光蛋白，較佳地為ECFP、EBFP、GFP、EGFP、YFP、mCitrine、RFP、mCherry、mPlum和mKate2中的一種或多種，更佳地為GFP、CFP、YFP和mKate2中的一種或多種。

所述的有機熒光分子為本領(lǐng)域常規(guī)的有機熒光分子，即吸收某一波長的光波后能發(fā)射出另一波長大于吸收光的光波的有機分子，一般含有苯環(huán)或雜環(huán)并帶有共軛雙鍵。較佳地為FITC、Cy3、Cy5、Atto 425、Atto 465、Atto488、Atto514、Atto550、Atto594、Atto633、Atto647、Atto740、Alexa405、Alexa488、Alexa546、Alexa555、Alexa633和Alexa750中的一種或多種，更佳地為Alexa546、Atto550、Alexa555、Alexa488、Atto425和Alexa633中的一種或多種。

所述熒光蛋白和抗所述熒光蛋白的重鏈單域抗體V_HH的連接為本領(lǐng)域 常規(guī)的連接，較佳地為通過共價鍵連接。所述重鏈單域抗體V_HH和所述有機熒光分子的連接為本領(lǐng)域常規(guī)的連接，較佳地為通過共價鍵連接。

所述熒光蛋白和所述有機熒光分子成為一對高效熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的熒光分子對，分別作為FRET對的供體和受體，或者，受體和供體。其中，F(xiàn)RET對的供體的發(fā)射譜與受體的吸收譜有部分重疊。兩者在很短的距離內(nèi)產(chǎn)生大于95％以上的FRET效率的能力轉(zhuǎn)移，實現(xiàn)SFM成像。

本發(fā)明提供一種多色飽和共振能量轉(zhuǎn)移超分辨的方法，其包括以下的步驟，同時使用一種以上所述的飽和共振能量轉(zhuǎn)移超分辨的探針，所述的探針中的重鏈單域抗體V_HH分別抗一種以上的熒光蛋白。

本發(fā)明提供一種活細胞飽和共振能量轉(zhuǎn)移超分辨探針，其包括以下的組成部分：重鏈單域抗體V_HH和與所述重鏈單域抗體V_HH連接的有機熒光分子。較佳地，所述的重鏈單域抗體V_HH為駱駝重鏈單域抗體V_HH。

由于重鏈單域抗體V_HH可以在活細胞內(nèi)發(fā)揮著作用，所述的活細胞飽和共振能量轉(zhuǎn)移超分辨探針亦可通過顯微注射等手段進入細胞，從而與細胞中含有的熒光蛋白特異性結(jié)合，達到飽和共振能量轉(zhuǎn)移超分辨觀察活細胞的目的。

本發(fā)明提供一種所述的探針的制備方法，其包括以下的步驟：

(1)、有機熒光分子與抗熒光蛋白的重鏈單域抗體V_HH連接，得有機熒光分子和重鏈單域抗體V_HH的連接物；

(2)、步驟(1)所得的有機熒光分子和重鏈單域抗體V_HH的連接物與熒光蛋白連接，即獲得飽和共振能量轉(zhuǎn)移超分辨探針。

較佳地，步驟(1)所述的連接為通過共價鍵連接。較佳地，步驟(2)所述的連接為通過抗原-抗體之間的特異性結(jié)合相連接。

較佳地，所述的制備方法包括以下的步驟：

(1)、將有機熒光分子溶液和抗熒光蛋白的重鏈單域抗體V_HH溶液混合，孵育，獲得有機熒光分子和重鏈單域抗體V_HH的連接物；

(2)、將步驟(1)所得的有機熒光分子和重鏈單域抗體V_HH的連接物 與熒光蛋白混合，孵育，獲得飽和共振能量轉(zhuǎn)移超分辨探針。

步驟(1)所述的孵育的溫度為本領(lǐng)域常規(guī)的溫度，較佳地為20～30℃，更佳地為25℃。步驟(1)所述的孵育的時間為本領(lǐng)域常規(guī)的時間，較佳地為1～4小時，更佳地為2小時。

步驟(2)所述的孵育的溫度為本領(lǐng)域常規(guī)的溫度，較佳地為35～40℃，更佳地為37℃。步驟(1)所述的孵育的時間為本領(lǐng)域常規(guī)的時間，較佳地為1～4小時，更佳地為2小時。

