一種利用離體葉片失綠進程快速鑒定水稻耐鎘能力的方法
【專利摘要】一種利用離體葉片失綠進程快速鑒定水稻耐鎘能力的方法，將水稻離體葉片剪成長3cm的小段，置于不同濃度的CdCl2溶液中浸泡3-5天以提高鎘離子進入葉片的滲透能力，然后依據(jù)葉片失綠情況，準確地判斷水稻的耐鎘能力，葉片失綠程度大的，葉片細胞受害嚴重，葉綠素含量低，耐鎘能力差；葉片失綠程度小的，葉片細胞受害較輕，葉綠素喪失速率慢，耐鎘能力強。本發(fā)明的優(yōu)點是：該方法以水稻葉片的失綠進程為依據(jù)，只需要少量的水稻葉片，利用較短的時間，迅速準確地鑒定出水稻的耐鎘能力，具有效率高、重復性好、費用低廉等優(yōu)點；根據(jù)鑒定提高優(yōu)良耐鎘基因型水稻的篩選效率，具有非常廣闊的應用前景。
【專利說明】一種利用離體葉片失綠進程快速鑒定水稻耐鎘能力的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術的植物檢測，特別涉及一種利用離體葉片失綠進程快速鑒定水稻耐鎘能力的方法。

【背景技術】
[0002]近年來，由于長期污灌、大量施用富鎘磷肥、農藥等原因，農田鎘(Cd)污染日益嚴重。據(jù)報道，我國農田重金屬Cd污染面積已達2X 104hm2，每年生產Cd含量超標的農產品達14.6X108kg，且有日益增加的趨勢。
[0003]水稻是中國種植面積最大的糧食作物，也是全球的主要糧食作物之一，過量的Cd在水稻的根、莖、葉以及籽粒中積累，不僅影響水稻產量、品質及整個農田生態(tài)系統(tǒng)，并可通過食物鏈更嚴重地危及動物和人類的健康。最早發(fā)現(xiàn)的“痛痛病”就是由于長期食用Cd污染的大米后引起的，其主要癥狀為腹脹，消化不良，背、腿疼痛，嚴重時會引起骨質疏松和多發(fā)性病理性骨折。因此，耐鎘基因型水稻的篩選變得尤為重要。
[0004]水稻受Cd毒害后，癥狀最先表現(xiàn)在植株根部，根系逐漸變粗，表面呈紅棕色，葉片失綠、植株矮化，老葉葉尖干枯死亡，并隨Cd處理濃度的提高，毒害癥狀加重。所以，對水稻的耐鎘能力主要是通過比較其存活率、相對生長量等進行直接的篩選鑒定。但是水稻生長期長，評價生長性狀、生長期等需要的時間較長，費時費力、誤差大、效率低，而且受環(huán)境因素的影響較大，準確性差。
[0005]在Cd溶液中，水稻根系吸收的鎘離子運送到地上部分，在葉片中進行積累，積累到一定程度后破壞了葉片的膜系統(tǒng)和葉綠體結構，使葉綠素含量下降，最后導致葉片細胞死亡，從而出現(xiàn)葉片失綠，逐漸變黃的現(xiàn)象。如果把水稻葉片直接放在鎘溶液中，鎘離子可以通過葉片切口直接進入葉片細胞，從理論上講也會對葉片細胞造成傷害，破壞葉綠體結構，出現(xiàn)葉片失綠、葉綠素含量降低。在相同的鎘脅迫環(huán)境中，耐鎘基因型的葉片失綠情況和不耐鎘的基因型有明顯的區(qū)別。


【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對上述技術分析和存在問題，提供一種利用離體葉片失綠進程快速鑒定水稻耐鎘能力的方法，該鑒定方法所需材料極少且測定周期短，工作效率極高，具有顯著的經濟技術效果。
[0007]本發(fā)明的技術方案:
一種利用離體葉片失綠進程快速鑒定水稻耐鎘能力的方法，將水稻離體葉片剪成長3cm的小段，置于不同濃度的CdCl2溶液中浸泡以提高鎘離子進入葉片的滲透能力，浸泡時間為3-5天，然后依據(jù)葉片失綠情況，準確地判斷水稻的耐鎘能力，葉片失綠程度大的，葉片細胞受害嚴重，葉綠素含量低，耐鎘能力差；葉片失綠程度小的，葉片細胞受害較輕，葉綠素喪失速率慢，耐鎘能力強。
