制作納米鉑和多壁碳納米管修飾的玻碳電極及利用該電極檢測(cè)雌二醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種制作納米鉑和多壁碳納米管修飾的玻碳電極的方法包括以下步驟：步驟1，將多壁碳納米管在酸性溶液中進(jìn)行超聲處理；步驟2，將步驟1處理過(guò)的多壁碳納米管分散在乙二醇水溶液中，經(jīng)超聲至分散均勻得到多壁碳納米管溶液；步驟3，將裸玻碳電極在氧化鋁粉上拋光，然后依次在無(wú)水乙醇和水中超聲處理；步驟4，將步驟2得到的多壁碳納米管溶液，滴涂在步驟3處理過(guò)的裸玻碳電極的表面并干燥，得到多壁碳納米管修飾玻碳電極；步驟5，將步驟4處理的多壁碳納米管修飾玻碳電極置于氯鉑酸水溶液中進(jìn)行恒電位沉積，獲得納米鉑和多壁碳納米管修飾的玻碳電極。本發(fā)明可以提高雌二醇的響應(yīng)信號(hào)，提高對(duì)雌二醇檢測(cè)的可靠性。
【專利說(shuō)明】制作納米鉑和多壁碳納米管修飾的玻碳電極及利用該電極檢測(cè)雌二醇的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物體內(nèi)雌二醇檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種制作納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極及利用該電極檢測(cè)雌二醇的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]雌二醇(17 β-estrad1l)作為一種重要的自然甾體類雌激素(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)，參與許多生理活動(dòng)，并在生殖功能中起著重要作用，因此被廣泛應(yīng)用于治療中。在臨床分析中，血清和尿液中雌二醇的含量是作為評(píng)估絕經(jīng)期，雄激素過(guò)多癥，乳腺癌等的重要指標(biāo)。近些年來(lái)，雌二醇在治療中的使用量逐年增加，以至于在生態(tài)環(huán)境中也能檢測(cè)到。然而，雌二醇的過(guò)量使用會(huì)造成許多副作用，低濃度(PPt?ppb)的雌二醇也會(huì)影響體液和細(xì)胞免疫系統(tǒng)的紊亂，導(dǎo)致生殖、免疫、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等的許多病變。因此，簡(jiǎn)單、快速、可靠地檢測(cè)雌二醇的含量對(duì)國(guó)土安全和衛(wèi)生防護(hù)至關(guān)重要。
[0003]目前，對(duì)雌二醇的檢測(cè)已有的文獻(xiàn)報(bào)道有分光光度法，液相色譜法，氣相色譜法，免疫分析法，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。這些方法中，有的儀器價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，需要復(fù)雜的前處理或者需要運(yùn)用一些化學(xué)計(jì)量學(xué)算法的輔助，多難以實(shí)現(xiàn)基層單位普及。而電化學(xué)方法則因其儀器簡(jiǎn)單，設(shè)備價(jià)格低，污染小，較好的靈敏度且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化而備受關(guān)注。但在電化學(xué)方法中，已報(bào)道檢測(cè)雌二醇的文獻(xiàn)并不多。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種制作納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極及利用該電極檢測(cè)雌二醇的方法，本發(fā)明可以提高雌二醇的響應(yīng)信號(hào)，提高對(duì)雌二醇檢測(cè)的可靠性。
[0005]解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下:
[0006]制作納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0007]步驟1，將多壁碳納米管在酸性溶液中進(jìn)行超聲處理后，用水洗滌后烘干；
[0008]步驟2，將步驟I處理過(guò)的多壁碳納米管分散在乙二醇水溶液中，經(jīng)超聲至分散均勻得到多壁碳納米管溶液；
[0009]步驟3，將裸玻碳電極在氧化鋁粉上拋光，然后依次在無(wú)水乙醇和水中超聲處理后，用水沖洗并吹干；
[0010]步驟4，將步驟2得到的多壁碳納米管溶液，滴涂在步驟3處理過(guò)的裸玻碳電極的表面并干燥，得到多壁碳納米管修飾玻碳電極；
[0011]步驟5，將步驟4處理的多壁碳納米管修飾玻碳電極置于氯鉬酸水溶液中進(jìn)行恒電位沉積后，用水沖洗電極表面并吹干，獲得納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極。
[0012]優(yōu)選地，步驟I中，所述多壁碳納米管是在1:1的濃硫酸和濃硝酸中超聲處理4_5h0
