血樣中微量伊馬替尼測定方法及在零期臨床試驗中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及血樣中微量伊馬替尼測定方法及在零期臨床試驗中的應用。具體地說，本發(fā)明一個方面涉及一種測定生物樣品中伊馬替尼或其藥用鹽的方法，該方法使用高效液相色譜-串聯(lián)質譜進行測定，并且包括以下步驟和測試條件：測試樣品的處理、試樣測定、液相色譜條件、質譜條件等。本發(fā)明還涉及本發(fā)明方法在伊馬替尼或其藥用鹽的零期臨床試驗中的應用；以及本發(fā)明方法在伊馬替尼或其藥用鹽的藥代動力學試驗研究中的應用。已經發(fā)現(xiàn)，具有本發(fā)明特征的檢測方法可以有益地用于檢測伊馬替尼或其藥用鹽例如甲磺酸鹽在其藥物零期臨床試驗中生物樣品例如血漿中的濃度測定。
【專利說明】血樣中微量伊馬替尼測定方法及在零期臨床試驗中的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術領域】，涉及一種藥物的測定方法，特別涉及一種生物樣品例 如血漿中的藥物的測定方法，更特別地涉及一種針對生物樣品例如血漿中極微量的抗癌藥 物伊馬替尼及其藥用鹽的測定方法。本發(fā)明還涉及該方法在藥物零期臨床試驗研宄中的應 用。

【背景技術】
[0002] 甲磺酸伊馬替尼（ImatinibMesylate)是瑞士諾華公司開發(fā)的一種選擇性酪氨酸 激酶抑制劑，屬苯胺喹唑啉類化合物，其是針對P210蛋白的酪氨酸激酶活性的選擇性抑制 劑，革巴向抑制Ph染色體陽性（Philadelphiachromosomepositive，Ph+)慢性粒細胞白血 ?。–hronicMyeloidLeukaemia,CML)產生的具有酪氨酸激酶活性的異常蛋白Bcr-Abl。 FDA已于2001年5月批準用于治療慢性骨髓性白血病，2002年2月FDA進一步批準甲磺 酸伊馬替尼用于胃腸基質腫瘤的治療。甲磺酸伊馬替尼在體內外均可在細胞水平上抑制 Bcr-Abl酪氨酸激酶，能選擇性抑制Bcr-Abl陽性細胞系細胞、Ph染色體陽性的慢性粒細 胞白血病和急性淋巴細胞白血病病人的新鮮細胞的增殖和誘導其凋亡。此外，甲磺酸伊 馬替尼還可抑制血小板衍化生長因子（PDGF)受體、干細胞因子（SCF)，c-Kit受體的酪氨 酸激酶，從而抑制由I3DGF和SCF介導的細胞行為。其化學名為：4-[ (4-甲基-1-哌嗪） 甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶）-2-嘧啶]氨基]苯基]-苯胺甲磺酸鹽，分子式為 C29H31N70-CH4S03,分子量為589. 7。甲磺酸伊馬替尼的化學結構如下所示：
[0003]

【權利要求】
1. 測定生物樣品中伊馬替尼或其藥用鹽的方法，該方法使用高效液相色譜-串聯(lián)質譜 進行測定，并且包括以下步驟和測試條件： (1) 測試樣品的處理： 取lOOyL含藥生物樣品于1. 5mL管中，加20yL甲醇，加入20yL內標溶液（300ng/ mL)，渦旋混勻，加入100 y L甲醇和200mL乙腈，渦旋50秒，于4°C 14000rpm離心5min，取 上清液200 y 1轉移至1. 5mL進樣瓶中，作為測試樣品待檢測； (2) 試樣測定： 取20 yL測試樣品注入高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀中，檢測樣品中的伊馬替尼和內標 的色譜峰，并據(jù)此計算所述生物樣品中的伊馬替尼的濃度； (3) 液相色譜條件： 色譜柱：Phenomene Cl8 100A柱（3.OX5〇mm);流動相：乙腈（含0? 1%甲酸）：水（含 2mmol/L 乙酸銨和 0? 1% 甲酸），梯度洗脫（5 :95，lmin ;90 :10,3. 5min ;90 :10,4min ;5 :95， 4. lmin ;5 :95,6min)，流速：0? 4mT,/min,進樣量：20 y L ; (4) 質譜條件： 離子源：離子噴霧離子化源；離子噴射電壓：5500V;溫度：550°C ;源內氣體1(GS1， N2)壓力：50psi ;源內氣體2(GS2, N2)壓力：50psi ;氣簾氣體（N2)壓力：20psi ;正離子 方式檢測；掃描方式：選擇離子反應監(jiān)測（MRM)方式；用于定量分析的離子反應分別為m/ z494. 3 - m/z394. 1 (伊馬替尼）和 m/z 408. 2 - m/z235. 0(MK0431，內標）。
2. 根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于以下任一項或多項： 所述伊馬替尼的藥用鹽選自甲磺酸伊馬替尼、鹽酸伊馬替尼、磷酸伊馬替尼、甲苯磺酸 伊馬替尼； 所述生物樣品選自血漿、尿液、唾液等； 所述含藥生物樣品中包含的伊馬替尼的濃度低于l〇〇ng/ml，例如低于75ng/ml，例如 低于 50ng/ml ; 所述高效液相色譜-串聯(lián)質譜能夠檢測到的含藥生物樣品中的伊馬替尼的濃度高于 0? lng/ml，例如高于0? 2ng/ml，例如高于0? 3ng/ml，例如高于0? 4ng/ml ; 所述內標是西格列汀。
