雙色熒光定位超分辨率生物顯微方法及系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種雙色熒光定位超分辨率生物顯微方法和系統(tǒng)，所述方法包括有：使用Alexa647和Alexa750熒光分子，或Cy5和Cy7熒光分子對(duì)生物樣品進(jìn)行雙色熒光標(biāo)記，并將生物樣品浸泡在成像緩沖液中；通過激光照射生物樣品，分別產(chǎn)生與Alexa647或Cy5熒光分子對(duì)應(yīng)的第一通道閃爍熒光信號(hào)，以及與Alexa750或Cy7熒光分子對(duì)應(yīng)的第二通道閃爍熒光信號(hào)；根據(jù)第一、第二通道閃爍熒光信號(hào)，分別構(gòu)建第一、第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像；將第一、第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像進(jìn)行對(duì)準(zhǔn)處理以構(gòu)建出第三生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像。借此，本發(fā)明超分辨率生物顯微成像技術(shù)不會(huì)產(chǎn)生通道串?dāng)_，并且可大幅降低背景噪音，從而提高了成像質(zhì)量。
【專利說明】雙色熒光定位超分辨率生物顯微方法及系統(tǒng)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及通信【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種雙色熒光定位超分辨率生物顯微方法及系統(tǒng)。

【背景技術(shù)】
[0002]自恩斯特.阿貝(ErnstAbbe)于十八世紀(jì)七十年代提出光學(xué)成像分辨率極限的理論以來，人們一直在尋找各種各樣的方法方式以求突破這一分辨率極限。目前，通過運(yùn)用現(xiàn)代尖端技術(shù)，莊小威，埃里克.貝齊格(Eric Betzig)分別于2006年先后分別提出了隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)(Stochastic Optical Reconstruct1n Microscopy，S0RM)和焚光定位顯微技術(shù)(Photoactivat1n Laser Microscopy，PLM)，均實(shí)現(xiàn)了突破光學(xué)分辨率極限十倍的超分辨率成像。埃里克?貝齊格更是通過這一技術(shù)獲得了 2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。目前熒光定位顯微技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)部分商業(yè)化，并且開始被用于基礎(chǔ)生命科學(xué)，尤其是分子生物學(xué)以及生物化學(xué)的研宄當(dāng)中。通過這一技術(shù)，研宄人員可以以10到20納米的橫向分辨率和50納米的縱向分辨率研宄生物樣品的細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu)。與其他已有的超分辨率技術(shù)，如電子顯微技術(shù)相比，熒光定位顯微技術(shù)大大簡(jiǎn)化了樣品的制備環(huán)節(jié)，并且可以實(shí)現(xiàn)活體細(xì)胞成像。更重要的是，熒光定位顯微技術(shù)可以輕松的實(shí)現(xiàn)多通道共定位成像，從而得到蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，為大量分子生物研宄課題提供最直接的證據(jù)。然而，現(xiàn)有技術(shù)在多色超分辨率成像方面的表現(xiàn)仍有不足之處。尼康(Nikon) N-STORM作為商業(yè)化熒光定位顯微鏡的代表，其多通道成像使用由兩種不同激發(fā)波長熒光分子結(jié)合而成的“熒光開關(guān)”(例如，Alexa647-Alexa488分子對(duì)以及Alexa467_Alexa405分子對(duì))作為標(biāo)記物。這種方法可以實(shí)現(xiàn)不同成像通道的快速切換，但是這類熒光開關(guān)的標(biāo)記物目前并無商業(yè)化，且實(shí)驗(yàn)室制備較為復(fù)雜。更重要的是，這種多色成像的方法會(huì)產(chǎn)生較嚴(yán)重的通道串?dāng)_(ChannelCrosstalk)，產(chǎn)生錯(cuò)誤的共定位信息。徠卡(Leica)SR GSD定位顯微鏡使用不同激發(fā)波長的普通熒光分子作為標(biāo)記物(例如，Alexa647和Alexa532)，并使用濾鏡系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)多通道成像。這一方法的局限性在于，短激發(fā)波長熒光分子極易被光漂白(Photo-bleach)，并且較短的激發(fā)波長會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的自發(fā)熒光背景，影響成像質(zhì)量。
[0003]另外，樣品漂移是一種普遍存在于超分辨率熒光定位顯微鏡的問題。這是指由于環(huán)境的不穩(wěn)定，如氣流、溫度變化、噪音等等，會(huì)使樣品在拍攝過程中發(fā)生幾十至幾百納米的移動(dòng)。盡管這一漂移現(xiàn)象普遍存在于顯微系統(tǒng)中，由于一般顯微鏡的分辨率不足300納米，漂移造成的現(xiàn)象并不明顯。但是對(duì)于分辨率可達(dá)十幾納米的超分辨率顯微鏡而言，漂移會(huì)對(duì)成像造成嚴(yán)重的干擾。目前已有的解決方法大多為向樣品中加入熒光顆粒，并在成像中記錄這些顆粒的位移，隨后從所得超分辨率圖像中將這一位移減去。其缺陷是制備麻煩；而且熒光顆粒會(huì)占用一個(gè)成像通道；另外，由于光漂白，熒光顆粒的熒光會(huì)隨成像時(shí)間衰減，因此漂移的修正精度也會(huì)隨時(shí)間變差。
[0004]綜上可知，現(xiàn)有技術(shù)在實(shí)際使用上顯然存在不便與缺陷，所以有必要加以改進(jìn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)上述的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種雙色熒光定位超分辨率生物顯微方法及系統(tǒng)，其不會(huì)產(chǎn)生通道串?dāng)_，并且可大幅降低背景噪音，從而提高了成像質(zhì)量。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種雙色熒光定位超分辨率生物顯微方法，包括有:
[0007]使用Alexa647和Alexa750熒光分子，或Cy5和Cy7熒光分子對(duì)生物樣品進(jìn)行雙色熒光標(biāo)記，并將所述生物樣品浸泡在成像緩沖液中；
[0008]通過激光照射所述生物樣品，分別產(chǎn)生與所述Alexa647或Cy5焚光分子對(duì)應(yīng)的第一通道閃爍焚光信號(hào)，以及與所述Alexa750或Cy7焚光分子對(duì)應(yīng)的第二通道閃爍焚光信號(hào);
[0009]根據(jù)所述第一通道閃爍熒光信號(hào)和所述第二通道閃爍熒光信號(hào)，分別構(gòu)建第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像；
[0010]將所述第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和所述第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像進(jìn)行對(duì)準(zhǔn)處理以構(gòu)建出第三生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像。
[0011 ] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述通過激光照射所述生物樣品的步驟包括:
[0012]通過預(yù)定的激活激光照射所述生物樣品以開啟熒光信號(hào)，并通過預(yù)定的激發(fā)激光照射所述生物樣品以關(guān)閉熒光信號(hào)，以產(chǎn)生閃爍熒光信號(hào)。