[0013]優(yōu)選地，步驟2中，是將2mg的多壁碳納米管分散在ImL的乙二醇水溶液中。
[0014]優(yōu)選地，步驟3中，是將裸玻碳電極在0.05 μ m的氧化鋁粉上拋光，然后依次在無(wú)水乙醇和水中超聲lmin。
[0015]優(yōu)選地，步驟4中，是將4-12 μ L的多壁納米管溶液滴涂在步驟3處理過(guò)的裸玻碳電極的表面。
[0016]優(yōu)選地，步驟5中，是將多壁碳納米管修飾玻碳電極置于lmmol/L的氯鉬酸中進(jìn)行恒電位沉積3min。
[0017]利用納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極檢測(cè)雌二醇的方法，包括以下步驟:
[0018]步驟1，將雌二醇溶液加入到含有緩沖溶液的電解池中，開(kāi)路狀態(tài)下攪拌富集l-4min,電化學(xué)工作站輸出OV至IV的電壓加載至納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極上，通過(guò)納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極對(duì)電解池中的溶液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描；
[0019]步驟2，向等待檢測(cè)樣品添加雌二醇溶液后，將等待檢測(cè)樣品與雌二醇溶液的混合體加入到含有緩沖溶液的電解池中，開(kāi)路狀態(tài)下攪拌富集l_4min，電化學(xué)工作站輸出OV至IV的電壓加載至納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極上，通過(guò)納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極對(duì)電解池中的溶液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描。
[0020]優(yōu)選地，還包括步驟3，每次檢測(cè)之前和之后，均將納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極置于空白的緩沖溶液中進(jìn)行伏安掃描，從而使納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極再生。
[0021]優(yōu)選地，步驟I和步驟2中的緩沖溶液中的電解質(zhì)為B-R、PBS、Tris_HCl、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液、KCl。
[0022]優(yōu)選地，所述伏安掃描的掃速為0.lV/s。
[0023]采用了上述方案，本發(fā)明建了納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極，并采用此電極對(duì)雌二醇的電化學(xué)行為進(jìn)行了研究。碳納米管(CNTs)具有獨(dú)特的幾何結(jié)構(gòu)，良好的電化學(xué)穩(wěn)定性，較強(qiáng)的導(dǎo)電性，大的比表面積，一定的電催化活性等優(yōu)點(diǎn)，廣泛地應(yīng)用在電化學(xué)領(lǐng)域。納米鉬(platium nanoparticles, PtNPs)具有良好的電催化性質(zhì)和大的比表面積，是許多領(lǐng)域中常用的催化劑，如燃料電池、傳感器和汽車(chē)工業(yè)。因此將二者復(fù)合在一起形成復(fù)合修飾電極將提高雌二醇的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)，從而提高雌二醇檢測(cè)的靈敏度。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的方法檢測(cè)雌二醇的線性范圍為0.06-10 μ mo I I71，檢出限為I Onmo I Γ1。因此，納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極成功地應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，且不需要對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，因此該納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極具有較好的應(yīng)用潛力。
[0024]下面，結(jié)合到具體實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)過(guò)程以及結(jié)論，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)地說(shuō)明。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為雌二醇的結(jié)構(gòu)式；