本發(fā)明提供一種飽和共振能量轉(zhuǎn)移超分辨成像的方法，其包括使觀察樣品與探針結(jié)合，通過顯微鏡進行成像的步驟，其使用所述的飽和共振能量轉(zhuǎn)移超分辨的探針或所述的活細胞飽和共振能量轉(zhuǎn)移超分辨探針進行飽和共振能量轉(zhuǎn)移超分辨成像。

所述的顯微鏡為本領(lǐng)域常規(guī)的顯微鏡，較佳地為激光共聚焦掃描顯微鏡，更佳地為Zessi LSM700、Zessi LSM780、Leica TCS SP5II、Leica TCS SP8、Olypums FV500或Nikon C1。

較佳地，所述的成像為飽和共振能量轉(zhuǎn)移超分辨成像。

在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

本發(fā)明的積極進步效果在于：所述探針構(gòu)建了“熒光蛋白—重鏈單域抗體VHH—有機染料”的高效熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率(FRET)體系，所述的熒光蛋白和所述的熒光分子之間存在95％的高效熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率。同時，所述的重鏈單域抗體V_HH有良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，不會在體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)；所述的重鏈單域抗體V_HH分子質(zhì)量低，能更容易滲透到組織中去，因此所述的探針能夠進入細胞且不會引起免疫反應(yīng)。所述的探針可以方便地對細胞內(nèi)的熒光蛋白進行超分辨成像，實現(xiàn)SFM突破光學(xué)衍射極限成像，改善顯微鏡的分辨率2～3倍，而且還可以進行多色、活細胞飽和共振能量轉(zhuǎn)移超分辨成像，在生命科學(xué)、納米材料科學(xué)、基因分子診斷醫(yī)學(xué)等領(lǐng) 域中得到了廣泛的應(yīng)用。相比于現(xiàn)有技術(shù)，大大簡化了現(xiàn)有SFM的標(biāo)記步驟，無需依次標(biāo)記一抗、二抗和親和素等步驟，解決了SFM標(biāo)記方案的多色成像和活細胞成像的問題。

附圖說明

圖1為使用熒光分光光度計測試的實施例2的Alexa 546-V_HH-GFP探針發(fā)射譜與同濃度的GFP發(fā)射譜。

圖2為使用熒光分光光度計測試的實施例3的Atto550-V_HH-GFP探針發(fā)射譜與同濃度的GFP發(fā)射譜。

圖3為使用熒光分光光度計測試的實施例1的Alexa 555-V_HH-GFP探針發(fā)射譜與同濃度的GFP發(fā)射譜。

圖4為使用了實施例1的Alexa 555-V_HH-GFP探針對融合表達GFP了Hela細胞微管進行SFM成像的結(jié)果對比圖。其中A為普通激光共聚焦顯微鏡(confocal)成像，B為使用了Alexa 555-V_HH探針標(biāo)記后的SFM成像，C和D分別為對應(yīng)的白色直線的熒光強度分布曲線及高斯擬合后得到的半高全寬(分辨率)。

圖5為使用了實施例2的Alexa 546-V_HH-GFP探針標(biāo)記的Hela細胞微管進行SFM成像的結(jié)果對比圖。其中A為普通激光共聚焦顯微鏡(confocal)成像，B為使用了Alexa 546-V_HH探針標(biāo)記后的SFM成像，C和D分別為對應(yīng)的白色直線的熒光強度分布曲線及高斯擬合后得到的半高全寬(分辨率)。

圖6為使用了實施例3的Atto 550-V_HH-GFP探針對Hela細胞微管進行SFM成像的結(jié)果對比圖。其中A為普通激光共聚焦顯微鏡(confocal)成像，B為使用了Atto 550-V_HH探針標(biāo)記后的SFM成像，C和D分別為對應(yīng)的白色直線的熒光強度分布曲線及高斯擬合后得到的半高全寬(分辨率)。

圖7為使用了實施例4的Alexa 633-V_HH-mKate2探針標(biāo)記的Hela細胞微管進行SFM成像的結(jié)果對比圖。其中A為普通激光共聚焦顯微鏡(confocal)成像，B為使用了Alexa 633-V_HH探針標(biāo)記后的SFM成像，C和D分別為對 應(yīng)的白色直線的熒光強度分布曲線及高斯擬合后得到的半高全寬(分辨率)。

具體實施方式

下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。

所述的室溫為本領(lǐng)域常規(guī)的室溫，一般為15～25℃。

熒光染料Alexa555、Alexa546、Alexa488和Alexa 633購自Invitrogen公司。熒光染料Atto550、Atto 425購自Sigma公司。