[0013]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述激活激光具有紫色或紫外波長；所述激發(fā)激光具有Alexa647和Alexa750熒光分子激發(fā)波長，或者所述激發(fā)激光具有Cy5和Cy7熒光分子激發(fā)波長；使用預(yù)定的激發(fā)激光功率和激活激光功率，使同一時(shí)刻大部分的熒光分子關(guān)閉熒光信號(hào)，僅有小部分離散的熒光分子開啟熒光信號(hào)。
[0014]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述成像緩沖液包含有TCEP、環(huán)辛四烯、除氧劑、甲基紫精和/或抗壞血酸；或者
[0015]所述成像緩沖液包含有巰基物、環(huán)辛四烯、除氧劑、甲基紫精和/或抗壞血酸。
[0016]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述TCEP或巰基物與熒光分子在所述激發(fā)激光的照射下結(jié)合形成加合物，所述加合物不會(huì)在所述激發(fā)激光的照射下發(fā)出熒光；所述加合物在所述激活激光的照射下重新分解為所述TCEP或巰基物和熒光分子，所述熒光分子發(fā)出熒光。
[0017]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述環(huán)辛四烯包括環(huán)辛四烯的衍生物；所述除氧劑包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖和過氧化氫酶的組合，或者，所述除氧劑包括吡喃糖氧化酶、葡萄糖和過氧化氫酶的組合。
[0018]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述根據(jù)第一通道閃爍熒光信號(hào)和所述第二通道閃爍熒光信號(hào)，分別構(gòu)建第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像的步驟之前還包括:
[0019]在數(shù)據(jù)采集之前，通過實(shí)時(shí)鎖定系統(tǒng)將所述生物樣品的位置實(shí)時(shí)鎖定。
[0020]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述實(shí)時(shí)鎖定系統(tǒng)將所述生物樣品的位置實(shí)時(shí)鎖定的步驟包括:
[0021 ] 為所述生物樣品提供明場(chǎng)照明，所述生物樣品的明場(chǎng)圖像經(jīng)過前成像透鏡成像于鎖定相機(jī)；
[0022]從所述鎖定相機(jī)中抓取一張生物樣品或參照體的明場(chǎng)圖像作為鎖定模板；
[0023]從所述鎖定相機(jī)中實(shí)時(shí)抓取所述生物樣品的當(dāng)前明場(chǎng)圖像，將所述當(dāng)前明場(chǎng)圖像與所述鎖定模板進(jìn)行對(duì)比；
[0024]計(jì)算所述當(dāng)前明場(chǎng)圖像與所述鎖定模板之間的偏移量；
[0025]根據(jù)所述偏移量對(duì)所述當(dāng)前明場(chǎng)圖像進(jìn)行偏移補(bǔ)償處理。
[0026]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述根據(jù)第一通道閃爍熒光信號(hào)和所述第二通道閃爍熒光信號(hào)，分別構(gòu)建第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像的步驟還包括:
[0027]通過雙色熒光定位超分辨率顯微鏡獲取所述第一通道閃爍熒光信號(hào)和所述第二通道閃爍熒光信號(hào)；
[0028]通過所述雙色熒光定位超分辨率顯微鏡的分光系統(tǒng)將所述第一通道閃爍熒光信號(hào)和所述第二通道閃爍熒光信號(hào)分離，并分別成像于相機(jī)的感光元件的不同區(qū)域；
[0029]獲取所述相機(jī)采集的每一張圖像，通過高斯擬合確定所述圖像中每個(gè)熒光分子的愛里斑中心坐標(biāo)并記錄；
[0030]根據(jù)記錄的所述愛里斑中心坐標(biāo)分別構(gòu)建所述第一通道閃爍熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)的所述第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和所述第二通道閃爍熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)的所述第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像。
[0031]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述雙色熒光定位超分辨率顯微鏡為倒置的全反射熒光顯微鏡；
[0032]所述相機(jī)為EMCXD相機(jī)；和/或
[0033]所述分光系統(tǒng)包括矩形光闌、雙色反射鏡和兩個(gè)濾鏡。
[0034]本發(fā)明還提供一種雙色熒光定位超分辨率生物顯微系統(tǒng)，包括有:
[0035]樣品標(biāo)記模塊，用于使用Alexa647和Alexa750焚光分子，或Cy5和Cy7焚光分子對(duì)生物樣品進(jìn)行雙色熒光標(biāo)記，并將所述生物樣品浸泡在成像緩沖液中；
[0036]信號(hào)產(chǎn)生模塊，用于通過激光照射所述生物樣品，分別產(chǎn)生與所述Alexa647或Cy5熒光分子對(duì)應(yīng)的第一通道閃爍熒光信號(hào)，以及與所述Alexa750或Cy7熒光分子對(duì)應(yīng)的第二通道閃爍熒光信號(hào)；
[0037]第一圖像構(gòu)建模塊，用于根據(jù)所述第一通道閃爍熒光信號(hào)和所述第二通道閃爍熒光信號(hào)，分別構(gòu)建第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像；
[0038]第二圖像構(gòu)建模塊，用于將所述第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和所述第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像進(jìn)行對(duì)準(zhǔn)處理以構(gòu)建出第三生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像。
[0039]根據(jù)本發(fā)明所述的系統(tǒng)，所述信號(hào)產(chǎn)生模塊用于通過預(yù)定的激活激光照射所述生物樣品以開啟熒光信號(hào)，并通過預(yù)定的激發(fā)激光照射所述生物樣品以關(guān)閉熒光信號(hào)，以產(chǎn)生閃爍焚光信號(hào)。
[0040]根據(jù)本發(fā)明所述的系統(tǒng)，所述激活激光具有紫色或紫外波長；所述激發(fā)激光具有Alexa647和Alexa750熒光分子激發(fā)波長，或者所述激發(fā)激光具有Cy5和Cy7熒光分子激發(fā)波長；
[0041]所述信號(hào)產(chǎn)生模塊用于使用預(yù)定的激發(fā)激光功率和激活激光功率，使同一時(shí)刻大部分的焚光分子關(guān)閉焚光信號(hào)，僅有小部分離散的焚光分子開啟焚光信號(hào)。
[0042]根據(jù)本發(fā)明所述的系統(tǒng)，所述成像緩沖液包含有TCEP、環(huán)辛四烯、除氧劑、甲基紫精和/或抗壞血酸；或者
[0043]所述成像緩沖液包含有巰基物、環(huán)辛四烯、除氧劑、甲基紫精和/或抗壞血酸。
[0044]根據(jù)本發(fā)明所述的系統(tǒng)，所述TCEP或巰基物與熒光分子在所述激發(fā)激光的照射下結(jié)合形成加合物，所述加合物不會(huì)在所述激發(fā)激光的照射下發(fā)出熒光；所述加合物在所述激活激光的照射下重新分解為所述TCEP或巰基物和熒光分子，所述熒光分子發(fā)出熒光。
[0045]根據(jù)本發(fā)明所述的系統(tǒng)，所述環(huán)辛四烯包括環(huán)辛四烯的衍生物；所述除氧劑包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖和過氧化氫酶的組合，或者，所述除氧劑包括吡喃糖氧化酶、葡萄糖和過氧化氫酶的組合。
