聚焦離子束法制備冷凍含水切片的樣品夾持工具和轉移盒子的制作方法
【專利摘要】一套用于聚焦離子束法制備生物冷凍含水切片樣品的樣品夾具及轉移盒子：包括樣品夾持裝置和轉移裝置。本發(fā)明專利的創(chuàng)新之處在于可以有效減少生物冷凍含水樣品在切片制備及傳輸過程中的冰污染，并且制備出的樣品切片的切割厚度小于300nm，該裝置制備出的樣品可以適用于直接安裝載網的普通電鏡和對載網有特殊的透射電鏡成像。
【專利說明】聚焦離子束法制備冷凍含水切片的樣品夾持工具和轉移盒子

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及冷凍電鏡電子斷層成像技術樣品制備和原位透射電鏡樣品制備領域。

【背景技術】
[0002]低溫電子斷層成像三維重構(cryo-ET)技術是發(fā)展結構生物學和細胞生物學研究的重要技術。該技術可以得到更真實和接近天然的細胞內部高分辨率三維結構以及蛋白質大分子定位及相互作用的信息，是蛋白質組學研究的重要的輔助手段。通常使用的樣品制備方法一冷凍切片技術，存在諸多問題，如切片和收集過程中樣品的壓縮、振顫、皺縮、斷裂以及載網附著能力差等，這些缺陷嚴重影響了該研究領域的發(fā)展。近年來一種新的冷凍含水切片樣品的制備方法-聚焦離子束法(focused 1n beam-FIB)制備冷凍含水切片，是采用Ga離子與材料的原子碰撞發(fā)生濺射作用，以達到對樣品剪薄的作用，主要使用的設備是雙束掃描電鏡(裝有電子槍和離子槍并呈大約52°的夾角)和冷凍制備系統(tǒng)。在2006年最早由美國的M.Marko的研究組證明這種方法可行性,在2010年德國的W.Baumeister課題組和2012年美國的P.Zhang課題組對這些技術進一步發(fā)展和應用。冷凍含水切片樣品制備過程中，樣品夾持工具和傳輸工具是保證該技術順利進行，以及得到平整、厚度合適和低污染冷凍切片樣品的必須實驗設備。以上課題組的研究中使用的夾持和傳輸裝置都是根據(jù)本課題組特殊的透射電鏡自行研制的，載網容易損壞，不具有廣泛應用性質?，F(xiàn)在市場上沒有相關的廣品。


【發(fā)明內容】

[0003]本專利設計出一套使用方便、通用性強的樣品夾持工具和轉移盒子，可以直接夾持普通的透射電鏡載網(銅網或鑰網)或特殊的透射電鏡載網(如FEI公司的Titan Krois透射電鏡特制的載網c-ring+c-clip)，并且對制備出的切片樣品進行方便的轉移和儲存。
[0004]本發(fā)明的一個方面提供一種設備，所述設備包括樣品夾持工具和樣品轉移盒子。
[0005]樣品夾持工具由高導熱純銅(紫銅)制成，其包括頂蓋、工具主體、圓柱底座、載網支撐凹槽和彈簧壓片。
[0006]頂蓋可以自由開關，并且可以完全覆蓋樣品夾持工具頂部(包括載網支撐凹槽和彈黃壓片)。
[0007]圓柱底座位于夾持工具底部，其直徑大小可以調節(jié)，可以與不同型號的冷凍傳輸設備的穿梭工具(shuttle)相連。
[0008]載網支撐凹槽的尺寸也可以根據(jù)所加載的載網的大小和形狀不同而變化。
[0009]凹槽預傾38°的夾角，目的是與雙束掃描電鏡中聚焦離子束(FIB)相平行，方便微加工操作。
[0010]樣品轉移盒子，外部由絕緣材料聚苯乙烯構成，內部由不銹鋼制成，包括電鏡載網存儲裝置放置槽、鏤空平臺、樣品夾持工具放置槽、樣品轉移盒子支架和轉移盒子外殼。