激光共聚焦顯微鏡Lecia TCS SP5購自德國徠卡公司。

Hela細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，其商品序列號為Tch20。

熒光蛋白mKate2的質(zhì)粒購自Evrogen公司；熒光蛋白GFP、CFP、YFP和的質(zhì)粒購自Addgene公司。

mKate2蛋白、GFP蛋白、YFP蛋白和CFP蛋白等由上述質(zhì)粒通過本領(lǐng)域常規(guī)的方法轉(zhuǎn)染枯草芽孢桿菌等細菌后表達獲得。

抗GFP、CFP、BFP、RFP及mKate2的重鏈單域抗體V_HH購自Chromotek公司。其中，抗GFP、CFP和BFP的重鏈單域抗體V_HH產(chǎn)品編號：st-250；抗mKate2和RFP的重鏈單域抗體V_HH產(chǎn)品編號：rt-250。

實施例1 Alexa 555-V_HH-GFP探針制備及應(yīng)用

一、制備熒光分子標(biāo)記的重鏈單域抗體V_HH

1.取50μL的重鏈單域抗體V_HH到透析管(購自Pierce，molecular weight cutoff＝3500Da)中，并將管套入浮標(biāo)上。將浮標(biāo)放在20mL含有透析液(0.2M NaHCO₃，PH＝8.2)的塑料燒杯中，低速旋轉(zhuǎn)2h后取出，得V_HH溶液。

2.溶解熒光染料。將1mg Alexa 555溶解到100μL的DMSO中，得Alexa555溶液，于-80℃保存。此時Alexa 555的濃度為8mM(其中，Alexa555的分子質(zhì)量為1250)。

3.取5μL步驟2所得的Alexa555溶液，加入50μL步驟1所得的V_HH溶液中(即Alexa 555的摩爾質(zhì)量相對于V_HH10倍過量)，25℃孵育2h，得孵育液A。

4.使用Zeba脫鹽柱(購自Pierce,molecular weight cutoff＝7,000Da)去除游離熒光分子：

①移去Zeba脫鹽柱的底塞，擰松蓋子。

②將Zeba脫鹽柱放入1.5mL離心管中，1500g離心1分鐘。移去儲存液，得到離心后的Zeba脫鹽柱。

③在離心后的Zeba脫鹽柱的樹脂往上傾斜處標(biāo)上記號。之后在離心時，標(biāo)記處朝外。

④加入300μL磷酸鹽緩沖液(1╳，pH 7.4)，在樹脂床上1500g離心1分鐘。移去緩沖液。

⑤重復(fù)步驟④3次，移除離心管中的液體。

⑥將步驟⑤所得的Zeba脫鹽柱放入另一個新的1.5mL離心管中，移除蓋子，加入50μl步驟3獲得的孵育液A，在樹脂床頂部加入15μL上述的磷酸鹽緩沖液。

⑦1500g離心2分鐘。

⑧將離心管中液體取出，即得V_HH-Alexa555連接物，于4℃保存。

二、染料蛋白比測定：

使用Cary 100Bio紫外可見分光光度計(購自Varian公司)測量步驟一所得的V_HH-Alexa555連接物在280nm和555nm處的吸收值。

對于Alexa 555，染料/蛋白的計算公式如下所示：

其中，A₅₅₅為所測在555nm處的吸收值(所用比色皿長度1cm)；A₂₈₀為所測在280nm處的吸收值(所用比色皿長度1cm)；ζ_蛋白為重鏈單域抗體V_HH在280nm處的摩爾消光系數(shù)(單位：cm^-1M^-1)；消光系數(shù)為染料在555nm 處的摩爾消光系數(shù)(cm^-1M^-1)；校正因子為由熒光基團在280nm處的吸收帶來的校正因子。

ζ_蛋白的測定公式為：A＝ζ_蛋白cL。其中，A為V_HH在280nm處的吸收值，c為V_HH的摩爾濃度，L為比色皿長度(cm)。使用3.845μM的V_HH，測得A＝0.107，L＝1cm。因此ζ_蛋白為27828(單位：cm^-1M^-1)。

所測V_HH-Alexa555連接物的A₅₅₅值為1.279；A₂₈₀值為0.298；消光系數(shù)＝150,000；校正因子＝0.08。因此計算的染料/蛋白值為1.279*27828/[150000*(0.298-0.08*1.279)]＝1.2126。