[0046]根據(jù)本發(fā)明所述的系統(tǒng)，還包括:
[0047]實(shí)時(shí)鎖定模塊，用于在數(shù)據(jù)采集之前，通過實(shí)時(shí)鎖定系統(tǒng)將所述生物樣品的位置實(shí)時(shí)鎖定。
[0048]根據(jù)本發(fā)明所述的系統(tǒng)，所述實(shí)時(shí)鎖定模塊包括:
[0049]明場(chǎng)照明子模塊，用于為所述生物樣品提供明場(chǎng)照明，所述生物樣品的明場(chǎng)圖像經(jīng)過前成像透鏡成像于鎖定相機(jī)；
[0050]模塊生成子模塊，用于從所述鎖定相機(jī)中抓取一張生物樣品或參照體的明場(chǎng)圖像作為鎖定模板；
[0051]圖像對(duì)比子模塊，用于從所述鎖定相機(jī)中實(shí)時(shí)抓取所述生物樣品的當(dāng)前明場(chǎng)圖像，將所述當(dāng)前明場(chǎng)圖像與所述鎖定模板進(jìn)行對(duì)比；
[0052]偏移計(jì)算子模塊，用于計(jì)算所述當(dāng)前明場(chǎng)圖像與所述鎖定模板之間的偏移量；
[0053]偏移補(bǔ)償子模塊，用于根據(jù)所述偏移量對(duì)所述當(dāng)前明場(chǎng)圖像進(jìn)行偏移補(bǔ)償處理。
[0054]根據(jù)本發(fā)明所述的系統(tǒng)，所述第一圖像構(gòu)建模塊還包括:
[0055]信號(hào)獲取子模塊，用于通過雙色熒光定位超分辨率顯微鏡獲取第一通道閃爍熒光信號(hào)和第二通道閃爍熒光信號(hào)；
[0056]信號(hào)分離子模塊，用于通過雙色熒光定位超分辨率顯微鏡的分光系統(tǒng)將第一通道閃爍熒光信號(hào)和第二通道閃爍熒光信號(hào)分離，并分別成像于相機(jī)的感光元件的不同區(qū)域；
[0057]位置記錄子模塊，用于獲取相機(jī)采集的每一張圖像，通過高斯擬合確定圖像中每個(gè)熒光分子的愛里斑中心坐標(biāo)并記錄；
[0058]圖像生成子模塊，用于根據(jù)記錄的愛里斑中心坐標(biāo)分別構(gòu)建第一通道閃爍熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)的第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二通道閃爍熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)的第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像。
[0059]根據(jù)本發(fā)明所述的系統(tǒng)，所述雙色熒光定位超分辨率顯微鏡為倒置的全反射熒光顯微鏡；
[0060]所述相機(jī)為EMCXD相機(jī)；和/或
[0061]所述分光系統(tǒng)包括矩形光闌、雙色反射鏡和兩個(gè)濾鏡。
[0062]本發(fā)明雙色熒光定位超分辨率生物顯微技術(shù)采用Alexa647和Alexa750熒光分子，或Cy5和Cy7熒光分子對(duì)生物樣品進(jìn)行雙色熒光標(biāo)記，所采用的熒光分子的發(fā)射光譜完全分離，因此理論上不會(huì)有通道串?dāng)_產(chǎn)生，并且熒光分子的激發(fā)波長不會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生自發(fā)熒光，從而大幅降低了背景噪音，從而提高了成像質(zhì)量，且易于操作。優(yōu)選的是，本發(fā)明采用優(yōu)化的成像緩沖液使熒光分子在成像過程中的光漂白大大減少。更好的是，本發(fā)明通過實(shí)時(shí)鎖定功能對(duì)樣品進(jìn)行鎖定，以徹底消除以消除成像過程中的任何樣品漂移。本發(fā)明可以廣泛應(yīng)用于生物光學(xué)超分辨率顯微領(lǐng)域。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0063]圖1是本發(fā)明雙色熒光定位超分辨率生物顯微系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0064]圖2是本發(fā)明TCEP的分子結(jié)構(gòu)圖；
[0065]圖3是本發(fā)明實(shí)施例中熒光分子與成像緩沖液中TCEP成分作用原理圖
[0066]圖4是本發(fā)明實(shí)施例中熒光分子與成像緩沖液中Th1l成分作用原理圖；
[0067]圖5是本發(fā)明優(yōu)選雙色熒光定位超分辨率生物顯微系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0068]圖6是本發(fā)明雙色熒光定位超分辨率生物顯微方法的流程圖；
[0069]圖7是本發(fā)明優(yōu)選雙色熒光定位超分辨率生物顯微方法的流程圖；
[0070]圖8是本發(fā)明一實(shí)施例中雙色熒光定位超分辨率生物顯微系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0071]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0072]圖1是本發(fā)明雙色熒光定位超分辨率生物顯微系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖，所述系統(tǒng)100包括有樣品標(biāo)記模塊10、信號(hào)產(chǎn)生模塊20、第一圖像構(gòu)建模塊30以及第二圖像構(gòu)建模塊40，其中:
[0073]樣品標(biāo)記模塊10，用于使用Alexa647和Alexa750熒光分子，或Cy5和Cy7熒光分子對(duì)生物樣品進(jìn)行雙色熒光標(biāo)記，并將標(biāo)記后的生物樣品浸泡在成像緩沖液中。在一個(gè)實(shí)施例中，將Alexa647和Alexa750熒光分子通過免疫標(biāo)記法分別結(jié)合在生物樣品的不同結(jié)構(gòu)蛋白上，將生物樣品制作成封片，并且生物樣品需浸泡在成像緩沖液中，再將侵泡有生物樣品的成像緩沖液放在雙色熒光定位超分辨率顯微鏡的載物臺(tái)上。本發(fā)明的熒光分子優(yōu)選采用Alexa647和Alexa750熒光分子，但Alexa647和Alexa750熒光分子亦可由相同激發(fā)波長的花青素染料分子如Cy5和Cy7來替代。
[0074]信號(hào)產(chǎn)生模塊20，用于通過激光照射生物樣品，分別產(chǎn)生與Alexa647或Cy5熒光分子對(duì)應(yīng)的第一通道閃爍熒光信號(hào)，以及與Alexa750或Cy7熒光分子對(duì)應(yīng)的第二通道閃爍焚光信號(hào)。本發(fā)明如果使用Alexa647和Alexa750焚光分子，則產(chǎn)生與Alexa647焚光分子對(duì)應(yīng)的第一通道閃爍熒光信號(hào)和與Alexa750熒光分子對(duì)應(yīng)的第二通道閃爍熒光信號(hào)。本發(fā)明如果使用Cy5和Cy7焚光分子，則產(chǎn)生與Cy5焚光分子對(duì)應(yīng)的第一通道閃爍焚光信號(hào)和與Cy7熒光分子對(duì)應(yīng)的第二通道閃爍熒光信號(hào)。
[0075]第一圖像構(gòu)建模塊30，用于根據(jù)第一通道閃爍熒光信號(hào)和第二通道閃爍熒光信號(hào)，分別構(gòu)建第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像。
[0076]第二圖像構(gòu)建模塊40，用于將第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像進(jìn)行對(duì)準(zhǔn)處理以構(gòu)建出第三生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像。
[0077]優(yōu)選的是，所述成像緩沖液的具體成分包含有TCEP (三(2-羧乙基)膦)、C0T (環(huán)辛四烯)、除氧劑、甲基紫精和/或抗壞血酸；或者成像緩沖液的具體成分包含有巰基物(Th1l)、COT、除氧劑、甲基紫精和/或抗壞血酸。
[0078]所述成像緩沖液中的TCEP或Th1l成本與熒光分子在激發(fā)激光的照射下結(jié)合形成加合物，該加合物不會(huì)在激發(fā)激光的照射下發(fā)出熒光，熒光分子因此被關(guān)閉；且該加合物在激活激光的照射下重新分解為TCEP或Th1l和熒光分子，熒光分子發(fā)出熒光，熒光分子因此被開啟。
