一種利用普朗尼克f127和甘薯莖篩選殺線蟲劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用普朗尼克F127和甘薯莖篩選殺線蟲劑的方法，屬于農(nóng)藥篩選方法領(lǐng)域。本發(fā)明以質(zhì)量百分比為20～40％的普朗尼克F127溶液為基質(zhì)，將待測(cè)藥劑和線蟲液加入到基質(zhì)中，在室溫下放置48～72h，然后插入甘薯莖，培養(yǎng)3～15d，取出甘薯莖，對(duì)侵入甘薯莖的線蟲計(jì)數(shù)，計(jì)算防效。與浸漬法相比，本發(fā)明方法能夠綜合評(píng)價(jià)待測(cè)藥劑對(duì)線蟲的致死作用，以及對(duì)線蟲的活動(dòng)能力與侵入能力的抑制作用，篩選準(zhǔn)確度高，可靠性強(qiáng)；其次，本發(fā)明方法所用的甘薯莖以及馬鈴薯腐爛莖線蟲易于在室內(nèi)擴(kuò)繁，材料易得，適宜大量藥劑篩選；此外，本發(fā)明方法以植物寄生線蟲為測(cè)試對(duì)象，與常用的秀麗小桿線蟲相比，其檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠。
【專利說(shuō)明】一種利用普朗尼克F127和甘薯莖篩選殺線蟲劑的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)藥篩選方法領(lǐng)域，具體涉及一種利用普朗尼克F127和甘薯莖篩選 殺線蟲劑的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物線蟲是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要病原物之一，每年給世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失約 1000億美元。植物線蟲的防治方法包括抗病品種、輪作、水淹、曝曬、生物防治等（Roland Ν·Ρ·等.PlantNematology，CABIPublishing. 2013·)，但化學(xué)防治依然是快速、經(jīng)濟(jì)有效 的防治方法，深受農(nóng)民的青睞。
[0003] 傳統(tǒng)的殺線蟲劑篩選多以秀麗小桿線蟲（Caenorhabditiselegans)為 測(cè)試對(duì)象，評(píng)價(jià)供試藥劑對(duì)該線蟲的毒力（OhbaK等.JournalofPesticide Science，1984, 9:91-96)。目前商品化的殺線蟲劑均是以該篩選模式進(jìn)行初篩獲得的，在初 篩的基礎(chǔ)上進(jìn)一步以植物寄生線蟲為測(cè)試對(duì)象，分別以浸漬法、盆栽法以及田間試驗(yàn)等進(jìn) 行復(fù)篩與驗(yàn)證。
[0004] 殺線蟲劑對(duì)線蟲的作用方式有多種（KearnJ等·PesticideBiochemistry andPhysiology. 2014)，但由于線蟲的抗逆性較強(qiáng)，對(duì)藥劑多不敏感，一般情況下殺線 蟲劑對(duì)線蟲的致死作用較差，殺線蟲劑主要通過抑制卵孵化、抑制線蟲迀移、控制線蟲 侵入、抑制線蟲發(fā)育等復(fù)合作用來(lái)達(dá)到控制線蟲的目的（鄒雅新等.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué) 報(bào)，2011，34(5) :78-81)。浸漬法是篩選殺線蟲劑的主要方法，也是我國(guó)測(cè)試殺線蟲劑生物 活性的標(biāo)準(zhǔn)方法（NY/T1833. 1-2009)。但浸漬法僅能夠測(cè)試藥劑對(duì)線蟲的致死作用，而無(wú) 法評(píng)價(jià)藥劑對(duì)線蟲卵的抑制作用、以及對(duì)線蟲活動(dòng)能力、侵入能力的作用，因此浸漬法會(huì)造 成對(duì)線蟲具有活性物質(zhì)的漏篩。