[0011]樣品轉移盒子具有一個或多個電鏡載網存儲裝置放置槽，其用于放置電鏡載網存儲裝置。在一個實施方案中，轉移盒子具有三個電鏡載網存儲裝置放置槽，可以放置三個電鏡載網存儲裝置，所述電鏡載網存儲裝置可以放置4個載網，因此在轉移盒子內一共可以裝置3X4 = 12個載網樣品，液氮環(huán)境下方便實驗中載網存儲裝置的開關操作。
[0012]樣品夾持工具放置槽用于固定所述樣品夾持工具，其使得整個裝置能更加穩(wěn)定地裝卸載網。
[0013]鏤空平臺和支架可以使部分液氮流入樣品盒底部，使整個裝置長時間保持在低溫環(huán)境下，并且使整套裝置穩(wěn)固，方便實驗的進行。
[0014]本專利有如下創(chuàng)新點:
[0015]1.保持低溫
[0016]本專利采用紫銅金屬塊作為樣品夾持工具的材料，通過熱傳導作用可以將加工過程中產生的熱量及時傳導出去，使冷凍樣品的載網持續(xù)保持在液氮溫度。
[0017]2.減少樣品的污染
[0018]本發(fā)明的樣品夾持工具上帶有開關緊密的防污染蓋子，只有在切割過程中打開，可以保證在傳輸和轉移過程中減少樣品與外界的接觸，防止冰晶污染。
[0019]3.方便的轉移盒子
[0020]本發(fā)明研發(fā)一套低溫樣品的夾持，在傳輸工具中可以方便的在液氮環(huán)境中將載網夾載在樣品夾持工具中，以及將制備好的冷凍含水切片樣品從夾持工具中取出并儲存好。
[0021]使用本專利設計的樣品夾具和傳輸工具，可以有效簡化實用操作，同時也可以明顯的減少冷凍含水切片在制備和傳輸過程中的冰污染，從而獲得到更大面積的切片可觀察區(qū)域，實驗操作簡單，應用廣泛。
[0022]更具體地，本發(fā)明提供以下各項:
[0023]1.用于轉移和儲存電鏡載網的設備，所述設備包括樣品夾持工具和樣品轉移盒子，其中
[0024]所述樣品夾持工具包括:頂蓋(I)，所述頂蓋可自由開關以方便載網存取，并且當閉合時使載網免受污染和破壞；工具主體(2);圓柱底座(3)，所述圓柱底座位于所述夾持工具的底部，所述工具主體的下方，所述圓柱底座的直徑與將與其相連的不同型號的冷凍傳輸設備的穿梭工具相符；載網支撐凹槽(4)，所述載網支撐凹槽用于支撐載網，其尺寸與所要加載的載網的尺寸相符；和彈簧壓片(5)，當載網被加載在所述載網支撐凹槽上時，所述彈簧壓片夾持住所述載網的側邊緣，使其在傳輸過程中保持穩(wěn)定，并且所述頂蓋在閉合時可覆蓋所述載網支撐凹槽和所述彈簧壓片，并且
[0025]所述樣品轉移盒子包括:一個或多個電鏡載網存儲裝置放置槽出)，所述一個或多個電鏡載網存儲裝置放置槽用于放置電鏡載網存儲裝置；鏤空平臺(7)，所述鏤空平臺用于承載所述一個或多個電鏡載網存儲裝置放置槽以及用于固定所述樣品夾持工具的樣品夾持工具放置槽(8)，并且液氮可通過所述鏤空平臺的鏤空處從而沒過加載在所述一個或多個電鏡載網存儲裝置放置槽上的電鏡載網存儲裝置和加載在所述樣品夾持工具放置槽上的樣品夾持工具；樣品轉移盒子支架(9)，所述樣品轉移盒子支架位于所述鏤空平臺的下方用以支撐所述鏤空平臺以保持所述樣品轉移盒子穩(wěn)定；和轉移盒子外殼(10)，所述轉移盒子外殼包圍所述鏤空平臺和所述樣品轉移盒子支架，并且所述鏤空平臺、所述樣品轉移盒子支架和所述轉移盒子外殼一起提供用于容納液氮的空間以使透過所述鏤空平臺的液氮將加載在所述一個或多個電鏡載網存儲裝置放置槽上的電鏡載網存儲裝置和加載在所述樣品夾持工具放置槽上的樣品夾持工具保持在低溫。
[0026]2.根據(jù)I所述的設備，其中所述樣品夾持工具由高導熱材料加工而成，以便在實驗過程中產生的熱量可以快速的導通，保持樣品的處于低溫狀態(tài)。