[0079]圖2示出了 TCEP的分子結(jié)構(gòu)，Alexa647熒光分子與成像緩沖液中TCEP成分作用后生成如圖3所示的加合物，圖3中的Alexa647熒光分子僅作為實(shí)施例具體說明，此原理適用于包括Alexa750，Cy5和Cy7等花青素?zé)晒夥肿印?br> [0080]Alexa647熒光分子與成像緩沖液中Th1l成分作用后生成如圖4所示的加合物，圖4中的Alexa647熒光分子僅作為實(shí)施例具體說明，此原理適用于包括Alexa750，Cy5和Cy7等花青素?zé)晒夥肿印?br> [0081]所述Th1l包括β ME (2-巰基乙醇)，或MEA (乙醇胺)等，但是Th1l可能會(huì)減少Alexa750分子的光子數(shù)，且增加熒光分子被光漂白的概率，影響圖像質(zhì)量。
[0082]成像緩沖液中的COT包括COT的衍生物。本發(fā)明COT溶解于DMSO (Dimethylsulfoxide，二甲基亞砜)。成像緩沖液中的COT可抑制熒光分子在缺少氧分子的環(huán)境中進(jìn)入三重態(tài)，從而提高焚光分子在打開狀態(tài)時(shí)產(chǎn)生的光子數(shù)，提高分辨率，同時(shí)減少焚光分子被光漂白的概率，提高成像質(zhì)量。
[0083]所述除氧劑包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖和過氧化氫酶的組合；或者，除氧劑包括吡喃糖氧化酶、葡萄糖和過氧化氫酶的組合。成像緩沖液中的葡萄糖氧化酶(或吡喃糖氧化酶)，葡萄糖和過氧化氫酶組合作為除氧劑可去除緩沖液中的氧氣，大幅減少熒光分子被光漂白的概率，提高成像質(zhì)量。本發(fā)明并不局限于使用葡萄糖氧化酶(或吡喃糖氧化酶)，葡萄糖和過氧化氫酶組合作為除氧劑。其他可行的除氧方案亦可應(yīng)用于本發(fā)明。
[0084]成像緩沖液中的甲基紫精和抗壞血酸作為還原劑可抑止熒光分子的光漂白。
[0085]本發(fā)明使用經(jīng)過優(yōu)化的成像緩沖液配方使熒光分子在每次發(fā)光周期都會(huì)產(chǎn)生超過2000個(gè)光子，并且成像緩沖液中的除氧劑和COT成分大幅減少分子的光漂白，從而產(chǎn)生高質(zhì)量的雙色超分辨率圖像。Alexa647通道的橫向分辨率在理想條件下可達(dá)10納米，Alexa750通道可達(dá)20納米。
[0086]實(shí)施例1中成像緩沖液的具體配方為:200mM Tris磷酸緩沖液，pH9.0 ;并含有10 % (w/v)葡萄糖，5U/ml吡喃糖氧化酶，57 μ g/ml過氧化氫酶，2mM COT (溶于DMS0)，25mMTCEP, ImM抗壞血酸和ImM甲基紫精。
[0087]實(shí)施例2中成像緩沖液的具體配方為:200mM Tris磷酸緩沖液，pH8.0 ;并含有10% (w/v)葡萄糖，560 μ g/ml葡萄糖氧化酶，57 μ g/ml過氧化氫酶，2mM COT (溶于DMSO), 25mM TCEP, ImM抗壞血酸和ImM甲基紫精。
[0088]優(yōu)選的是，信號(hào)產(chǎn)生模塊20用于通過預(yù)定的激活激光照射生物樣品以開啟熒光信號(hào)，并通過預(yù)定的激發(fā)激光照射生物樣品以關(guān)閉熒光信號(hào)，以產(chǎn)生閃爍熒光信號(hào)。所述激活激光具有紫色或紫外波長。所述激發(fā)激光具有Alexa647和Alexa750熒光分子激發(fā)波長，或者激發(fā)激光具有Cy5和Cy7熒光分子激發(fā)波長。信號(hào)產(chǎn)生模塊20用于使用預(yù)定的激發(fā)激光功率和激活激光功率，使同一時(shí)刻大部分的熒光分子關(guān)閉熒光信號(hào)，僅有小部分離散的熒光分子開啟熒光信號(hào)。
[0089]在一個(gè)實(shí)施例中，將封裝的生物樣品放置在倒置顯微鏡的載物臺(tái)上，并使用300mW輸出功率的656.5納米激光，和300mW輸出功率的750納米激光，以全內(nèi)反射的模式對(duì)樣品同時(shí)進(jìn)行照射。
[0090]本發(fā)明由于使用的Alexa647和Alexa750熒光分子，或者Cy5和Cy7熒光分子的發(fā)射光譜完全分離，因此理論上不會(huì)有通道串?dāng)_產(chǎn)生。而且，本發(fā)明所用熒光分子的激發(fā)波長不會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生自發(fā)熒光，從而大幅降低了背景噪音。
[0091]圖5是本發(fā)明優(yōu)選雙色熒光定位超分辨率生物顯微系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖，所述系統(tǒng)100包括有樣品標(biāo)記模塊10、信號(hào)產(chǎn)生模塊20、第一圖像構(gòu)建模塊30、第二圖像構(gòu)建模塊40以及實(shí)時(shí)鎖定模塊50，其中:
[0092]樣品標(biāo)記模塊10，用于使用Alexa647和Alexa750熒光分子，或Cy5和Cy7熒光分子對(duì)生物樣品進(jìn)行雙色熒光標(biāo)記，并將標(biāo)記后的生物樣品浸泡在成像緩沖液中。
[0093]信號(hào)產(chǎn)生模塊20，用于通過激光照射生物樣品，分別產(chǎn)生與Alexa647或Cy5熒光分子對(duì)應(yīng)的第一通道閃爍熒光信號(hào)，以及與Alexa750或Cy7熒光分子對(duì)應(yīng)的第二通道閃爍焚光信號(hào)。
[0094]通過預(yù)定的激活激光照射生物樣品以開啟熒光信號(hào)，并通過預(yù)定的激發(fā)激光照射生物樣品以關(guān)閉焚光信號(hào)，以產(chǎn)生閃爍焚光信號(hào)。同時(shí)使用Alexa647和Alexa750的激發(fā)激光照射生物樣品以產(chǎn)生熒光信號(hào)。在成像緩沖液的作用下，熒光分子在強(qiáng)激發(fā)激光的照射下被隨機(jī)的開啟(發(fā)出焚光)或關(guān)閉(不發(fā)出焚光)，產(chǎn)生閃爍。本發(fā)明焚光分子的開啟速度可由一束毫瓦量級(jí)的激活激光控制，開啟速度和激活激光功率成正比。熒光分子的關(guān)閉速度可由其激發(fā)激光強(qiáng)度來控制，關(guān)閉速度和激發(fā)激光強(qiáng)度成正比。所述激發(fā)激光為具有Alexa647分子激發(fā)波長的激光器生成，和具有Alexa750分子激發(fā)波長的激光器生成；所述激活激光為具有紫色或紫外波長的激光器生成。本發(fā)明使用適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)激光功率和激活激光功率，使同一時(shí)刻大部分的熒光分子處于關(guān)閉狀態(tài)，僅有小部分離散的分子處于開啟狀態(tài)。這些開啟的熒光分子所成像之間沒有重合。
[0095]實(shí)時(shí)鎖定模塊50，用于在數(shù)據(jù)采集之前，通過實(shí)時(shí)鎖定系統(tǒng)將生物樣品的位置實(shí)時(shí)鎖定，以徹底去除成像時(shí)的樣品漂移。優(yōu)選的是，實(shí)時(shí)鎖定模塊50包括:
[0096]明場(chǎng)照明子模塊51，用于為生物樣品提供明場(chǎng)照明，生物樣品的明場(chǎng)圖像經(jīng)過前成像透鏡成像于鎖定相機(jī)。
[0097]模塊生成子模塊52，用于從鎖定相機(jī)中抓取一張生物樣品或參照體的明場(chǎng)圖像作為鎖定模板。
[0098]圖像對(duì)比子模塊53，用于從鎖定相機(jī)中實(shí)時(shí)抓取生物樣品的當(dāng)前明場(chǎng)圖像，將當(dāng)前明場(chǎng)圖像與鎖定模板進(jìn)行對(duì)比。
[0099]偏移計(jì)算子模塊54，用于計(jì)算當(dāng)前明場(chǎng)圖像與鎖定模板之間的偏移量。具體可使用相關(guān)度運(yùn)算，或歸一化互相關(guān)運(yùn)算獲取生物樣品的偏移量。
[0100]偏移補(bǔ)償子模塊55，用于根據(jù)偏移量對(duì)當(dāng)前明場(chǎng)圖像進(jìn)行偏移補(bǔ)償處理，此過程循環(huán)至拍攝結(jié)束。