[0008]所述CdCl2溶液中，鎘離子濃度為0、0.1,0.5、1.0mg/L。
[0009]本發(fā)明的工作機理:
耐鎘能力不同的水稻基因型，其離體葉片吸收積累鎘離子的速率有顯著差異，細胞抵抗鎘離子生理毒害的能力也明顯不同，綜合反映為鎘溶液中離體葉片的失綠進程有很大的差異。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點是:
該鑒定方法以水稻葉片的失綠進程為依據(jù)，只需要少量的水稻葉片，且不受水稻大小的限制，利用較短的時間，迅速準確地鑒定出水稻的耐鎘能力，具有效率高、重復性好、費用低廉等優(yōu)點；根據(jù)鑒定結果淘汰大量不耐鎘的基因型，可以有效地壓縮田間試驗的規(guī)模，節(jié)約時間和人力，大幅度提聞優(yōu)良耐鋪基因型水稻的篩選效率，加快耐鋪水稻育種的步伐；該鑒定方法對其他植物耐鎘潛力的快速鑒定具有重要參考價值，具有非常廣闊的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為脅迫5天時離體葉片的失綠速度與溶液中鎘離子濃度的關系圖。

【具體實施方式】
[0012]實施例:
一種利用離體葉片失綠進程快速鑒定水稻耐鎘能力的方法，將水稻離體葉片剪成長3cm的小段，先在稀釋100萬倍的商用三硅氧烷表面活性劑中浸泡lmin，用去離子水沖洗三次后，置于含有0,0.1,0.5、1.0、5、10、20、30、50mg/L Cd2+的CdCl 2溶液中置于不同濃度的CdCl2溶液中浸泡5天以提高鎘離子進入葉片的滲透能力，然后依據(jù)葉片失綠情況，準確地判斷水稻的耐鎘能力。葉片失綠程度大的，葉片細胞受害嚴重，葉綠素含量低，耐鎘能力差；葉片失綠程度小的，葉片細胞受害較輕，葉綠素喪失速率慢，耐鎘能力強。通過該方法可以淘汰大量不耐鎘的基因型，實現(xiàn)耐鎘基因和高產優(yōu)質基因的結合，加速耐鎘水稻新品種的選育。
[0013]實驗研究:
I)根據(jù)梯度試驗確定水稻葉片失綠速度的鎘濃度和表面活性劑:
將水稻葉片用剪刀剪成長3cm的小段，在表面活性劑中進行預處理后，分別置于含有
0、0.1、0.5、1.0、5、10、20、30、50mg/L Cd2+ 的 CdCl2 溶液中，5d 后觀測其葉片失綠情況。Cd濃度越高，相同處理時間內的葉片失綠情況越嚴重。濃度大于lmg/L時，由于濃度過高，葉片細胞死亡，葉片呈棕褐色；濃度小于等于lmg/L時，水稻葉片出現(xiàn)不同程度的失綠，但現(xiàn)象并不明顯。因此，我們把0.1、0.5、1.0mg/L作為CdClJA迫的鎘濃度。因為擴展劑作為新一代農用噴霧助劑，具有顯著增大擴展面積，促進離子吸收的作用。
[0014]2)根據(jù)梯度試驗確定擴展劑的濃度和浸泡時間:
將水稻葉片用剪刀剪成長3cm的小段，分別在稀釋倍數(shù)為5000、5000X10、5000X100、5000X200倍的表面活性劑中浸泡lmin、5min、10min，5天后觀測其葉片失綠情況。在稀釋5000-500000倍的表面活性劑中浸泡5-10min后，T705葉片在Omg/L的鎘溶液中處理5天，出現(xiàn)了明顯的變黃現(xiàn)象，說明該濃度的表面活性劑對葉片細胞的傷害比較大；在稀釋100000倍的表面活性劑中浸泡Imin后，在Omg/L的鎘溶液中處理5天，T705葉片仍然保持鮮綠，說明稀釋100萬倍的表面活性劑為不會對T705水稻葉片造成傷害。
[0015]3)水稻葉片失綠程度臨界鎘脅迫時間的確定:
將水稻葉片用剪刀剪成長3 cm的小段，經100萬倍表面活性劑預處理Imin后，置于含有0.1、0.5、1.0 mg/L Cd2+的CdCl2溶液中，每天觀測其葉片失綠情況。脅迫3天后，葉片失綠程度較輕；脅迫時間越長，相同濃度處理內的葉片失綠情況越嚴重。處理5天，X24水稻葉片出現(xiàn)嚴重失綠，而且對時間長短的靈敏性較低，可重復性較好；耐鎘品種的葉片失綠程度較輕。因此，我們把處理5天作為CdCl2脅迫的臨界時間。
[0016]4)葉片失綠與耐鎘性的相關性研究:
葉片失綠進程快速鑒定水稻耐鎘潛力的試驗結果表明，在含有0.1-0.5 mg/L的CdCl2溶液中放置5天，耐鎘品種T705的葉片失綠程度與對照沒有明顯差異，只有放在l.0mg/LCdCl2溶液中的葉片明顯變黃。但是，鎘敏感品種X24的離體葉片，在0.1-1.0 mg/L的CdCl2溶液中放置5天后，葉片全部變黃，溶液中的鎘離子濃度越高，葉片的失綠程度越嚴重。說明水稻的耐鋪能力和尚體葉片的耐鋪能力聞度相關，用含0.1、0.5、1.0 mg/L的CdCl2溶液進行處理，通過觀察葉片失綠程度，能快速、準確地篩選出耐鎘水稻。
[0017]根據(jù)上述研究結果實施的試驗實例:
實驗材料為湖南廣泛種植早熟秈稻品種，其中T優(yōu)705為雜交品種，耐鎘能力強；湘早秈24為常規(guī)品種，對鎘比較敏感。
[0018]以生長兩個月的T705和X24水稻為材料，取新鮮翠綠無病害的全展葉，用去離子水沖洗兩次，用剪刀剪成長3cm的小段，經100萬倍表面活性劑預處理Imin后，置于含有
0.0.1,0.5,1.0 mg/L的CdCl2溶液中，5天后觀測其葉片失綠情況。在含有0，0.1，0.5，
1.0 mg/L的CdCl2溶液中放置5天，耐鎘品種T705的葉片失綠程度不明顯，而X24水稻葉片失綠程度嚴重，葉片變黃，葉綠素含量顯著降低。說明含有0，0.1，0.5，1.0 mg/L Cd2+的CdCl2溶液能夠把耐鋪能力不冋的水稻品種鑒別出來。
[0019]圖1為脅迫5天時離體葉片的失綠速度與溶液中鎘離子濃度的關系圖，圖中表明:在含有0,0.1,0.5，1.0mg/L Cd2+的CdCl 2溶液中放置5天，耐鎘品種T705的葉片失綠程度不明顯，僅在1.0mg/L的鎘溶液中局部失綠；鎘敏感品種X24葉片失綠明顯，在0.1mg/L的鎘溶液中已經開始失綠，且隨Cd2+濃度的增大葉片失綠越嚴重。放置5d后，耐鎘品種T705僅在0.5和1.0mg/L的鎘溶液中有一定程度的失綠，但X24葉片在0.1-1.0mg/L鎘溶液中的失綠更加嚴重。該實驗說明水稻的耐鎘能力和葉片的耐鎘能力高度相關，用100萬倍的表面活性劑和含有0，0.1,0.5，1.0mg/L Cd2+的CdCl 2溶液進行處理，通過觀察葉片失綠程度，能快速準確地篩選出耐鎘水稻品種。
【權利要求】
1.一種利用離體葉片失綠進程快速鑒定水稻耐鎘能力的方法，其特征在于:將水稻離體葉片剪成長3cm的小段，置于不同濃度的CdCl2溶液中浸泡以提高鎘離子進入葉片的滲透能力，浸泡時間為3-5天，然后依據(jù)葉片失綠情況，準確地判斷水稻的耐鎘能力，葉片失綠程度大的，葉片細胞受害嚴重，葉綠素含量低，耐鎘能力差；葉片失綠程度小的，葉片細胞受害較輕，葉綠素喪失速率慢，耐鎘能力強。
2.根據(jù)權利要求1所述利用離體葉片失綠進程快速鑒定水稻耐鎘能力的方法，其特征在于:所述CdCl2溶液中，鎘離子濃度為0,0.1,0.5、1.0mg/L。
【文檔編號】G01N21/78GK104458715SQ201410651772
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月17日 優(yōu)先權日:2014年11月17日
【發(fā)明者】高子平, 劉仲齊, 趙靜, 張長波 申請人:農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所