三、Alexa 555-V_HH-GFP探針制備及FRET效率測試

1.取2μL步驟一制備好的V_HH-Alexa555連接物(抗GFP)與GFP蛋白按摩爾比1:2混合，37℃孵育2h，即得Alexa 555-V_HH-GFP探針。此時GFP與Alexa 555構(gòu)成了高FERT效率體系，GFP作為能量供體，Alexa 555作為能量受體。

2.將步驟1所得的Alexa 555-V_HH-GFP探針按照GFP為100nM的濃度稀釋，然后在熒光分光光度計下測試其熒光發(fā)射譜。取相同濃度的GFP蛋白作為對照(如圖3所示)。由圖3可知，使用488nm的激發(fā)光，GFP與Alexa Fluor 546(AF546)之間發(fā)生了高效的能量傳遞，通過計算得到熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效率為97％。

四、細胞微管的染色標(biāo)記及SFM成像

1.在12孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)放入圓蓋玻片，在玻片上鋪上約10萬個Hela細胞，并轉(zhuǎn)染微管GFP。轉(zhuǎn)染步驟如下：

a)在50μL Opti-MEM(購自Life Technologies)中加入熒光蛋白GFP的質(zhì)粒0.8μg，輕輕混勻得混合液A；

b)輕輕混勻Lipofectamine^TM 2000(購自Life Technologies),取2μL加入到步驟a)所得的混合液A中。室溫下靜置5分鐘，得混合液B。

c)輕輕混勻步驟b)所得的混合液B，室溫靜置20分鐘，得混合液C。

d)向步驟c)所得的混合液C中加入400μL無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，加 入到細胞中。

e)4小時后更換成新鮮的無血清培養(yǎng)基，即可。

2.使用37℃、1×磷酸鹽緩沖液(PBS)1mL快速清洗1次，5min后再清洗一次。

3.加入1mL 4％多聚甲醛(w/v)+4％蔗糖(w/v)固定15min。

4.使用1×PBS緩沖液清洗兩次，每次間隔5min。

5.透膜：加入500μL 0.25％Triton X-100(w/v)，孵育15min。

6.使用1×PBS緩沖液清洗3次，每次間隔5min。

7.加入1mL 6％牛血清白蛋白(w/v)封閉30min。

8.加入500μL步驟一制備好的V_HH-Alexa555連接物(抗GFP)(250ng/ml)，孵育1h。

9.使用1×PBS緩沖液清洗三次，每次間隔10分鐘。

10.貼片。

11.選取合適的激光功率，對樣品進行SFM成像，參見圖4。

由圖4可知，SFM超分辨效果明顯，可以將分辨率提高1.5倍。

實施例2 Alexa 546-V_HH-GFP探針制備及應(yīng)用

一、制備熒光分子標(biāo)記的重鏈單域抗體V_HH

1.取50μL的重鏈單域抗體V_HH到透析管(購自Pierce，molecular weight cutoff＝3500Da)中，并將管套入浮標(biāo)上。將浮標(biāo)放在20mL含有透析液(0.2M NaHCO₃，pH＝8.2)的塑料燒杯中，低速旋轉(zhuǎn)2h后取出，得V_HH溶液。

2.溶解熒光染料。將1mg Alexa 546溶解到100μL的DMSO中，得Alexa546溶液，于-80℃保存。此時Alexa 546的濃度為8.6mM(其中，Alexa546的分子質(zhì)量為1159)。

3.取5μL步驟2所得的Alexa546溶液，加入50μL步驟1所得的V_HH溶液中(即Alexa 546的摩爾質(zhì)量相對于V_HH10倍過量)，25℃孵育2h，得孵育液A。

4.使用Zeba脫鹽柱(購自Pierce,molecular weight cutoff＝7,000Da)通 過溶液交換去除游離熒光分子：

①移去柱的底塞，擰松蓋子。

②將柱子放入1.5mL離心管中，1500g離心1分鐘。移去儲存液。

③在脫鹽柱上的樹脂往上傾斜處標(biāo)上記號。之后在離心時，標(biāo)記處朝外。

④加入300μL磷酸鹽緩沖液(1╳，pH 7.4)，在樹脂床上1500g離心1分鐘。移去緩沖液。

⑤重復(fù)步驟④3次，移除離心管中的液體。

⑥將脫鹽柱放入另一個新的離心管中，移除蓋子，加入100μl步驟3獲得的孵育液A，在樹脂床頂部加入15μL上述的磷酸鹽緩沖液。

⑦1500g離心2分鐘。

⑧將離心管中液體取出，即得V_HH-Alexa546連接物，于4℃保存。

二、染料蛋白比測定：

使用Cary 100Bio紫外可見分光光度計(購自Varian)測量步驟一所得的V_HH-Alexa546連接物在280nm和556nm處的吸收值。

對于Alexa 546，染料/蛋白的計算公式如下所示，其參數(shù)意義參照實施例1：

所測V_HH-Alexa546連接物的A₅₅₆值為0.542；A₂₈₀值為0.26；消光系數(shù)＝112000；校正因子＝0.117。因此計算的染料/蛋白值為0.5571。