[0005] 普朗尼克F127(英文名稱：PluronicF127,化學(xué)式為：（C3H60.C2H4O)X，又名嵌段 式聚醚、聚醚、環(huán)氧丙烷與環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯、聚乙二醇接枝聚丙二醇、泊 洛沙姆、聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物、泊洛沙姆407等）在醫(yī)學(xué)、制藥以及化妝領(lǐng)域均有廣泛 的應(yīng)用。20%?25%的普朗尼克F127在低溫環(huán)境下呈液態(tài)，在常溫下成半固態(tài)。由于該 基質(zhì)透明，線蟲可在該基質(zhì)內(nèi)自由活動(dòng)，適宜用于線蟲行為研宄（KoM.P.等.Journalof Nematology，1988, 20:478-485)。OhbaK等認(rèn)為普朗尼克F127是適宜替代瓊脂觀察線蟲 行為的基質(zhì)（〇hbaK等.JournalofPesticideScience, 1984, 9:91-96);Congli等利用 該基質(zhì)研宄番茄、擬南芥等植物對(duì)根結(jié)線蟲的吸引活性（CongliW等，Nematology，2009,V ol.l1(3)，453-464;ΚοΜ·Ρ·等.JournalofNematology，1988, 20:478-485) 〇
[0006] 經(jīng)檢索，沒有發(fā)現(xiàn)利用普朗尼克F127進(jìn)行殺線蟲劑篩選的研宄報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)現(xiàn)有的篩選殺線蟲劑方法中存在的容易造成漏篩的問題，本發(fā)明目的在于提 供一種利用普朗尼克F127和甘薯莖篩選殺線蟲劑的方法。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0009] 一種利用普朗尼克F127和甘薯莖篩選殺線蟲劑的方法，包括如下步驟：
[0010] (1)、按照質(zhì)量百分比為20?40%的比例將普朗尼克F127放入蒸餾水中，置于 0?6°C低溫下過夜溶解，得普朗尼克F127母液；
[0011] (2)、用蒸餾水將馬鈴薯腐爛莖線蟲（Ditylenchusdestructorthorne)配制成 10?1000頭/mL的液體，得線蟲液；
[0012] (3)、依據(jù)待測(cè)藥劑的極性用丙酮或水將待測(cè)藥劑溶解，然后用水稀釋為質(zhì)量體積 比為1?20g/L的待測(cè)藥劑溶液；
[0013](4)、用質(zhì)量百分比為0. 1%的吐溫80對(duì)步驟⑶所得的待測(cè)藥劑溶液進(jìn)行梯度稀 釋，然后和步驟（2)所得的線蟲液一起加入到步驟（1)所得的普朗尼克F127母液中，使普 朗尼克F127的終濃度為18?30% (質(zhì)量百分比），使線蟲液的含量為5?100條/mL;緩 慢振蕩混勻，并倒入9cm培養(yǎng)皿中，室溫下放置48?72h;
[0014] (5)、在培養(yǎng)皿中央插入長(zhǎng)度為0. 5?2.Ocm的甘薯莖段，室溫下培養(yǎng)3?15d，然 后將甘薯莖段取出，采用淺盤法分離其中的線蟲，計(jì)數(shù)；以不添加藥劑處理為對(duì)照；計(jì)算待 測(cè)藥劑的防治效果，在待測(cè)藥劑的防治效果大于20%時(shí)，即說(shuō)明待測(cè)藥劑在該測(cè)試濃度下 對(duì)線蟲具有活性；
[0015] 防治效果（％) = (對(duì)照處理侵入線蟲數(shù)量-藥劑處理侵入線蟲數(shù)量）/對(duì)照處理 侵入線蟲數(shù)量X100%。
[0016] 上述方法步驟（1)中所述的低溫優(yōu)選為0?4°C。
[0017] 上述方法步驟（3)中所述的待測(cè)藥劑是指化學(xué)藥劑或生物代謝產(chǎn)物等。
[0018] 上述方法步驟（4)中所述的普朗尼克F127的質(zhì)量百分比優(yōu)選為23%。
[0019] 上述方法步驟（4)或（5)中所述的室溫為20?30°C。
[0020] 上述方法步驟（4)中所述的放置時(shí)間優(yōu)選為48h。
[0021] 上述方法步驟（5)中所述的甘薯莖段長(zhǎng)度優(yōu)選為I. 0cm。