[0101]本發(fā)明所使用的實(shí)時(shí)樣品鎖定方法無需添加任何熒光標(biāo)記物便可以納米精度鎖定生物樣品位置，去除拍攝過程中的樣品漂移，進(jìn)一步提高系統(tǒng)的成像分辨率。由于使用生物樣品本身的明場(chǎng)圖像作為鎖定參照，因此不同于熒光微粒，不會(huì)在長時(shí)間的數(shù)據(jù)采集過程發(fā)生光漂白，從而降低鎖定精度。本發(fā)明所使用的實(shí)時(shí)樣品鎖定方法可將細(xì)胞長時(shí)間鎖定。當(dāng)所拍攝的生物樣品過小或過薄無法產(chǎn)生較高信噪比的明場(chǎng)圖像時(shí)，可向載玻片附著少許1.2微米直徑的聚苯乙烯微球等參照體以產(chǎn)生明場(chǎng)圖像代替生物樣品作為鎖定目標(biāo)。
[0102]第一圖像構(gòu)建模塊30，用于根據(jù)第一通道閃爍熒光信號(hào)和第二通道閃爍熒光信號(hào)，分別構(gòu)建第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像。
[0103]第二圖像構(gòu)建模塊40，用于將第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像進(jìn)行對(duì)準(zhǔn)處理以構(gòu)建出第三生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像。
[0104]優(yōu)選的是，第一圖像構(gòu)建模塊30還包括:
[0105]信號(hào)獲取子模塊31，用于通過雙色熒光定位超分辨率顯微鏡獲取第一通道閃爍熒光信號(hào)和第二通道閃爍熒光信號(hào)。優(yōu)選的，雙色熒光定位超分辨率顯微鏡為倒置的全反射焚光顯微鏡(Total internal Reflect1n Fluorescence Microscope，TIRFM)。即通過倒置的全反射焚光顯微鏡接收閃爍焚光信號(hào)。
[0106]信號(hào)分離子模塊32，用于通過雙色熒光定位超分辨率顯微鏡的分光系統(tǒng)將第一通道閃爍熒光信號(hào)和第二通道閃爍熒光信號(hào)分離，并分別成像于相機(jī)的感光元件的不同區(qū)域。優(yōu)選的，所述相機(jī)為 EMCCD (Electron-Multiplying Charge-coupled Devic，電子倍增電荷耦合元件)相機(jī)，所述分光系統(tǒng)包括矩形光闌、雙色反射鏡和兩個(gè)濾鏡。來自染料分子的熒光信號(hào)被顯微鏡接收后通過分光系統(tǒng)分離，并分別通過透鏡成像于EMCCD相機(jī)的感光元件上的不同區(qū)域。使用適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)激光功率和激活激光功率，使同一時(shí)刻大部分的熒光分子處于關(guān)閉狀態(tài)，僅有小部分離散的分子處于開啟狀態(tài)。這些開啟的熒光分子所成像之間沒有重合。
[0107]位置記錄子模塊33，用于獲取相機(jī)采集的每一張圖像，通過高斯擬合確定圖像中每個(gè)焚光分子的愛里斑中心坐標(biāo)并記錄。由于光學(xué)分辨率極限，每個(gè)焚光分子所成的像都為一個(gè)愛里斑(Airy Disk)。定位軟件獲取EMCXD相機(jī)上的圖像，通過高斯擬合確定每個(gè)愛里斑的中心坐標(biāo)，這一坐標(biāo)更精確的代表了熒光分子的實(shí)際位置，并被程序記錄下來。EMCCD相機(jī)高速記錄閃爍的熒光信號(hào)直至幾乎所有熒光分子都被定位且記錄。
[0108]圖像生成子模塊34，用于根據(jù)記錄的愛里斑中心坐標(biāo)分別構(gòu)建第一通道閃爍熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)的第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二通道閃爍熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)的第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像。程序通過高斯擬合出的愛里斑中心坐標(biāo)分別重構(gòu)出每個(gè)通道的超分辨率生物結(jié)構(gòu)圖樣。
[0109]本發(fā)明提供了一種基于Alexa647和Alexa750焚光分子標(biāo)記的超分辨率雙色焚光定位顯微系統(tǒng)。同時(shí)此顯微系統(tǒng)具有實(shí)施細(xì)胞鎖定功能以消除樣品漂移。本顯微系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單易于操作。應(yīng)用優(yōu)化的成像緩沖液使熒光分子在成像過程中的光漂白大大減少，并且消除了通道串?dāng)_。利用細(xì)胞的明場(chǎng)圖像對(duì)樣品直接進(jìn)行鎖定以消除成像過程中的任何樣品漂移。本發(fā)明可以廣泛應(yīng)用于生物光學(xué)超分辨率顯微領(lǐng)域。
[0110]圖6是本發(fā)明雙色熒光定位超分辨率生物顯微方法的流程圖，其可通過如圖1或圖4所示的系統(tǒng)100是實(shí)現(xiàn)，包括有:
[0111]步驟S601，使用Alexa647和Alexa750熒光分子，或Cy5和Cy7熒光分子對(duì)生物樣品進(jìn)行雙色熒光標(biāo)記，并將生物樣品浸泡在成像緩沖液中。
[0112]在一個(gè)實(shí)施例中，將Alexa647和Alexa750熒光分子通過免疫標(biāo)記法分別結(jié)合在生物樣品的不同結(jié)構(gòu)蛋白上，將生物樣品制作成封片，并且生物樣品需浸泡在成像緩沖液中，再將侵泡有生物樣品的成像緩沖液放在雙色熒光定位超分辨率顯微鏡的載物臺(tái)上。本發(fā)明的熒光分子優(yōu)選采用Alexa647和Alexa750熒光分子，但Alexa647和Alexa750熒光分子亦可由相同激發(fā)波長的花青素染料分子如Cy5和Cy7來替代。
[0113]步驟S602，通過激光照射生物樣品，分別產(chǎn)生與Alexa647或Cy5熒光分子對(duì)應(yīng)的第一通道閃爍熒光信號(hào)，以及與Alexa750或Cy7熒光分子對(duì)應(yīng)的第二通道閃爍熒光信號(hào)。
[0114]本發(fā)明如果使用Alexa647和Alexa750焚光分子，則產(chǎn)生與Alexa647焚光分子對(duì)應(yīng)的第一通道閃爍熒光信號(hào)和與Alexa750熒光分子對(duì)應(yīng)的第二通道閃爍熒光信號(hào)。本發(fā)明如果使用Cy5和Cy7焚光分子，則產(chǎn)生與Cy5焚光分子對(duì)應(yīng)的第一通道閃爍焚光信號(hào)和與Cy7熒光分子對(duì)應(yīng)的第二通道閃爍熒光信號(hào)。
[0115]優(yōu)選的是，通過預(yù)定的激活激光照射生物樣品以開啟熒光信號(hào)，并通過預(yù)定的激發(fā)激光照射生物樣品以關(guān)閉熒光信號(hào)，以產(chǎn)生閃爍熒光信號(hào)。所述激活激光具有紫色或紫外波長。所述激發(fā)激光具有Alexa647和Alexa750熒光分子激發(fā)波長，或者激發(fā)激光具有Cy5和Cy7熒光分子激發(fā)波長。信號(hào)產(chǎn)生模塊20用于使用預(yù)定的激發(fā)激光功率和激活激光功率，使同一時(shí)刻大部分的熒光分子關(guān)閉熒光信號(hào)，僅有小部分離散的熒光分子開啟熒光信號(hào)。
[0116]步驟S603，根據(jù)第一通道閃爍熒光信號(hào)和第二通道閃爍熒光信號(hào)，分別構(gòu)建第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像。
[0117]步驟S604，將第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像進(jìn)行對(duì)準(zhǔn)處理以構(gòu)建出第三生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像。
[0118]優(yōu)選的是，所述成像緩沖液的具體成分包含有TCEP (三(2-羧乙基)膦)、COT (環(huán)辛四烯)、除氧劑、甲基紫精和/或抗壞血酸；或者成像緩沖液的具體成分包含有巰基物(Th1l)、C0T、除氧劑、甲基紫精和/或抗壞血酸。