三、Alexa 546-V_HH-GFP探針制備及FRET效率測試

1.取2μL步驟一制備好的V_HH-Alexa546連接物(抗GFP)與GFP蛋白按摩爾比1:2混合，37℃孵育2h，即得Alexa 546-V_HH-GFP探針。此時GFP與Alexa 546構(gòu)成了高FERT效率體系，GFP作為能量供體，Alexa 546作為能量受體。

2.將步驟1所得的Alexa 546-V_HH-GFP探針按照GFP為100nM的濃度稀釋，然后在熒光分光光度計下測試其熒光發(fā)射譜。取相同濃度的GFP蛋白 作為對照(如圖1所示)。由圖1可知，使用488nm的激發(fā)光，GFP與Alexa Fluor 546(AF546)之間發(fā)生了高效的能量傳遞，通過計算得到熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效率為97％。

四、細胞微管的染色標(biāo)記及SFM成像

1.在12孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)放入圓蓋玻片，在玻片上鋪上約10萬個Hela細胞，并轉(zhuǎn)染微管GFP。轉(zhuǎn)染步驟如下：

a)在50μL Opti-MEM(購自Life Technologies)中加入熒光蛋白GFP的質(zhì)粒0.8μg，輕輕混勻得混合液A；

b)輕輕混勻Lipofectamine^TM 2000(購自Life Technologies),取2μL加入到步驟a)所得的混合液A中。室溫下靜置5分鐘，得混合液B。

c)輕輕混勻步驟b)所得的混合液B，室溫靜置20分鐘，得混合液C。

d)向步驟c)所得的混合液C中加入400μL無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，加入到細胞中。

e)4小時后更換成新鮮的無血清培養(yǎng)基，即可。

2.使用37℃，1×磷酸鹽緩沖液(PBS)1mL快速清洗1次，5min后再清洗一次。

3.加入1mL 4％多聚甲醛(w/v)+4％蔗糖(w/v)固定15min。

4.使用1×PBS緩沖液清洗兩次，每次間隔5min。

5.透膜：加入500μL 0.25％Triton X-100(w/v)，孵育15min。

6.使用1×PBS緩沖液清洗3次，每次間隔5min。

7.加入1mL 6％牛血清白蛋白(w/v)封閉30min。

8.加入500μL步驟一制備好的V_HH-Alexa546連接物(抗GFP)(250ng/ml)，孵育1h。

9.使用1×PBS緩沖液清洗三次，每次間隔10分鐘。

10.貼片。

11.選取合適的激光功率，對樣品進行SFM成像，參見圖5。

由圖5可知，SFM超分辨效果明顯，獲得了突破衍射極限的分辨率。

實施例3 Atto550-V_HH-GFP探針制備及應(yīng)用

一、制備熒光分子標(biāo)記的重鏈單域抗體V_HH

1.取50μL的重鏈單域抗體V_HH到透析管(購自Pierce，molecular weight cutoff＝3500Da)中，并將管套入浮標(biāo)上。將浮標(biāo)放在20mL含有透析液(0.2M NaHCO₃，PH＝8.2)的塑料燒杯中，低速旋轉(zhuǎn)2h后取出，得V_HH溶液。

2.溶解熒光染料。將1mg Atto550溶解到100μL的DMSO中，得Atto550溶液，于-80℃保存。此時Atto550的濃度為12.6mM(其中，Atto550的分子質(zhì)量為791)。

3.取5μL步驟2所得的Atto550溶液，加入50μL步驟1所得的V_HH溶液中(即Atto550的摩爾質(zhì)量相對于V_HH10倍過量)，25℃孵育2h得孵育液A。