[0026]圖2為不同電極在lmmol T1K3Fe (CN)6(含0.1moir1KCl支持電解質(zhì))溶液中的循環(huán)伏安圖(掃速:0.IV S—1.)；
[0027]圖3為裸電極(曲線a)，MWCNTs/GCE修飾電極(曲線b)和Pt/MWCNTs/GCE修飾電極(曲線 C)在 5.0X10_3mol L^1Fe (CN)64^d: I)溶液中(含 0.1Omol L^iKCI)的阻抗圖.頻率范圍:10000-0.0lHz ；
[0028]圖4為雌二醇在不同電極上的循環(huán)伏安圖(支持電解質(zhì)為0.1mol L^1PBS (pH6.0)，雌二醇濃度為lX10_5mol ΙΛ掃速:0.1V s—1，沉積時(shí)間:3min)；
[0029]圖5為雌二醇在不同pH下的循環(huán)伏安疊加圖(從a到f:pH=3.0，4.0，5.0，6.0，
7.0,8.0.支持電解質(zhì):0.1Omol IZ1PBS ;掃速:0.1OV s—1.插圖表示的是電位Epa和pH的關(guān)系圖)；
[0030]圖6為雌二醇在Pt/MWCNTs/GCE電極上不同掃速的循環(huán)伏安疊加圖(從a到f:
0.050,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30V s' 插圖:峰電流 ipa 和掃速 v 的關(guān)系圖)；
[0031]圖7為雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線疊加圖(從a到g:6X10_8mol L_\6X 10_7mol ?ΛlXl(T6mol ?Λ?Χ1(Γ6πιο1 ?Λ5Χ1(Γ6πιο1 ?Λ9Χ1(Γ6πιο1 L'lXlO^nol L—1.插圖:峰電流和雌二醇濃度的線性關(guān)系曲線)；
[0032]圖8為雌二醇在Pt/MWCNTs/GCE電極上發(fā)生氧化反應(yīng)的反應(yīng)機(jī)理；

【具體實(shí)施方式】
[0033]本發(fā)明所用到的試劑及儀器如下:
[0034]多壁碳納米管(MWCNTs，純度> 95% )購(gòu)于深圳市納米港有限公司；氯鉬酸(H2PtCl6)購(gòu)于上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；雌二醇(分析純)購(gòu)于阿拉丁試劑(上海)有限公司。其它試劑均為分析純，0.1mol L—1的磷酸緩沖溶液(PBS)，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水，雌二醇的儲(chǔ)備液(無(wú)水乙醇溶)為lmmol L—1，乙二醇(分析純)。
[0035]RST5000電化學(xué)工作站(蘇州瑞斯特儀器有限公司)；三電極體系:飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，Pt絲為對(duì)電極，玻碳電極(GCE)工作電極。交流阻抗的測(cè)定條件:
0.005-100kHz，交流電壓幅度5mV。所有的pH值由PHS-3C精密pH計(jì)調(diào)節(jié)(上海雷磁設(shè)備廠)，每天在使用之前用標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液校準(zhǔn)。樣品:雞肉，牛肉，豬肉，牛奶，尿樣(懷孕婦女的)，血漿(大鼠)。
[0036]制作納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極的方法，包括以下步驟:
[0037]步驟1，將多壁碳納米管在酸性溶液中進(jìn)行超聲處理后，用水洗滌后烘干；步驟I中，所述多壁碳納米管是在1:1的濃硫酸和濃硝酸中超聲處理4_5h。
[0038]步驟2，將步驟I處理過(guò)的多壁碳納米管分散在乙二醇水溶液中，經(jīng)超聲至分散均勻得到多壁碳納米管溶液；步驟2中，是將2mg的多壁碳納米管分散在ImL的乙二醇水溶液中。
[0039]步驟3，將裸玻碳電極在氧化鋁粉上拋光，然后依次在無(wú)水乙醇和水中超聲處理后，用水沖洗并吹干；步驟3中，是將裸玻碳電極在0.05 μ m的氧化鋁粉上拋光，然后依次在無(wú)水乙醇和水中超聲lmin。
[0040]步驟4，將步驟2得到的多壁碳納米管溶液，滴涂在步驟3處理過(guò)的裸玻碳電極的表面并干燥，得到多壁碳納米管修飾玻碳電極；步驟4中，是將4-12 μ L的多壁納米管溶液滴涂在步驟3處理過(guò)的裸玻碳電極的表面。
[0041]步驟5，將步驟4處理的多壁碳納米管修飾玻碳電極置于氯鉬酸中進(jìn)行恒電位沉積后，用水沖洗電極表面并吹干，獲得納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極。步驟5中，是將多壁碳納米管修飾玻碳電極置于lmmol/L的氯鉬酸水溶液中進(jìn)行恒電位沉積3min。
[0042]實(shí)施例1:
[0043]將多壁碳納米管(MWCNTs)在1:1濃硫酸和濃硝酸中超聲4h，將黑色懸濁液過(guò)濾，用水洗滌至中性，放入60°C烘箱中烘干。然后將2mg酸化處理的多壁碳納米管(MWCNTs)分散在ImL乙二醇水溶液中(乙二醇與水的比例為1:1)，超聲至分散均勻。