[0119]所述成像緩沖液中的TCEP或Th1l成本與熒光分子在激發(fā)激光的照射下結(jié)合形成加合物，該加合物不會(huì)在激發(fā)激光的照射下發(fā)出熒光，熒光分子因此被關(guān)閉；且該加合物在激活激光的照射下重新分解為TCEP或Th1l和熒光分子，熒光分子發(fā)出熒光，熒光分子因此被開啟。
[0120]圖2示出了 TCEP的分子結(jié)構(gòu)，Alexa647熒光分子與成像緩沖液中TCEP成分作用后生成如圖3所示的加合物，圖3中的Alexa647熒光分子僅作為實(shí)施例具體說明，此原理適用于包括Alexa750，Cy5和Cy7等花青素?zé)晒夥肿印?br> [0121]Alexa647熒光分子與成像緩沖液中Th1l成分作用后生成如圖4所示的加合物，圖4中的Alexa647熒光分子僅作為實(shí)施例具體說明，此原理適用于包括Alexa750，Cy5和Cy7等花青素?zé)晒夥肿印?br> [0122]所述Th1l包括β ME (2-巰基乙醇)，或MEA (乙醇胺)等，但是Th1l可能會(huì)減少Alexa750分子的光子數(shù)，且增加熒光分子被光漂白的概率，影響圖像質(zhì)量。
[0123]成像緩沖液中的COT包括COT的衍生物。本發(fā)明COT溶解于DMSO (Dimethylsulfoxide，二甲基亞砜)。成像緩沖液中的COT可抑制熒光分子在缺少氧分子的環(huán)境中進(jìn)入三重態(tài)，從而提高焚光分子在打開狀態(tài)時(shí)產(chǎn)生的光子數(shù)，提高分辨率，同時(shí)減少焚光分子被光漂白的概率，提高成像質(zhì)量。
[0124]所述除氧劑包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖和過氧化氫酶的組合；或者，除氧劑包括吡喃糖氧化酶、葡萄糖和過氧化氫酶的組合。成像緩沖液中的葡萄糖氧化酶(或吡喃糖氧化酶)，葡萄糖和過氧化氫酶組合作為除氧劑可去除緩沖液中的氧氣，大幅減少熒光分子被光漂白的概率，提高成像質(zhì)量。本發(fā)明并不局限于使用葡萄糖氧化酶(或吡喃糖氧化酶)，葡萄糖和過氧化氫酶組合作為除氧劑。其他可行的除氧方案亦可應(yīng)用于本發(fā)明。
[0125]成像緩沖液中的甲基紫精和抗壞血酸作為還原劑可抑止熒光分子的光漂白。
[0126]在一個(gè)實(shí)施例中，將封裝的生物樣品放置在倒置顯微鏡的載物臺(tái)上，并使用300mW輸出功率的656.5納米激光，和300mW輸出功率的750納米激光，以全內(nèi)反射的模式對(duì)樣品同時(shí)進(jìn)行照射。
[0127]圖7是本發(fā)明優(yōu)選雙色熒光定位超分辨率生物顯微方法的流程圖，其可通過如圖4所示的系統(tǒng)100是實(shí)現(xiàn)，包括有:
[0128]步驟S701，使用Alexa647和Alexa750熒光分子，或Cy5和Cy7熒光分子對(duì)生物樣品進(jìn)行雙色熒光標(biāo)記，并將生物樣品浸泡在成像緩沖液中。
[0129]優(yōu)選的是，本發(fā)明涉及的雙色熒光超分辨率顯微方法使用Alexa647和Alexa750熒光分子通過免疫反應(yīng)標(biāo)記生物樣品的特定結(jié)構(gòu)，并且將生物樣品浸泡在含有TCEP的成像緩沖液。
[0130]步驟S702，通過激光照射生物樣品，分別產(chǎn)生與Alexa647或Cy5熒光分子對(duì)應(yīng)的第一通道閃爍熒光信號(hào)，以及與Alexa750或Cy7熒光分子對(duì)應(yīng)的第二通道閃爍熒光信號(hào)。
[0131]通過預(yù)定的激活激光照射生物樣品以開啟熒光信號(hào)，并通過預(yù)定的激發(fā)激光照射生物樣品以關(guān)閉焚光信號(hào)，以產(chǎn)生閃爍焚光信號(hào)。本發(fā)明焚光分子的開啟速度可由一束毫瓦量級(jí)的激活激光控制，開啟速度和激活激光功率成正比。熒光分子的關(guān)閉速度可由其激發(fā)激光強(qiáng)度來控制，關(guān)閉速度和激發(fā)激光強(qiáng)度成正比。所述激發(fā)激光為具有Alexa647分子激發(fā)波長的激光器生成，和具有Alexa750分子激發(fā)波長的激光器生成；所述激活激光為具有紫色或紫外波長的激光器生成。本發(fā)明使用適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)激光功率和激活激光功率，使同一時(shí)刻大部分的熒光分子處于關(guān)閉狀態(tài)，僅有小部分離散的分子處于開啟狀態(tài)。這些開啟的焚光分子所成像之間沒有重合。
[0132]步驟S703，在數(shù)據(jù)采集之前，通過實(shí)時(shí)鎖定系統(tǒng)將生物樣品的位置實(shí)時(shí)鎖定。本步驟進(jìn)一步包括:
[0133]為生物樣品提供明場(chǎng)照明，生物樣品的明場(chǎng)圖像經(jīng)過前成像透鏡成像于鎖定相機(jī)。
[0134]從鎖定相機(jī)中抓取一張生物樣品或參照體的明場(chǎng)圖像作為鎖定模板。
[0135]從鎖定相機(jī)中實(shí)時(shí)抓取生物樣品的當(dāng)前明場(chǎng)圖像，將當(dāng)前明場(chǎng)圖像與鎖定模板進(jìn)行對(duì)比。
[0136]計(jì)算當(dāng)前明場(chǎng)圖像與鎖定模板之間的偏移量。
[0137]根據(jù)偏移量對(duì)當(dāng)前明場(chǎng)圖像進(jìn)行偏移補(bǔ)償處理，此過程循環(huán)至拍攝結(jié)束。
[0138]步驟S704，通過雙色熒光定位超分辨率顯微鏡獲取第一通道閃爍熒光信號(hào)和第二通道閃爍熒光信號(hào)。
[0139]優(yōu)選的是，雙色熒光定位超分辨率顯微鏡為倒置的全反射熒光顯微鏡。
[0140]步驟S705，通過雙色熒光定位超分辨率顯微鏡的分光系統(tǒng)將第一通道閃爍熒光信號(hào)和第二通道閃爍熒光信號(hào)分離，并分別成像于相機(jī)的感光元件的不同區(qū)域。
[0141]優(yōu)選的，所述相機(jī)為EMCCD (Electron-Multiplying Charge-coupled Devic，電子倍增電荷耦合元件)相機(jī)，所述分光系統(tǒng)包括矩形光闌、雙色反射鏡和兩個(gè)濾鏡。來自染料分子的焚光信號(hào)被顯微鏡接收后通過分光系統(tǒng)分離，并分別通過透鏡成像于EMCXD相機(jī)的感光元件上的不同區(qū)域。使用適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)激光功率和激活激光功率，使同一時(shí)刻大部分的熒光分子處于關(guān)閉狀態(tài)，僅有小部分離散的分子處于開啟狀態(tài)。這些開啟的熒光分子所成像之間沒有重合。
[0142]步驟S706，獲取相機(jī)采集的每一張圖像，通過高斯擬合確定圖像中每個(gè)熒光分子的愛里斑中心坐標(biāo)并記錄。
[0143]由于光學(xué)分辨率極限，每個(gè)熒光分子所成的像都為一個(gè)愛里斑(Airy Disk)。定位軟件獲取EMCCD相機(jī)上的圖像，通過高斯擬合確定每個(gè)愛里斑的中心坐標(biāo)，這一坐標(biāo)更精確的代表了熒光分子的實(shí)際位置，并被程序記錄下來。EMCCD相機(jī)高速記錄閃爍的熒光信號(hào)直至幾乎所有熒光分子都被定位且記錄。
[0144]步驟S707，根據(jù)記錄的愛里斑中心坐標(biāo)分別構(gòu)建第一通道閃爍熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)的第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二通道閃爍熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)的第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像。
[0145]程序通過高斯擬合出的愛里斑中心坐標(biāo)分別重構(gòu)出每個(gè)通道的超分辨率生物結(jié)構(gòu)圖樣。
[0146]步驟S708，將第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像進(jìn)行對(duì)準(zhǔn)處理以構(gòu)建出第三生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像。