[0022] 上述方法步驟（5)中所述的培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為5d。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：（1)本發(fā)明方法所用的基質(zhì)普 朗尼克F127具有在低溫下呈液態(tài)、常溫下呈固態(tài)的特性，可以模擬土壤環(huán)境進(jìn)行殺線蟲劑 的篩選，將線蟲可在放有寄主的普朗尼克F127中有效完成迀移、侵入、發(fā)育等過程；與傳統(tǒng) 的浸漬法相比，本發(fā)明方法能夠綜合評(píng)價(jià)待測(cè)藥劑對(duì)線蟲的致死作用，以及對(duì)線蟲的活動(dòng) 能力與侵入能力的抑制作用，篩選準(zhǔn)確度高，可靠性強(qiáng)。（2)本發(fā)明方法所用的甘薯莖以及 馬鈴薯腐爛莖線蟲易于在室內(nèi)擴(kuò)繁，材料易得，適宜大量藥劑篩選。（3)本發(fā)明方法以植物 寄生線蟲馬鈴薯腐爛莖線蟲為測(cè)試對(duì)象，由于植物寄生線蟲與腐生線蟲在食性與生活史上 具有較大差異，因此，與以傳統(tǒng)的秀麗小桿線蟲（Caenorhabditiselegans)為測(cè)試對(duì)象相 比，其結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 實(shí)施例1利用普朗尼克F127和甘薯莖篩選殺線蟲劑對(duì)比試驗(yàn)
[0025] (一）、試驗(yàn)設(shè)計(jì)：選用常規(guī)殺線蟲劑80%涕滅威（山東華陽(yáng)農(nóng)藥化工集團(tuán)有限公 司）、95%阿維菌素（河北威遠(yuǎn)生化農(nóng)藥有限公司）、90%丁硫克百威（江蘇嘉隆化工有限 公司）為供試化學(xué)藥劑，以不添加藥劑的處理作為對(duì)照。
[0026](二）、試驗(yàn)方法：
[0027] (1)、將35g普朗尼克F127放入IOOml蒸餾水中，置于4°C低溫下過夜溶解，得普朗 尼克F127母液。
[0028] (2)、用蒸餾水將馬鈴薯腐爛莖線蟲（Ditylenchusdestructor)配制成100頭/mL 的液體，得線蟲液。
[0029] (3)、將80%涕滅威、95%阿維菌素、90%丁硫克百威原藥3種藥劑分別用丙酮溶 解，然后用水稀釋成重量體積比為l〇g/L的母液。
[0030] (4)、用質(zhì)量百分比為0. 1%的吐溫80分別將步驟（3)所得的涕滅威、阿維菌素、 丁硫克百威母液進(jìn)行梯度稀釋，然后和步驟（2)所得的線蟲液一起分別加入到步驟（1)所 得的普朗尼克F127母液中，使普朗尼克F127的終濃度為為23% (質(zhì)量百分比），使線蟲含 量為50條/mL，使涕滅威、阿維菌素、丁硫克百威的濃度分別為320、160、80、40、20和IOug/ ml;以不添加藥劑的處理作為對(duì)照；緩慢振蕩混勾，并向每個(gè)9cm培養(yǎng)皿倒入20ml，室溫下 放置48h;
[0031] (5)、在培養(yǎng)皿中央插入長(zhǎng)度為L(zhǎng)Ocm的甘薯莖段，測(cè)試品種為冀薯98,25°C黑暗 培養(yǎng)箱內(nèi)放置72h;然后將甘薯莖段取出，采用淺盤法分離其中的線蟲，計(jì)數(shù)，根據(jù)藥劑處 理與對(duì)照處理的侵入線蟲數(shù)量計(jì)算不同藥劑處理對(duì)線蟲侵入的防治效果；防治效果的計(jì)算 公式為：
[0032] 防治效果（％) = (對(duì)照處理侵入線蟲數(shù)量-藥劑處理侵入線蟲數(shù)量）/對(duì)照處理 線蟲侵入量X100%
[0033] 浸漬法：將涕滅威、阿維菌素、丁硫克百威3種藥劑用丙酮溶解，然后用水稀釋成 重量百分比為l〇g/L的母液；再用質(zhì)量百分比為0. 1 %的吐溫80依次將各藥劑稀釋成320、 160、80、40、20和101^/1111，以不添加藥劑的處理作為對(duì)照處理，加入到9〇11培養(yǎng)皿中，并添 加線蟲液混勻，使得線蟲數(shù)量為50條/mL。25°C黑暗恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)放置5d，檢查不同處理 的線蟲數(shù)量，并依據(jù)藥劑處理與對(duì)照處理的死亡率，計(jì)算防治效果。