[0044]將裸玻碳電極在0.05 μ m氧化鋁粉上拋光，然后依次在無(wú)水乙醇和水中超聲I分鐘。用水沖洗，之后氮?dú)獯蹈?。?yL的多壁碳納米管溶液(2mg L—1)滴涂在玻碳電極表面，紅外燈下干燥。之后，用水沖洗電極表面，移除松散吸附的MWCNTs和灰塵，將電極置于Immol Γ1的氯鉬酸(H2PtCl6)水溶液中，恒電位沉積3min(電位為-0.9V vs SCE)，用水再次沖洗電極表面，氮?dú)獯蹈?，獲得納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極(PtNPs/MWCNTs/GCE)。
[0045]實(shí)施例2:
[0046]多壁碳納米管(MWCNTs)在1:1濃硫酸和濃硝酸中超聲4.5h，將10 μ L的多壁碳納米管溶液(2mg L—1)滴涂在玻碳電極表面，其余工藝與實(shí)施例1相同。
[0047]實(shí)施例3:
[0048]多壁碳納米管(MWCNTs)在1:1濃硫酸和濃硝酸中超聲5h，將12 μ L的多壁碳納米管溶液(2mg L-1)滴涂在玻碳電極表面，其余工藝與實(shí)施例1相同。除了以上實(shí)施方式夕卜，對(duì)各種電極進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn):
[0049]為了深入了解每層修飾材料在電極響應(yīng)中的作用，選擇Immol Γ1鐵氰化鉀(K3Fe (CN)6)(含0.1mol T1KCl支持電解質(zhì))溶液作為探針來(lái)研究其在不同電極上的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。如圖2所示，該循環(huán)伏安疊加圖比較了裸電極(GCE)、多壁碳納米管修飾電極(MWCNTs/GCE)、納米鉬和多壁碳納米管修飾和玻碳電極(Pt/MWCNTs/GCE)對(duì)鐵氰化鉀的響應(yīng)情況。在裸電極上發(fā)現(xiàn)一對(duì)很好的可逆氧化還原峰，當(dāng)電極表面覆蓋了多壁碳納米管之后，氧化還原峰的峰電流明顯增加，且峰電位差變小(裸電極的峰電位差為85mV，而多壁碳納米管的峰電位差為70mV)。碳納米管具有大的比表面積，可顯著增加電極的有效面積，提高峰電流。同時(shí)碳納米管亦具有電催化活性，可有效提高氧化還原的效率。經(jīng)電沉積納米鉬之后，在碳納米管的外部又覆蓋了一層納米鉬，氧化還原峰電流進(jìn)一步增加，且降低了背景電流，這可歸功于納米鉬優(yōu)良的催化性質(zhì)和大的比表面積，進(jìn)一步增加電極的有效面積，提聞峰電流。
[0050]電極表面的修飾情況可進(jìn)一步采用電化學(xué)交流阻抗譜進(jìn)行表征。圖3顯示了裸電極(曲線a)、多壁碳納米管修飾電極(MWNCTs/GCE)(曲線b)、納米鉬和多壁碳納米管修飾和玻碳電極(PtNPs/MWCNTs/GCE)(曲線 c)在 5mmol Γ1 的 K3Fe (CN) 6/K4Fe (CN) 6 (1:1)(含
0.2mol L—1的KCl溶液)的阻抗奈奎斯特(Nyquist)圖。裸電極的交流阻抗圖包括高頻的圓弧部分和低頻的直線部分。高頻部分由動(dòng)力學(xué)控制，裸電極的圓弧部分較小，說(shuō)明電子轉(zhuǎn)移速度較快。當(dāng)電極表面修飾有多壁碳納米管(MWNCTs)或納米鉬和多壁碳納米管(PtNPs/MWCNTs)時(shí)，高頻部分幾乎變成直線，這說(shuō)明修飾有多壁碳納米管(MWNCTs)或納米鉬和多壁碳納米管(PtNPs/MWCNTs)的電極電阻較裸電極變小。這可能是因?yàn)镸WCNTs和PtNPs都具有大的比表面積，加快了反應(yīng)速率，使電極的電阻比裸電極的還要小。修飾電極的交流阻抗譜的變化也證實(shí)了修飾材料已經(jīng)附著在了電極表面。
[0051]將各種電極對(duì)雌二醇的電化學(xué)氧化特征進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)及分析:
[0052]將不同電極浸入雌二醇濃度為lX10_5mol L—1的磷酸緩沖溶液(0.1mol L—1，PH6.0)中，結(jié)果見(jiàn)圖4。雌二醇在裸電極上的響應(yīng)信號(hào)十分微弱，這是由于雌二醇并不能很好的吸附在電極表面，且裸電極的有效面積很小，以至于單獨(dú)的裸電極對(duì)雌二醇響應(yīng)信號(hào)并不好。當(dāng)多壁碳納米管修飾在電極表面時(shí)，碳納米管與碳納米管之間的空隙有利于雌二醇更好的吸附在電極上，碳納米管較大的比表面積顯著增加了電極的有效面積，從而使雌二醇的響應(yīng)信號(hào)大幅度提高，大約是裸電極的24倍。而Pt/MWCNTs/GCE電極對(duì)雌二醇的響應(yīng)號(hào)又有了進(jìn)一步的提聞，納米鉬不僅具有大的比表面積，能有效富集雌_■醇，同時(shí)具有優(yōu)良的電催化性質(zhì)，和多壁碳納米管復(fù)合組成的復(fù)合電極對(duì)雌二醇的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)大約是裸電極的38倍。從圖中可知，雌二醇的在電極上的響應(yīng)只有一個(gè)氧化峰沒(méi)有還原峰，因此雌二醇的電化學(xué)反應(yīng)是不可逆反應(yīng)。