[0027]3.根據(jù)2所述的設備，其中所述高導熱材料是紫銅。
[0028]4.根據(jù)I所述的設備，其中在所述樣品轉移盒子中，所述轉移盒子外殼(10)由聚苯乙烯制成，所述樣品轉移盒子的其余部分由不銹鋼制成。
[0029]5.根據(jù)I所述的設備，其中所述載網支撐凹槽的傾斜角度保持38°以與雙束掃描電鏡中聚焦離子束(FIB)平行。
[0030]6.根據(jù)I所述的設備，其中所述樣品轉移盒子具有3個電鏡載網存儲裝置放置槽。
[0031]7.根據(jù)I所述的設備，其中所述樣品夾持工具放置槽固定所述樣品夾持工具以使被固定的所述樣品夾持工具能夠進行360°傾轉，以方便所述樣品夾持工具和載網的裝卸。
[0032]8.根據(jù)I所述的設備，其中所述一個或多個電鏡載網存儲裝置放置槽所處的平面高于所述樣品夾持工具放置槽所處的平面。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為樣品夾持工具的示意圖，圖示的樣品夾持工具包括:頂蓋(I)、工具主體
(2)、圓柱底座(3)、載網支撐凹槽(4)和彈簧壓片(5);圖(a):樣品夾持工具打開狀態(tài)，其中載網已經加載到夾持工具上；圖(b):夾持工具頂蓋閉合的存儲狀態(tài)。
[0034]圖2為樣品轉移盒子示意圖，圖示的樣品轉移盒子包括:電鏡載網存儲裝置放置槽(6)、鏤空平臺(7)、樣品夾持工具放置槽(8)、樣品轉移盒子支架(9)和轉移盒子外殼
(10)，其中在圖2(a)中，樣品夾持工具已被裝載在樣品夾持工具放置槽(8)上。
[0035]圖3為根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的實驗的結果圖，其中，A:垂直觀察FIB減薄后的冷凍含水切片的厚度:側面觀察在載網的網格中的減薄后的樣品；(:和0:電子衍射圖案；以及，E和F:細胞連接處和內部的細胞器的結構。

【具體實施方式】
[0036]下面結合附圖和具體實施例，進一步闡明本發(fā)明:實驗設備為FEI公司生產的Hel1s Nanolab 600i雙束掃描電鏡，配備Quorum公司生產的PP3000T冷凍制備系統(tǒng)。將樣品夾持工具安裝到轉移盒子上，并將其整體浸入液氮中，保持液氮液面在夾持工具頂端以上約0.5cm處。首先使用鑷子將載網從電鏡載網存儲裝置中取出并安裝到樣品夾持工具上，然后關閉夾持工具的頂蓋以防止冰污染。再將夾持工具通過圓柱底座與冷凍制備系統(tǒng)的傳輸裝置相連，將固定有樣品的夾持工具送入雙束掃描電鏡制備腔室，打開夾持工具的蓋子，對樣品進行聚焦離子束減薄加工。冷凍含水切片制備完成冷凍含水切片以后，關閉夾持工具的蓋子，并快速將樣品和夾持工具一同轉移到浸沒在液氮中的轉移盒子上的夾持工具放置槽中。放置好后，在液氮環(huán)境下，打開在轉移盒子中的夾持工具的頂蓋，取出冷凍含水切片載網，將其放回至處于液氮中的電鏡載網存儲裝置中，以備后期透射電鏡成像。
[0037]實施例1
[0038]一、制備樣品
[0039]使用投擲冷凍技術將樣品快速冷凍到200目的鑰載網上，如涉及細胞樣品，則建議采用在載網上正面滴加樣品從背面吸干的方法制備，以保證樣品冰層較薄。
[0040]二、切割過程
[0041]1.在液氮環(huán)境下，將載網安裝到夾持工具上，再將裝載有載網的樣品夾持工具轉移到樣品轉移盒子上，并關閉保護蓋子。
