一種hplc波長(zhǎng)切換技術(shù)同時(shí)測(cè)定諾尼果汁中多種酚酸含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種HPLC波長(zhǎng)切換技術(shù)同時(shí)測(cè)定諾尼果汁中多種酚酸含量的方法，該方法包括利用高效液相色譜波長(zhǎng)切換技術(shù)，對(duì)諾尼果汁中的酚酸物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析：選用C18色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-冰醋酸水溶液，梯度洗脫，檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器，通過波長(zhǎng)切換完成同時(shí)對(duì)多種酚酸成分的分離與測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)品峰面積外標(biāo)法定量。本發(fā)明特點(diǎn)在于運(yùn)用波長(zhǎng)切換技術(shù)去除干擾物質(zhì)的影響、同時(shí)測(cè)定出諾尼果汁中6種酚酸的含量，測(cè)定組分在30min內(nèi)可達(dá)到較好分離，準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。本發(fā)明能有效分離、準(zhǔn)確測(cè)定諾尼果汁中多種酚酸物質(zhì)，對(duì)諾尼果汁功效性成分的研究和產(chǎn)品質(zhì)量的評(píng)價(jià)具有重要意義。
【專利說明】一種HPLC波長(zhǎng)切換技術(shù)同時(shí)測(cè)定諾尼果汁中多種酚酸含 量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種HPLC波長(zhǎng)切換技術(shù)同時(shí)測(cè)定諾尼果汁中多種酚酸含量的檢測(cè)方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 諾尼（Noni)是一種熱帶常綠多年生闊葉灌木或小喬木，又名海巴戟，海巴戟天， 蘿蒸。學(xué)名ci(ri/b/ia Lina ,為茜草科巴戟天屬植物，原產(chǎn)于一些太平洋島ill與、 東南亞和澳大利亞等地，現(xiàn)引種于我國(guó)海南省。諾尼果有豐富的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，被人們稱 為"神奇果"富含大量活性成分如多糖、酚類、黃酮類和環(huán)烯醚萜類等，具有抗腫瘤、抗氧化、 增強(qiáng)免疫力、降血脂和保護(hù)心血管等功能，對(duì)多種疾病有預(yù)防和治療作用。
[0003] 酚酸是植物多酚類物質(zhì)的一類，具有獨(dú)特的保健生物活性，具有抗氧化、清除自由 基，抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)心血管等作用，與人體健康密切相關(guān)，逐漸成為研究熱點(diǎn)。諾 尼果汁含有豐富的多酚類活性物質(zhì)，其中酚酸種類較多，目前，尚無對(duì)諾尼果汁中多種酚酸 物質(zhì)定性和定量的研究。因此需要建立一種測(cè)定諾尼果汁中酚酸類物質(zhì)的檢測(cè)方法，為諾 尼果汁功效性成分的研究提供依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于提供一種HPLC波長(zhǎng)切換技術(shù)同時(shí)測(cè)定諾尼果汁中多種酚酸含量 的檢測(cè)方法，對(duì)諾尼果汁中酚酸類物質(zhì)沒食子酸、龍膽酸、P-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、 阿魏酸同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，為諾尼果汁功效性成分的研究和產(chǎn)品質(zhì)量的評(píng)價(jià)提供可信依據(jù)。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種HPLC波長(zhǎng)切換技術(shù)同時(shí)測(cè)定諾尼果 汁中多種酚酸含量的檢測(cè)方法，采用高效液相色譜、二極管陣列檢測(cè)器波長(zhǎng)切換技術(shù)同時(shí) 對(duì)諾尼果汁中6種酚酸進(jìn)行定性和定量分析，其特征在于： 本發(fā)明所述檢測(cè)6種酚酸，分別為：沒食子酸、龍膽酸、P-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、 阿魏酸。
[0006] 本發(fā)明中標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為： 分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸50mg、龍膽酸100mg、P-羥基苯甲酸500mg、綠原酸200mg、咖 啡酸50mg、阿魏酸30mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得混合標(biāo) 準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，于冰箱4°C避光保存。使用前，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將此標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用50%甲醇稀釋 10-100倍，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，測(cè)定前經(jīng)0. 22 y m微孔濾膜過濾。