[0034] 結(jié)果（見表1)采用冀薯98(感病品種）為線蟲寄主，在所有藥劑濃度處理中本發(fā) 明方法獲得的防效均高于浸漬法；此外，兩種方法均顯示阿維菌素對(duì)線蟲的毒力最高，在相 同濃度處理?xiàng)l件下其防效顯著高于涕滅威和丁硫克百威。上述結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明方法所得篩 選結(jié)果比浸漬法所更靈敏，更準(zhǔn)確。
[0035] 表1不同測(cè)試方法對(duì)不同藥劑濃度防效的試驗(yàn)結(jié)果
[0036]

【權(quán)利要求】
1. 一種利用普朗尼克F127和甘薯莖篩選殺線蟲劑的方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 、按照質(zhì)量百分比為20?40%的比例將普朗尼克F127放入蒸餾水中，置于0?6°C 低溫下過夜溶解，得普朗尼克F127母液； (2) 、用蒸餾水將馬鈴薯腐爛莖線蟲（Ditylenchus destructor thorne)配制成10? 1000頭/mL的液體，得線蟲液； (3) 、依據(jù)待測(cè)藥劑的極性用丙酮或水將待測(cè)藥劑溶解，然后用水稀釋為質(zhì)量體積比為 1?20g/L的待測(cè)藥劑溶液； (4) 、用質(zhì)量百分比為0. 1 %的吐溫80對(duì)步驟（3)所得的待測(cè)藥劑溶液進(jìn)行梯度稀釋， 然后和步驟（2)所得的線蟲液一起加入到步驟（1)所得的普朗尼克F127母液中，使普朗尼 克F127的終濃度為18?30% (質(zhì)量百分比），使線蟲液的含量為5?100條/mL ;緩慢振 蕩混勻，并倒入9cm培養(yǎng)皿中，室溫下放置48?72h ; (5) 、在培養(yǎng)皿中央插入長(zhǎng)度為0. 5?2. 0cm的甘薯莖段，室溫下培養(yǎng)3?15d，然后將 甘薯莖段取出，采用淺盤法分離其中的線蟲，計(jì)數(shù)；以不添加藥劑處理為對(duì)照；計(jì)算待測(cè)藥 劑的防治效果，在待測(cè)藥劑的防治效果大于20%時(shí)，即說(shuō)明待測(cè)藥劑在該測(cè)試濃度下對(duì)線 蟲具有活性； 防治效果（％) = (對(duì)照處理侵入線蟲數(shù)量-藥劑處理侵入線蟲數(shù)量）/對(duì)照處理侵入 線蟲數(shù)量X100%。
2. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其步驟（1)中所述的低溫為0?4°C。
3. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其步驟（3)中所述的待測(cè)藥劑是指化學(xué)藥 劑或生物代謝產(chǎn)物。
4. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其步驟（4)中所述的普朗尼克F127的質(zhì)量 百分比為23%。
5. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其步驟（4)或（5)中所述的室溫為20? 30。。。
6. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其步驟（4)中所述的放置時(shí)間為48h。
7. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其步驟（5)中所述的甘薯莖段長(zhǎng)度為 1. 0cm〇
8. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其步驟（5)中所述的培養(yǎng)時(shí)間為5d。
【文檔編號(hào)】G01N33/00GK104483447SQ201410697113
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月26日
【發(fā)明者】王容燕, 陳書龍, 李秀花, 高波, 馬娟 申請(qǐng)人:河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所