4.使用Zeba脫鹽柱(購自Pierce,molecular weight cutoff＝7,000Da)通過溶液交換去除游離熒光分子：

①移去柱的底塞，擰松蓋子。

②將柱子放入1.5mL離心管中，1500g離心1分鐘。移去儲存液。

③在脫鹽柱上的樹脂往上傾斜處標(biāo)上記號。之后在離心時，標(biāo)記處朝外。

④加入300μL磷酸鹽緩沖液(1╳，pH 7.4)，在樹脂床上1500g離心1分鐘。移去緩沖液。

⑤重復(fù)步驟④3次，移除離心管中的液體。

⑥將脫鹽柱放入另一個新的離心管中，移除蓋子，加入100μl步驟3獲得的孵育液A，在樹脂床頂部加入15μL上述的磷酸鹽緩沖液。

⑦1500g離心2分鐘。

⑧將離心管中液體取出，即得V_HH-Atto550連接物，于4℃保存。

二、染料蛋白比測定：

使用Cary 100Bio紫外可見分光光度計(購自Varian)測量步驟一所得的V_HH-Alexa546連接物在280nm和554nm處的吸收值。

對于Atto550，染料/蛋白的計算公式如下所示，其參數(shù)意義參照實施例 1：

所測V_HH-Atto550連接物的A₅₅₄值為0.632；A₂₈₀值為0.26；消光系數(shù)＝120000；校正因子＝0.12。因此計算的染料/蛋白值為0.796。

三、Atto550-V_HH-GFP探針制備及FRET效率測試

1.取2μL步驟一制備好的V_HH-Atto550連接物(抗GFP)與GFP蛋白按摩爾比1:2混合，37℃孵育2h，即得Atto550-V_HH-GFP探針。此時GFP與Atto550構(gòu)成了高FERT效率體系，GFP作為能量供體，Alexa 546作為能量受體。

2.將步驟1所得的Atto550-V_HH-GFP探針按照GFP為100nM的濃度稀釋，然后在熒光分光光度計下測試其熒光發(fā)射譜。取相同濃度的GFP蛋白作為對照(如圖2所示)。由圖2可知，使用488nm的激發(fā)光，GFP與Atto550之間發(fā)生了高效的能量傳遞，通過計算得到熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效率為95％。

四、細胞微管的染色標(biāo)記及SFM成像

1.在12孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)放入圓蓋玻片，在玻片上鋪上約10萬個Hela細胞，并轉(zhuǎn)染微管GFP。轉(zhuǎn)染步驟如下：

a)在50μL Opti-MEM(購自Life Technologies)中加入熒光蛋白GFP的質(zhì)粒0.8μg，輕輕混勻得混合液A；

b)輕輕混勻Lipofectamine^TM 2000(購自Life Technologies),取2μL加入到步驟a)所得的混合液A中。室溫下靜置5分鐘，得混合液B。

c)輕輕混勻步驟b)所得的混合液B，室溫靜置20分鐘，得混合液C。

d)向步驟c)所得的混合液C中加入400μL無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，加入到細胞中。

e)4小時后更換成新鮮的無血清培養(yǎng)基，即可。

2.使用37℃1×磷酸鹽緩沖液(PBS)1mL快速清洗1次，5min后再清洗 一次。

3.加入1mL 4％多聚甲醛(w/v)+4％蔗糖(w/v)固定15min。

4.使用1×PBS緩沖液清洗兩次，每次間隔5min。

5.透膜：加入500μL 0.25％Triton X-100(w/v)，孵育15min。

6.使用1×PBS緩沖液清洗3次，每次間隔5min。

7.加入1mL 6％牛血清白蛋白(w/v)封閉30min。

8.加入500μL步驟一制備好的V_HH-Atto550連接物(抗GFP)(250ng/ml)，孵育1h。

9.使用1×PBS緩沖液清洗三次，每次間隔10分鐘。

10.貼片。

11.選取合適的激光功率，對樣品進行SFM成像，參見圖5。

由圖6可知，SFM超分辨效果明顯，獲得了突破衍射極限的分辨率。

實施例4 Alexa 633-V_HH-mKate2探針制備及應(yīng)用

一、制備熒光分子標(biāo)記的重鏈單域抗體V_HH

1.取50μL的重鏈單域抗體V_HH到透析管(購自Pierce，molecular weight cutoff＝3500Da)中，并將管套入浮標(biāo)上。將浮標(biāo)放在20mL含有透析液(0.2M NaHCO₃，PH＝8.2)的塑料燒杯中，低速旋轉(zhuǎn)2h后取出，得V_HH溶液。

2.溶解熒光染料。將1mg Alexa 633溶解到100μL的DMSO中，得Alexa633溶液，于-80℃保存。此時Alexa 633的濃度為8.3mM(其中，Alexa 633的分子質(zhì)量為1200)。