[0147]圖8是本發(fā)明一具體實(shí)施例中雙色熒光定位超分辨率生物顯微系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖，包括實(shí)時(shí)細(xì)胞鎖定系統(tǒng)的光學(xué)結(jié)構(gòu)圖。
[0148]首先，本發(fā)明使用了實(shí)時(shí)細(xì)胞鎖定系統(tǒng)以徹底去除成像時(shí)的樣品漂移。其原理為:I)利用圖8中的發(fā)光二極管和濾鏡I產(chǎn)生藍(lán)光為樣品提供明場(chǎng)照明。2)樣品的明場(chǎng)圖像經(jīng)過前成像透鏡成像于鎖定相機(jī)。4)當(dāng)計(jì)算機(jī)的鎖定程序啟動(dòng)，程序會(huì)先從鎖定相機(jī)中抓取一張樣品的模板圖像作為鎖定模板。5)鎖定程序隨后從鎖定相機(jī)中實(shí)時(shí)抓取樣品的明場(chǎng)圖像，并通過相關(guān)算法與鎖定模板進(jìn)行對(duì)比。6)相關(guān)算法會(huì)得到目前圖像相對(duì)于鎖定模板的偏移量。7)鎖定程序隨后通過驅(qū)動(dòng)電路驅(qū)動(dòng)壓電陶瓷平臺(tái)以補(bǔ)償偏移。8)此過程循環(huán)至拍攝結(jié)束。
[0149]本發(fā)明采用的探測(cè)光路如圖8所示。通過100倍物鏡接收樣品上熒光標(biāo)記物發(fā)出的閃爍熒光信號(hào)。熒光信號(hào)包括:通道1:Alexa647分子發(fā)出的熒光；和通道2:Alexa758分子發(fā)出的焚光。使用由包含矩形光闌，雙色反射鏡2和濾鏡3、濾鏡4組成的分光系統(tǒng)將兩個(gè)通道的信號(hào)分離，并分別成像于EMCCD相機(jī)感光元件的不同區(qū)域。EMCCD相機(jī)以錄像模式同時(shí)記錄來自兩個(gè)通道的閃爍熒光點(diǎn)信號(hào)。定位軟件獲取EMCCD采集的每一副圖像，并通過高斯擬合確定每幅圖像中，每個(gè)通道上的每個(gè)愛里斑的中心坐標(biāo)并記錄。隨后，程序?qū)⑺涗浀闹行淖鴺?biāo)以點(diǎn)的形式繪出，以此分別重構(gòu)出Alexa647和Alexa750通道的超分辨率生物結(jié)構(gòu)圖樣。最后通過算法將兩個(gè)通道的圖像精確對(duì)準(zhǔn)，得到所標(biāo)記樣品的雙色熒光超分辨率顯微圖。
[0150]綜上所述，本發(fā)明雙色熒光定位超分辨率生物顯微技術(shù)采用Alexa647和Alexa750焚光分子，或Cy5和Cy7焚光分子對(duì)生物樣品進(jìn)行雙色焚光標(biāo)記，所米用的焚光分子的發(fā)射光譜完全分離，因此理論上不會(huì)有通道串?dāng)_產(chǎn)生，并且熒光分子的激發(fā)波長不會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生自發(fā)熒光，從而大幅降低了背景噪音，從而提高了成像質(zhì)量，且易于操作。優(yōu)選的是，本發(fā)明采用優(yōu)化的成像緩沖液使熒光分子在成像過程中的光漂白大大減少。更好的是，本發(fā)明通過實(shí)時(shí)鎖定功能對(duì)樣品進(jìn)行鎖定，以徹底消除以消除成像過程中的任何樣品漂移。本發(fā)明可以廣泛應(yīng)用于生物光學(xué)超分辨率顯微領(lǐng)域。
[0151]當(dāng)然，本發(fā)明還可有其它多種實(shí)施例，在不背離本發(fā)明精神及其實(shí)質(zhì)的情況下，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員當(dāng)可根據(jù)本發(fā)明作出各種相應(yīng)的改變和變形，但這些相應(yīng)的改變和變形都應(yīng)屬于本發(fā)明所附的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種雙色熒光定位超分辨率生物顯微方法，其特征在于，包括有: 使用Alexa647和Alexa750熒光分子，或Cy5和Cy7熒光分子對(duì)生物樣品進(jìn)行雙色熒光標(biāo)記，并將所述生物樣品浸泡在成像緩沖液中； 通過激光照射所述生物樣品，分別產(chǎn)生與所述Alexa647或Cy5焚光分子對(duì)應(yīng)的第一通道閃爍熒光信號(hào)，以及與所述Alexa750或Cy7熒光分子對(duì)應(yīng)的第二通道閃爍熒光信號(hào)； 根據(jù)所述第一通道閃爍熒光信號(hào)和所述第二通道閃爍熒光信號(hào)，分別構(gòu)建第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像； 將所述第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和所述第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像進(jìn)行對(duì)準(zhǔn)處理以構(gòu)建出第三生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述通過激光照射所述生物樣品的步驟包括: 通過預(yù)定的激活激光照射所述生物樣品以開啟熒光信號(hào)，并通過預(yù)定的激發(fā)激光照射所述生物樣品以關(guān)閉熒光信號(hào)，以產(chǎn)生閃爍熒光信號(hào)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述激活激光具有紫色或紫外波長；所述激發(fā)激光具有Alexa647和Alexa750熒光分子激發(fā)波長，或者所述激發(fā)激光具有Cy5和Cy7熒光分子激發(fā)波長；使用預(yù)定的激發(fā)激光功率和激活激光功率，使同一時(shí)刻大部分的熒光分子關(guān)閉焚光信號(hào)，僅有小部分離散的焚光分子開啟焚光信號(hào)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述成像緩沖液包含有TCEP、環(huán)辛四烯、除氧劑、甲基紫精和/或抗壞血酸；或者 所述成像緩沖液包含有巰基物、環(huán)辛四烯、除氧劑、甲基紫精和/或抗壞血酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述TCEP或巰基物與熒光分子在所述激發(fā)激光的照射下結(jié)合形成加合物，所述加合物不會(huì)在所述激發(fā)激光的照射下發(fā)出熒光；所述加合物在所述激活激光的照射下重新分解為所述TCEP或巰基物和熒光分子，所述熒光分子發(fā)出焚光。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述環(huán)辛四烯包括環(huán)辛四烯的衍生物；所述除氧劑包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖和過氧化氫酶的組合，或者，所述除氧劑包括吡喃糖氧化酶、葡萄糖和過氧化氫酶的組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述根據(jù)第一通道閃爍熒光信號(hào)和所述第二通道閃爍熒光信號(hào)，分別構(gòu)建第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像的步驟之前還包括: 在數(shù)據(jù)采集之前，通過實(shí)時(shí)鎖定系統(tǒng)將所述生物樣品的位置實(shí)時(shí)鎖定。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)鎖定系統(tǒng)將所述生物樣品的位置實(shí)時(shí)鎖定的步驟包括: 為所述生物樣品提供明場(chǎng)照明，所述生物樣品的明場(chǎng)圖像經(jīng)過前成像透鏡成像于鎖定相機(jī)； 從所述鎖定相機(jī)中抓取一張生物樣品或參照體的明場(chǎng)圖像作為鎖定模板； 從所述鎖定相機(jī)中實(shí)時(shí)抓取所述生物樣品的當(dāng)前明場(chǎng)圖像，將所述當(dāng)前明場(chǎng)圖像與所述鎖定模板進(jìn)行對(duì)比； 計(jì)算所述當(dāng)前明場(chǎng)圖像與所述鎖定模板之間的偏移量； 根據(jù)所述偏移量對(duì)所述當(dāng)前明場(chǎng)圖像進(jìn)行偏移補(bǔ)償處理。