[0053]通過(guò)上述方法得到的電極，本發(fā)明利用納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極檢測(cè)雌二醇的方法，包括以下步驟:
[0054]步驟1，將雌二醇溶液加入到含有緩沖溶液的電解池中，開(kāi)路狀態(tài)下攪拌富集l-4min,電化學(xué)工作站輸出OV至IV的電壓加載至納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極上，通過(guò)納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極對(duì)電解池中的溶液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描。驟I中的緩沖溶液中的電解質(zhì)為B-R、PBS、Tris-HCl、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液、KCl。步驟I中，伏安掃描的掃速為0.lV/s。
[0055]步驟2，向等待檢測(cè)樣品添加雌二醇溶液后，將等待檢測(cè)樣品與雌二醇溶液的混合體加入到含有緩沖溶液的電解池中，開(kāi)路狀態(tài)下攪拌富集l_4min，電化學(xué)工作站輸出OV至IV的電壓加載至納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極上，通過(guò)納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極對(duì)電解池中的溶液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描。步驟2中的緩沖溶液中的電解質(zhì)為8^83、1^8-!1(:1、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液、1((:1。步驟2中，伏安掃描的掃速為0.1V/
So
[0056]步驟3，每次檢測(cè)之前和之后，均將納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極置于空白的緩沖溶液中進(jìn)行伏安掃描，從而使納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極再生。
[0057]實(shí)施例1:
[0058]步驟I，取Immol Γ1雌二醇溶液加入到含有5mLPBS (磷酸緩沖溶液)的電解池中，開(kāi)路狀態(tài)下攪拌富集180s，由電化學(xué)工作站輸出OV至IV (vs.SCE)的電壓加載至納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極上，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(掃速為0.1OV s—1)，每次測(cè)量之前和之后，都在空白的PBS中相同的電位范圍內(nèi)掃3圈，從而使電極再生。每次檢測(cè)之前和之后，均將納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極置于空白的PBS中相同的電位范圍進(jìn)行伏安掃描3圈，從而使納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極再生。所有的電化學(xué)實(shí)驗(yàn)均在室溫條件下進(jìn)行(大約25°C )。
[0059]步驟2，將雞肉置于10mL燒杯中，加50mL無(wú)水乙醇，用保鮮膜密封燒杯口，超聲2h，過(guò)濾，取其清液，放冰箱儲(chǔ)存(4°C)待用；向含雞肉清液中加入6 μ mo I I/1的雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液后，將含雞肉清液與雌二醇溶液的混合體加入到含有PBS的電解池中，開(kāi)路狀態(tài)下攪拌富集180s，由電化學(xué)工作站輸出OV至IV (vs.SCE)的電壓加載至納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極上，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(掃速為0.1OV s—1)，每次測(cè)量之前和之后，都在空白的PBS中相同的電位范圍內(nèi)掃3圈，從而使電極再生。每次檢測(cè)之前和之后，均將納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極置于空白的PBS中相同的電位范圍進(jìn)行伏安掃描3圈，從而使納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極再生。所有的電化學(xué)實(shí)驗(yàn)均在室溫條件下進(jìn)行(大約25°C )。
[0060]實(shí)施例2:
[0061]除了樣品選用牛肉外，對(duì)牛肉的前處理過(guò)程和其它過(guò)程與實(shí)施例1均相同。
[0062]實(shí)施例3:
[0063]除了樣品選用豬肉外，對(duì)豬肉的前處理過(guò)程和其它過(guò)程與實(shí)施例1均相同。
[0064]實(shí)施例4:
[0065]除了樣品選用牛奶，以及牛奶的前處理過(guò)程與實(shí)施例1不相同外，其余過(guò)程與實(shí)施例I均相同。牛奶的前處理過(guò)程為:取ImL牛奶與4mL乙腈混合后，4000r/min離心1min后，取上清液于離心管中，50°C下氮?dú)獯蹈芍馏w積小于0.1mL后加水5mL溶液，放冰箱儲(chǔ)存(40C )待用。
[0066]實(shí)施例5:
[0067]除了樣品選用尿樣，以及尿樣的前處理過(guò)程與實(shí)施例1不相同外，其余過(guò)程與實(shí)施例I均相同。尿樣的前處理過(guò)程為:過(guò)濾取其清液，放冰箱儲(chǔ)存(4°C )待用。
[0068]實(shí)施例6:
[0069]除了樣品選用血清(血清不需要前處理)，其余過(guò)程與實(shí)施例1均相同。
[0070]本發(fā)明的方法不局限于上述實(shí)施方式，例如，在實(shí)際的實(shí)施過(guò)程中，其開(kāi)路狀態(tài)下攪拌富集的時(shí)間還可以選擇為lmin、2min、4min。緩沖溶液還可以選擇B-R、Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷)、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液、KCl (氯化鉀)。
[0071]本發(fā)明的方法除了以上實(shí)施方式外，還進(jìn)行了如下分析或?qū)嶒?yàn):
[0072]1、支持電解質(zhì)和pH的影響
[0073]采用循環(huán)伏安法進(jìn)一步研究了不同支持電解質(zhì)和溶液pH對(duì)雌二醇測(cè)定的影響(掃速為0.1ViT1)。所選用的支持電解質(zhì)包括B-R、PBS、TriS-HCl、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(每種緩沖溶液的濃度均為0.1mol L—1，pH7.0)和KC1，根據(jù)峰形和峰電流大小，最終優(yōu)先選擇PBS作為支持電解質(zhì)。
[0074]溶液酸度對(duì)雌二醇的電極響應(yīng)具有重要影響。圖5為雌二醇(lX10_5mol L—1)于不同PH值下在納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極上響應(yīng)的疊加圖(pH3.0-8.0)。從圖中可以看出，隨著pH的增加，氧化峰的峰電位向負(fù)方向移動(dòng)，根據(jù)峰形和峰電流大小比較，最終確定PH6.0為該實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)pH值。峰電位與pH的關(guān)系成良好的線性相關(guān)，方程(圖5 的插圖)為 Epa(V) = 0.973-0.059pH(r = 0.9881)。dEpa/dpH 的斜率為 0.059V ρΓ1，這與理論值0.059V pr1相同，說(shuō)明雌二醇在該電極上參與反應(yīng)的H+和電子數(shù)相同。
[0075]2、滴涂量和電沉積時(shí)間的影響
[0076]隨著電極修飾材料滴涂量的增加(4 μ L到12 μ L)，即將多壁碳納米管溶液滴涂在裸玻碳電極的表面上，雌二醇的峰電流逐漸增加，到10 μ L時(shí)趨于穩(wěn)定，因此選擇10 μ L作為最佳滴涂量。滴涂量的增加引起碳納米管的量也逐漸增加，從而使電極的活化面積增加，并逐漸趨于穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)亦對(duì)納米鉬的電沉積時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。隨著電沉積時(shí)間的增加(lmin到4min),納米鉬數(shù)量增多，體積變大，響應(yīng)信號(hào)也隨之變大。到3min時(shí),峰電流趨于穩(wěn)定，因此電沉積3min作為該實(shí)驗(yàn)的最佳電沉積時(shí)間。
[0077]3、掃速和富集時(shí)間的影響
[0078]為了更好的研究雌二醇在電極上的反應(yīng)機(jī)理，對(duì)其不同掃速的變化進(jìn)行了測(cè)定。圖6為掃速?gòu)?.05V s—1到0.30V s—1的疊加圖。從圖6的插圖中可以看出，氧化峰電流與掃速成很好的線性關(guān)系，回歸方程為Ipa ( μ A) = 21.29+244.5v(V s—1) (r = 0.9953)。該結(jié)果說(shuō)明雌二醇在PtNPs/MWCNTs/GCE修飾電極上的電化學(xué)反應(yīng)為吸附控制。富集時(shí)間從Imin增加到4min,電流逐漸增加并在3min時(shí)趨向穩(wěn)定,最終選擇3min為最優(yōu)富集時(shí)間。