3.取5μL步驟2所得的Alexa 633溶液，加入50μL步驟1所得的V_HH溶液中(即Alexa 633的摩爾質(zhì)量相對于V_HH10倍過量)，25℃孵育2h，得孵育液A。

4.使用Zeba脫鹽柱(購自Pierce,molecular weight cutoff＝7,000Da)通過溶液交換去除游離熒光分子：

①移去柱的底塞，擰松蓋子。

②將柱子放入1.5mL離心管中，1500g離心1分鐘。移去儲存液。

③在脫鹽柱上的樹脂往上傾斜處標(biāo)上記號。之后在離心時，標(biāo)記處朝外。

④加入300μL磷酸鹽緩沖液(1╳，pH 7.4)，在樹脂床上1500g離心1分鐘。移去緩沖液。

⑤重復(fù)步驟④3次，移除離心管中的液體。

⑥將脫鹽柱放入另一個新的離心管中，移除蓋子，加入100μl步驟3獲得的孵育液A，在樹脂床頂部加入15μL上述的磷酸鹽緩沖液。

⑦1500g離心2分鐘。

⑧將離心管中液體取出，即得V_HH-Alexa 633連接物，于4℃保存。

二、染料蛋白比測定：

使用Cary 100Bio紫外可見分光光度計(購自)測量步驟一所得的V_HH-Alexa 633連接物在280nm和632nm處的吸收值。

對于Alexa 633，染料/蛋白的計算公式如下所示，其參數(shù)意義參照實施例1：

所測V_HH-Alexa 633連接物的A₆₃₂值為0.394；A₂₈₀值為0.421；消光系數(shù)＝159000；校正因子＝0.55。因此計算的染料/蛋白值為0.707。

三、Alexa 633-V_HH-mKate2探針制備及FRET效率測試

1.取2μL步驟一制備好的V_HH-Alexa 633連接物(抗RFP)與mKate2蛋白按摩爾比1:2混合，37℃孵育2h，即得Alexa 633-V_HH-mKate2探針。此時mKate2與Alexa 633構(gòu)成了高FERT效率體系，mKate2作為能量供體，Alexa 633作為能量受體。

2.將步驟1所得的Alexa 633-V_HH-mKate2探針按照mKate2為100nM的濃度稀釋，然后在熒光分光光度計下測試其熒光發(fā)射譜。取相同濃度的mKate2蛋白作為對照。

四、細胞微管的染色標(biāo)記及SFM成像

1.在12孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)放入圓蓋玻片，在玻片上鋪上約10萬 個Hela細胞，并轉(zhuǎn)染微管mKate2。轉(zhuǎn)染步驟如下：

a)在50μL Opti-MEM(購自Life Technologies)中加入熒光蛋白mKate2的質(zhì)粒0.8μg，輕輕混勻得混合液A；

b)輕輕混勻Lipofectamine^TM 2000(購自Life Technologies),取2μL加入到步驟a)所得的混合液A中。室溫下靜置5分鐘，得混合液B。

c)輕輕混勻步驟b)所得的混合液B，室溫靜置20分鐘，得混合液C。

d)向步驟c)所得的混合液C中加入400μL無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，加入到細胞中。

e)4小時后更換成新鮮的無血清培養(yǎng)基，即可。

2.使用37℃1×磷酸鹽緩沖液(PBS)1mL快速清洗1次，5min后再清洗一次。

3.加入1mL 4％多聚甲醛(w/v)+4％蔗糖(w/v)固定15min。

4.使用1×PBS緩沖液清洗兩次，每次間隔5min。

5.透膜：加入500μL 0.25％Triton X-100(w/v)，孵育15min。

6.使用1×PBS緩沖液清洗3次，每次間隔5min。

7.加入1mL 6％牛血清白蛋白(w/v)封閉30min。

8.加入500μL步驟一制備好的V_HH-Alexa 633連接物(抗RFP)(250ng/ml)，孵育1h。

9.使用1×PBS緩沖液清洗三次，每次間隔10分鐘。

10.貼片。

11.選取合適的激光功率，對樣品進行SFM成像，參見圖7。

由圖7可知，SFM超分辨效果明顯，改善SFM分辨率為普通共聚焦顯微鏡分辨率的2倍以上。

實施例5 Atto 425-V_HH-CFP探針制備

一、制備熒光分子標(biāo)記的重鏈單域抗體V_HH

1.取50μL的重鏈單域抗體V_HH到透析管(購自Pierce，molecular weight cutoff＝3500Da)中，并將管套入浮標(biāo)上。將浮標(biāo)放在20mL含有透析液(0.2M NaHCO₃，PH＝8.2)的塑料燒杯中，低速旋轉(zhuǎn)2h后取出，得V_HH溶液。