9.根據(jù)權(quán)利要求1?8任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述根據(jù)第一通道閃爍熒光信號(hào)和所述第二通道閃爍熒光信號(hào)，分別構(gòu)建第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像的步驟還包括: 通過雙色熒光定位超分辨率顯微鏡獲取所述第一通道閃爍熒光信號(hào)和所述第二通道閃爍焚光信號(hào)； 通過所述雙色熒光定位超分辨率顯微鏡的分光系統(tǒng)將所述第一通道閃爍熒光信號(hào)和所述第二通道閃爍熒光信號(hào)分離，并分別成像于相機(jī)的感光元件的不同區(qū)域； 獲取所述相機(jī)采集的每一張圖像，通過高斯擬合確定所述圖像中每個(gè)熒光分子的愛里斑中心坐標(biāo)并記錄； 根據(jù)記錄的所述愛里斑中心坐標(biāo)分別構(gòu)建所述第一通道閃爍熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)的所述第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和所述第二通道閃爍熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)的所述第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述雙色熒光定位超分辨率顯微鏡為倒置的全反射焚光顯微鏡； 所述相機(jī)為EMCCD相機(jī)；和/或 所述分光系統(tǒng)包括矩形光闌、雙色反射鏡和兩個(gè)濾鏡。
11.一種雙色熒光定位超分辨率生物顯微系統(tǒng)，其特征在于，包括有: 樣品標(biāo)記模塊，用于使用Alexa647和Alexa750焚光分子，或Cy5和Cy7焚光分子對(duì)生物樣品進(jìn)行雙色熒光標(biāo)記，并將所述生物樣品浸泡在成像緩沖液中； 信號(hào)產(chǎn)生模塊，用于通過激光照射所述生物樣品，分別產(chǎn)生與所述Alexa647或Cy5熒光分子對(duì)應(yīng)的第一通道閃爍熒光信號(hào)，以及與所述Alexa750或Cy7熒光分子對(duì)應(yīng)的第二通道閃爍熒光信號(hào)； 第一圖像構(gòu)建模塊，用于根據(jù)所述第一通道閃爍熒光信號(hào)和所述第二通道閃爍熒光信號(hào)，分別構(gòu)建第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像； 第二圖像構(gòu)建模塊，用于將所述第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和所述第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像進(jìn)行對(duì)準(zhǔn)處理以構(gòu)建出第三生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述信號(hào)產(chǎn)生模塊用于通過預(yù)定的激活激光照射所述生物樣品以開啟熒光信號(hào)，并通過預(yù)定的激發(fā)激光照射所述生物樣品以關(guān)閉焚光信號(hào)，以產(chǎn)生閃爍焚光信號(hào)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述激活激光具有紫色或紫外波長；所述激發(fā)激光具有Alexa647和Alexa750熒光分子激發(fā)波長，或者所述激發(fā)激光具有Cy5和Cy7熒光分子激發(fā)波長； 所述信號(hào)產(chǎn)生模塊用于使用預(yù)定的激發(fā)激光功率和激活激光功率，使同一時(shí)刻大部分的焚光分子關(guān)閉焚光信號(hào)，僅有小部分離散的焚光分子開啟焚光信號(hào)。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述成像緩沖液包含有TCEP、環(huán)辛四烯、除氧劑、甲基紫精和/或抗壞血酸；或者 所述成像緩沖液包含有巰基物、環(huán)辛四烯、除氧劑、甲基紫精和/或抗壞血酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述TCEP或巰基物與熒光分子在所述激發(fā)激光的照射下結(jié)合形成加合物，所述加合物不會(huì)在所述激發(fā)激光的照射下發(fā)出熒光；所述加合物在所述激活激光的照射下重新分解為所述TCEP或巰基物和熒光分子，所述熒光分子發(fā)出焚光。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述環(huán)辛四烯包括環(huán)辛四烯的衍生物；所述除氧劑包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖和過氧化氫酶的組合，或者，所述除氧劑包括吡喃糖氧化酶、葡萄糖和過氧化氫酶的組合。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，其特征在于，還包括: 實(shí)時(shí)鎖定模塊，用于在數(shù)據(jù)采集之前，通過實(shí)時(shí)鎖定系統(tǒng)將所述生物樣品的位置實(shí)時(shí)鎖定。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述實(shí)時(shí)鎖定模塊包括: 明場(chǎng)照明子模塊，用于為所述生物樣品提供明場(chǎng)照明，所述生物樣品的明場(chǎng)圖像經(jīng)過前成像透鏡成像于鎖定相機(jī)； 模塊生成子模塊，用于從所述鎖定相機(jī)中抓取一張生物樣品或參照體的明場(chǎng)圖像作為鎖定模板； 圖像對(duì)比子模塊，用于從所述鎖定相機(jī)中實(shí)時(shí)抓取所述生物樣品的當(dāng)前明場(chǎng)圖像，將所述當(dāng)前明場(chǎng)圖像與所述鎖定模板進(jìn)行對(duì)比； 偏移計(jì)算子模塊，用于計(jì)算所述當(dāng)前明場(chǎng)圖像與所述鎖定模板之間的偏移量； 偏移補(bǔ)償子模塊，用于根據(jù)所述偏移量對(duì)所述當(dāng)前明場(chǎng)圖像進(jìn)行偏移補(bǔ)償處理。
19.根據(jù)權(quán)利要求11?18任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述第一圖像構(gòu)建模塊還包括: 信號(hào)獲取子模塊，用于通過雙色熒光定位超分辨率顯微鏡獲取第一通道閃爍熒光信號(hào)和第二通道閃爍熒光信號(hào)； 信號(hào)分離子模塊，用于通過雙色熒光定位超分辨率顯微鏡的分光系統(tǒng)將第一通道閃爍熒光信號(hào)和第二通道閃爍熒光信號(hào)分離，并分別成像于相機(jī)的感光元件的不同區(qū)域； 位置記錄子模塊，用于獲取相機(jī)采集的每一張圖像，通過高斯擬合確定圖像中每個(gè)熒光分子的愛里斑中心坐標(biāo)并記錄； 圖像生成子模塊，用于根據(jù)記錄的愛里斑中心坐標(biāo)分別構(gòu)建第一通道閃爍熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)的第一生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像和第二通道閃爍熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)的第二生物結(jié)構(gòu)超分辨率圖像。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述雙色熒光定位超分辨率顯微鏡為倒置的全反射熒光顯微鏡； 所述相機(jī)為EMCCD相機(jī)；和/或 所述分光系統(tǒng)包括矩形光闌、雙色反射鏡和兩個(gè)濾鏡。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104515760SQ201410787361
【公開日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2014年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月17日
【發(fā)明者】趙騰, 雷明德, 杜勝望 申請(qǐng)人:香港納觀生物有限公司