[0079]4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0080]差示脈沖伏安法(Differential pulse voltammetry, DPV)具有相對(duì)較高的靈敏度，因此采用該方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。首先對(duì)DPV相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，最終優(yōu)化結(jié)果:電位增量8mV，脈沖幅度70mV，脈沖周期100ms，脈沖寬度30ms。在一個(gè)相對(duì)較寬的濃度范圍內(nèi)采用Pt/MWCNTs/GCE電極對(duì)雌二醇進(jìn)行檢測(cè)(0.01-20.0 μ mo I Γ1)，最終確定線性范圍為
0.06-10.0 μ mo I L—1，相關(guān)的線性回歸方程(見(jiàn)圖 7)為 Ipa = 0.531+5.54c (Ipa, μ A ;c，μ mo IL-1 ；r = 0.9993)。根據(jù)LOD = 3.3 σ B/b方程，σ Β代表空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差，b代表標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的斜率，計(jì)算得出檢出限為10.0nmol L'
[0081]5、雌二醇在電極上反應(yīng)的一些動(dòng)力學(xué)參數(shù)
[0082]由前面的循環(huán)伏安圖可以發(fā)現(xiàn)，雌二醇在該修飾電極上的反應(yīng)為完全不可逆反應(yīng)，因此可以根據(jù)Laviron理論對(duì)于完全不可逆反應(yīng)的公式計(jì)算反應(yīng)中電子轉(zhuǎn)移數(shù):
「 I P ITO RT , RTks RT.
[0083]Enn =E--1n-- + ~-1nv
cmF anF anF
[0084]Epa是陽(yáng)極峰電位，E0是標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)極峰電位，η是電子轉(zhuǎn)移數(shù)，α是轉(zhuǎn)移系數(shù)，F(xiàn)是法拉第常數(shù)，T是溫度，ks是表觀速率常數(shù)，V是掃速。根據(jù)掃速影響實(shí)驗(yàn)得到Epa與In V的線性關(guān)系，其方程經(jīng)計(jì)算為Epa(V) = 0.724+0.0301n v(V s—1)，從而可以求得α n = 1.17。通常情況下令α = 0.5 [17]，即可求得η = 2，所以，雌二醇在PtNPs/MWCNTs/GCE修飾電極上的反應(yīng)是2電子2質(zhì)子反應(yīng)，這與之前的報(bào)道[18]吻合，反應(yīng)機(jī)理可以用以下過(guò)程表示(見(jiàn)圖8)。
[0085]6、干擾實(shí)驗(yàn)及重現(xiàn)性
[0086]雌二醇的濃度為5 μ molL—1，發(fā)現(xiàn)尿酸(UA)、抗壞血酸(AA)、Cu2+、Fe3+的峰電位與雌二醇相距較遠(yuǎn)，可以很好的分開(kāi)，因此UA和AA可認(rèn)為對(duì)雌二醇無(wú)干擾；200倍的葡萄糖，硫酸鋅，氯化銨對(duì)雌二醇無(wú)干擾(電流變化小于10% )。而雌三醇、雌酮作為與雌二醇共同存在的激素，由于它們產(chǎn)生的峰電位相同，不能將其分開(kāi)，但是卻可以測(cè)定三者的總量，檢測(cè)總雌激素含量也具有一定意義。
[0087]以3 μ rnolL-1的雌二醇為標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)該修飾電極重復(fù)5次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD =
3.9% ;將電極分別修飾3次進(jìn)行檢測(cè)，RSD = 3.7%。
[0088]實(shí)際應(yīng)用
[0089]采用修飾電極對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行了檢測(cè)，包括雞肉，牛肉，豬肉，牛奶，尿樣(懷孕婦女的)。運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)加入法判斷該方法的準(zhǔn)確度，測(cè)量結(jié)果在表I中列出。在測(cè)量時(shí)，沒(méi)有加雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)無(wú)電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)，說(shuō)明該樣品中不含雌二醇，或者雌二醇含量過(guò)低以至于無(wú)法檢出。當(dāng)加入6μπιο1 L—1的雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，可以看到明顯的氧化峰，回收率在95%-105%之間，表明該方法用于雌二醇的實(shí)際樣品檢測(cè)中具有一定的可靠性。
[0090]

【權(quán)利要求】