3. 根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于以下任一項或多項： 所述"（1)測試樣品的處理"中，所添中的20 y L甲醇中包含有機酸； 所述有機酸選自酒石酸、枸櫞酸、馬來酸、蘋果酸、富馬酸； 所述有機酸在甲醇中的濃度為20?200ug/ml，例如25?150ug/ml，例如50?100ug/ ml ； 所述"（2)試樣測定"中，計算所述生物樣品中的伊馬替尼的濃度是采用內標標準曲線 法進行計算的。
4. 根據(jù)權利要求3的方法，其特征在于以下任一項或多項： 所述內標標準曲線法還包括建立標準曲線的步驟； 所述建立標準曲線包括以下步驟： 取100 y L不含藥的空白生物樣品8份，分別置于1. 5mL管中，各管分別添加20 y L甲 醇，分別加入20 y L內標溶液（300ng/mL)，以貯備液的形式分別添加伊馬替尼或其藥用鹽 以伊馬替尼計〇. 04ng、0. lng、0. 2ng、0. 5叩、1叩、2叩、3叩、4叫，將各管禍旋混勾，分別加入 100 y L甲醇和200mL乙腈，渦旋50秒，于4°C 14000rpm離心5min，取上清液200 y 1轉移至 1.5mL進樣瓶中，作為8份標準樣品，待檢測； 分別取20 y L標準樣品注入高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀中，檢測樣品中的伊馬替尼和 內標的色譜峰，并據(jù)此得到標準曲線，以用于計算所述生物樣品中的伊馬替尼的濃度。
5. 根據(jù)權利要求4的方法，其特征在于以下任一項或多項： 其中在建立標準曲線時，各管分別添加的20 yL甲醇中包含有機酸； 所述有機酸選自酒石酸、枸櫞酸、馬來酸、蘋果酸、富馬酸； 所述有機酸在甲醇中的濃度為20?200ug/ml，例如25?150ug/ml，例如50?100ug/ ml ； 在建立標準曲線時，向空白生物樣品中添加的伊馬替尼或其藥用鹽是以貯備液的形式 添加的； 該貯備液中伊馬替尼或其藥用鹽以伊馬替尼計濃度為1?l〇〇〇ng/ml，例如2? 500ng/ml，例如 4 ?400ng/ml ; 在建立標準曲線時，血漿中藥物濃度以伊馬替尼計在〇. 4?40ng/ml濃度范圍內，按內 標法以峰面積計算，藥物濃度與色譜響應強度（即活性物質與內標的峰面積比值）之間呈 線性關系，且r值>0. 9990,例如r值>0. 9992,例如r值>0. 9995,例如r值>0. 9998 ; 該貯備液是用甲醇為溶劑配制的； 所述內標溶液是用甲醇為溶劑配制的。
6. 根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于以下任一項或多項： 所述生物樣品是取自哺乳動物的生物樣品。所述哺乳動物例如是人； 所述生物樣品是取自人的生物樣品； 所述含藥生物樣品是取自人的生物樣品，該人已口服伊馬替尼或其藥用鹽以伊馬替尼 計為1?l〇mg ; 所述含藥生物樣品是在所述哺乳動物例如人在口服伊馬替尼或其藥用鹽以伊馬替尼 計為1?l〇mg之后的0?48小時期間采集的； 所述含藥生物樣品是在所述哺乳動物例如人在口服伊馬替尼或其藥用鹽以伊馬替尼 計為2?8mg之后的0?36小時期間采集的； 所述含藥生物樣品是在所述哺乳動物例如人在口服伊馬替尼或其藥用鹽以伊馬替尼 計為3?6mg之后的0?24小時期間采集的； 所述含藥生物樣品是在所述哺乳動物例如人在口服伊馬替尼或其藥用鹽以伊馬替尼 計為4mg之后的0?24小時期間采集的； 所述含藥生物樣品是在所述哺乳動物例如人在口服伊馬替尼或其藥用鹽以伊馬替尼 計為 4mg 之后的 0、0? 5、1、1. 5、2、2. 5、3、4、6、8、10、12、24h 時采集的； 所述含藥生物樣品是取自人的生物樣品，該人體重為50?80kg。
7. 根據(jù)權利要求1的方法，其用于伊馬替尼或其藥用鹽在哺乳動物例如人體內的藥代 動力學研宄。
8. 權利要求1至7任一項所述方法在伊馬替尼或其藥用鹽的零期臨床試驗中的應用。
9. 根據(jù)權利要求8的應用，其中所述零期臨床試驗是男性健康受試者單次口服伊馬替 尼或其藥用鹽以伊馬替尼計1?lOmg (例如2?8mg，例如3?6mg)后所進行的研宄；或 者，所述零期臨床試驗是男性健康受試者單次口服伊馬替尼或其藥用鹽以伊馬替尼計1? l〇mg(例如2?8mg，例如3?6mg)后所進行的研宄，該研宄包括藥代動力學試驗。
10.權利要求1至7任一項所述方法在伊馬替尼或其藥用鹽的藥代動力學試驗研宄中 的應用；進一步地，所述藥代動力學試驗研宄是男性健康受試者單次口服伊馬替尼或其藥 用鹽以伊馬替尼計1?l〇mg(例如2?8mg，例如3?6mg)后所進行的研宄。
【文檔編號】G01N30/02GK104483407SQ201410800327
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月18日 優(yōu)先權日:2014年12月18日
【發(fā)明者】王興河, 周保利, 陳剛, 王進, 漆璐, 王澤娟, 金輝 申請人:首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院