2.溶解熒光染料。將1mg Atto 425溶解到100μL的DMSO中，得Atto 425溶液，于-80℃保存。此時Atto 425的濃度為20mM(其中，Atto 425的分子質(zhì)量為498)。

3.取5μL步驟2所得的Atto 425溶液，加入50μL步驟1所得的V_HH溶液中(即Atto 425的摩爾質(zhì)量相對于V_HH10倍過量)，20℃孵育4h，得孵育液A。

4.使用Zeba脫鹽柱(購自Pierce,molecular weight cutoff＝7,000Da)去除游離熒光分子：

①移去Zeba脫鹽柱的底塞，擰松蓋子。

②將Zeba脫鹽柱放入1.5mL離心管中，1500g離心1分鐘。移去儲存液，得到離心后的Zeba脫鹽柱。

③在離心后的Zeba脫鹽柱的樹脂往上傾斜處標(biāo)上記號。之后在離心時，標(biāo)記處朝外。

④加入300μL磷酸鹽緩沖液(1╳，pH 7.4)，在樹脂床上1500g離心1分鐘。移去緩沖液。

⑤重復(fù)步驟④3次，移除離心管中的液體。

⑥將步驟⑤所得的Zeba脫鹽柱放入另一個新的1.5mL離心管中，移除蓋子，加入50μl步驟3獲得的孵育液A，在樹脂床頂部加入15μL上述的磷酸鹽緩沖液。

⑦1500g離心2分鐘。

⑧將離心管中液體取出，即得V_HH-Atto 425連接物，于4℃保存。

二、Atto 425-V_HH-CFP探針制備

1.取2μL步驟一制備好的V_HH-Atto 425連接物(抗CFP)與CFP蛋白按摩爾比1:2混合，35℃孵育4h，即得Atto 425-V_HH-CFP探針。

實施例6 Alexa488-V_HH-YFP探針制備

一、制備熒光分子標(biāo)記的重鏈單域抗體V_HH

1.取50μL的重鏈單域抗體V_HH到透析管(購自Pierce，molecular weight cutoff＝3500Da)中，并將管套入浮標(biāo)上。將浮標(biāo)放在20mL含有透析液(0.2M NaHCO₃，PH＝8.2)的塑料燒杯中，低速旋轉(zhuǎn)2h后取出，得V_HH溶液。

2.溶解熒光染料。將1mg Alexa488溶解到100μL的DMSO中，得Alexa488溶液，于-80℃保存。此時Alexa488的濃度為15.5mM(其中，Alexa488的分子質(zhì)量為643)。

3.取5μL步驟2所得的Alexa488溶液，加入50μL步驟1所得的V_HH溶液中(即Alexa488的摩爾質(zhì)量相對于V_HH10倍過量)，30℃孵育1h，得孵育液A。

4.使用Zeba脫鹽柱(購自Pierce,molecular weight cutoff＝7,000Da)去除游離熒光分子：

①移去Zeba脫鹽柱的底塞，擰松蓋子。

②將Zeba脫鹽柱放入1.5mL離心管中，1500g離心1分鐘。移去儲存液，得到離心后的Zeba脫鹽柱。

③在離心后的Zeba脫鹽柱的樹脂往上傾斜處標(biāo)上記號。之后在離心時，標(biāo)記處朝外。

④加入300μL磷酸鹽緩沖液(1╳，pH 7.4)，在樹脂床上1500g離心1分鐘。移去緩沖液。

⑤重復(fù)步驟④3次，移除離心管中的液體。

⑥將步驟⑤所得的Zeba脫鹽柱放入另一個新的1.5mL離心管中，移除蓋子，加入50μl步驟3獲得的孵育液A，在樹脂床頂部加入15μL上述的磷酸鹽緩沖液。

⑦1500g離心2分鐘。

⑧將離心管中液體取出，即得V_HH-Alexa488連接物，于4℃保存。

二、Alexa488-V_HH-YFP探針制備

1.取2μL步驟一制備好的V_HH-Alexa488連接物(抗YFP)與YFP蛋白按摩爾比1:2混合，40℃孵育1h，即得Alexa488-V_HH-YFP探針。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不構(gòu)成對權(quán)利要求范圍的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到的其他實質(zhì)上等同的替代，均在本發(fā)明保護范圍內(nèi)。