1.制作納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1，將多壁碳納米管在酸性溶液中進(jìn)行超聲處理后，用水洗滌后烘干； 步驟2，將步驟I處理過(guò)的多壁碳納米管分散在乙二醇水溶液中，經(jīng)超聲至分散均勻得到多壁碳納米管溶液； 步驟3，將裸玻碳電極在氧化鋁粉上拋光，然后依次在無(wú)水乙醇和水中超聲處理后，用水沖洗并吹干； 步驟4，將步驟2得到的多壁碳納米管溶液，滴涂在步驟3處理過(guò)的裸玻碳電極的表面并干燥，得到多壁碳納米管修飾玻碳電極； 步驟5，將步驟4處理的多壁碳納米管修飾玻碳電極置于氯鉬酸水溶液中進(jìn)行恒電位沉積后，用水沖洗電極表面并吹干，獲得納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極的方法，其特征在于，步驟I中，所述多壁碳納米管是在1:1的濃硫酸和濃硝酸中超聲處理4-5h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極的方法，其特征在于，步驟2中，是將2mg的多壁碳納米管分散在ImL的乙二醇水溶液中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極的方法，其特征在于，步驟3中，是將裸玻碳電極在0.05 μ m的氧化鋁粉上拋光，然后依次在無(wú)水乙醇和水中超聲lmin。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的制作納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極的方法，其特征在于，步驟4中，是將4-12 μ L的多壁納米管溶液滴涂在步驟3處理過(guò)的裸玻碳電極的表面。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極的方法，其特征在于，步驟5中，是將多壁碳納米管修飾玻碳電極置于lmmol/L的氯鉬酸中進(jìn)行恒電位沉積3min。
7.利用如權(quán)利要求1至6任意一項(xiàng)所述納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極檢測(cè)雌二醇的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1，將雌二醇溶液加入到含有緩沖溶液的電解池中，開(kāi)路狀態(tài)下攪拌富集l_4min，電化學(xué)工作站輸出OV至IV的電壓加載至納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極上，通過(guò)納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極對(duì)電解池中的溶液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描； 步驟2，向等待檢測(cè)樣品添加雌二醇溶液后，將等待檢測(cè)樣品與雌二醇溶液的混合體加入到含有緩沖溶液的電解池中，開(kāi)路狀態(tài)下攪拌富集l_4min，電化學(xué)工作站輸出OV至IV的電壓加載至納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極上,通過(guò)納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極對(duì)電解池中的溶液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極檢測(cè)雌二醇的方法，其特征在于，還包括步驟3，每次檢測(cè)之前和之后，均將納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極置于空白的緩沖溶液中進(jìn)行伏安掃描，從而使納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極再生。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的利用納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極檢測(cè)雌二醇的方法，其特征在于，步驟I和步驟2中的緩沖溶液中的電解質(zhì)為B-R、PBS、Tris-HCl、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液、KCl。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的利用納米鉬和多壁碳納米管修飾的玻碳電極檢測(cè)雌二醇的方法，其特征在于，所述伏安掃描的掃速為0.lV/s。
【文檔編號(hào)】G01N27/26GK104198551SQ201410483353
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月22日
【發(fā)明者】于嵐嵐, 毛燁炫, 屈凌波 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)