[0042]2.將樣品夾持工具轉移到PP3000T大的樣品制備杯中并與樣品轉移棒相連，并抽真空。
[0043]3.樣品進入PP3000T樣品制備室后，噴鍍Pt金屬后轉移至掃描電鏡SEM低溫樣品臺。
[0044]4.采用聚焦離子束減薄法對冷凍含水樣品進行減薄切割，切割參數(shù):在FIB電壓30kV下，分別用電流0.79nA-80pA進行切割。
[0045]5.減薄完成，取出已經完成的冷凍含水切片樣品進行透射電鏡成像或低溫保存。
【權利要求】
1.用于轉移和儲存電鏡載網的設備，所述設備包括樣品夾持工具和樣品轉移盒子，其中 所述樣品夾持工具包括:頂蓋(I)，所述頂蓋可自由開關以方便載網存取，并且當閉合時使載網免受污染和破壞；工具主體(2);圓柱底座(3)，所述圓柱底座位于所述夾持工具的底部，所述工具主體的下方，所述圓柱底座的直徑與將與其相連的不同型號的冷凍傳輸設備的穿梭工具相符；載網支撐凹槽(4)，所述載網支撐凹槽用于支撐載網，其尺寸與所要加載的載網的尺寸相符；和彈簧壓片(5)，當載網被加載在所述載網支撐凹槽上時，所述彈簧壓片夾持住所述載網的側邊緣，使其在傳輸過程中保持穩(wěn)定，并且所述頂蓋在閉合時可覆蓋所述載網支撐凹槽和所述彈簧壓片，并且 所述樣品轉移盒子包括:一個或多個電鏡載網存儲裝置放置槽出)，所述一個或多個電鏡載網存儲裝置放置槽用于放置電鏡載網存儲裝置；鏤空平臺(7)，所述鏤空平臺用于承載所述一個或多個電鏡載網存儲裝置放置槽以及用于固定所述樣品夾持工具的樣品夾持工具放置槽(8)，并且液氮可通過所述鏤空平臺的鏤空處從而沒過加載在所述一個或多個電鏡載網存儲裝置放置槽上的電鏡載網存儲裝置和加載在所述樣品夾持工具放置槽上的樣品夾持工具；樣品轉移盒子支架(9)，所述樣品轉移盒子支架位于所述鏤空平臺的下方用以支撐所述鏤空平臺以保持所述樣品轉移盒子穩(wěn)定；和轉移盒子外殼(10)，所述轉移盒子外殼包圍所述鏤空平臺和所述樣品轉移盒子支架，并且所述鏤空平臺、所述樣品轉移盒子支架和所述轉移盒子外殼一起提供用于容納液氮的空間以使透過所述鏤空平臺的液氮將加載在所述一個或多個電鏡載網存儲裝置放置槽上的電鏡載網存儲裝置和加載在所述樣品夾持工具放置槽上的樣品夾持工具保持在低溫。
2.根據(jù)權利要求1所述的設備，其中所述樣品夾持工具由高導熱材料加工而成。
3.根據(jù)權利要求2所述的設備，其中所述高導熱材料是紫銅。
4.根據(jù)權利要求1所述的設備，其中在所述樣品轉移盒子中，所述轉移盒子外殼(10)由聚苯乙烯制成，所述樣品轉移盒子的其余部分由不銹鋼制成。
5.根據(jù)權利要求1所述的設備，其中所述載網支撐凹槽的傾斜角度保持38°以與雙束掃描電鏡中聚焦離子束(FIB)平行。
6.根據(jù)權利要求1所述的設備，其中所述樣品轉移盒子具有3個電鏡載網存儲裝置放置槽。
7.根據(jù)權利要求1所述的設備，其中所述樣品夾持工具放置槽固定所述樣品夾持工具以使被固定的所述樣品夾持工具能夠進行360°傾轉。
8.根據(jù)權利要求1所述的設備，其中所述一個或多個電鏡載網存儲裝置放置槽所處的平面高于所述樣品夾持工具放置槽所處的平面。
【文檔編號】G01N1/06GK104198242SQ201410429176
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月28日 優(yōu)先權日:2014年8月28日
【發(fā)明者】張建國, 季剛, 徐偉, 孫飛 申請人:中國科學院生物物理研究所