[0007] 本發(fā)明中樣品的制備方法為： 取15 mL諾尼果汁，每次用45mL乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并有機(jī)相，濃縮后，殘?jiān)?溶于I mL50 %甲醇中，測(cè)定前樣品經(jīng)0.22 微孔濾膜過濾，用于進(jìn)樣分析。
[0008] 本發(fā)明的色譜條件為： 色譜柱為 Thermo Accucore XL C18 (250 mmX4.6 mm，4 U m);柱溫為 30 °C ;流動(dòng)相 A 0. 95 %冰醋酸溶液；流動(dòng)相B甲醇；梯度洗脫條件為0-11 min，5 % B ; ll-17min，20% B ; 17-22min，30 % B ;22-50min，5% B ;流速為 0? 8min/mL ;檢測(cè)器為 Thermo DAD-3000 ;檢測(cè)波 長(zhǎng)為280nm和330nm (龍膽酸、咖啡酸和阿魏酸波長(zhǎng)切換為330nm處檢測(cè)，沒食子酸、P-羥 基苯甲酸、綠原酸在280nm處檢測(cè))。在上述色譜條件下，取標(biāo)準(zhǔn)品和樣品制備溶液分別進(jìn) 樣，記錄色譜圖。
[0009] 本發(fā)明中所述的諾尼果汁為純諾尼果汁或含諾尼成分的其它產(chǎn)品。
[0010] 本發(fā)明采用高效液相色譜法，通過梯度洗脫，檢測(cè)過程波長(zhǎng)切換，同時(shí)測(cè)定諾尼果 汁中6種酚酸的含量。結(jié)果6種酚酸組分的質(zhì)量濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系；相關(guān) 系數(shù)均大于0.991，且6種酚酸組分在30 min內(nèi)可得到較好分離。平均回收率為91. 18%? 101.08 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.73%?2. 17 %。本法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效，可用于同時(shí)測(cè)定 諾尼果汁中沒食子酸、龍膽酸、P-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸6種酚酸的含量，為 諾尼果汁功效性成分的研究和產(chǎn)品質(zhì)量的評(píng)價(jià)提供科學(xué)、可信依據(jù)。
[0011] 本發(fā)明由于采用以上技術(shù)方案，具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1. 采用波長(zhǎng)切換技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，用二極管陣列檢測(cè)器綜合考慮不同酚酸組分最強(qiáng)吸 收且雜質(zhì)干擾較小的波長(zhǎng)進(jìn)行波長(zhǎng)切換檢測(cè)。可在一張色譜圖中較好的對(duì)測(cè)定組分進(jìn)行分 離；去除干擾雜質(zhì)，有利于組分含量準(zhǔn)確計(jì)算，具有方便、快捷、高效、方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性好的 優(yōu)點(diǎn)； 2. 流動(dòng)相的選擇：本發(fā)明在流動(dòng)相中添加少量冰醋酸作為酸性調(diào)節(jié)劑，使分離效果和 峰形得到改善?？疾炝?〇.5%-9%不同濃度冰醋酸溶液對(duì)6種酚酸的分離效果，最終流動(dòng)相 選擇采用A液（0. 95%冰醋酸水溶液）和B液（甲醇)，6種酚酸組分能較好分離，且各組分之 間分離度均大于1. 5 ; 3. 樣品的制備方法：實(shí)驗(yàn)采用不同萃取溶劑對(duì)樣品中酚酸進(jìn)行提取，根據(jù)回收率最終 確定采用乙酸乙酯提取，平均回收率可達(dá)91. 18%?101.08 %; 4. 梯度洗脫條件：本發(fā)明進(jìn)行了多種梯度洗脫條件研究，最終確定以下洗脫程序： 0 ?llmin，B 為 5% ;11 ?17min，B 為 20% ;17 ?22min，B 為 30% ;22 ?50min，B 為 5%。在 此梯度條件下，沒食子酸、龍膽酸、P-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸均能得到較好的 分離、峰形良好、保留時(shí)間穩(wěn)定。
[0012]

【專利附圖】

【附圖說明】 圖1為本發(fā)明沒食子酸、龍膽酸、P-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸6種酚酸混 和標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。其中1.沒食子酸；2.龍膽酸；3. P-羥基苯甲酸；4.綠原酸；5.咖啡酸； 6.阿魏酸。
[0013] 圖2為本發(fā)明諾尼果汁樣品的色譜圖。其中1.沒食子酸；2.龍膽酸；3. P-羥基 苯甲酸；4.綠原酸；5.咖啡酸；6.阿魏酸。
[0014]

【具體實(shí)施方式】 下面結(jié)合實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施案例。
[0015] 實(shí)施例1 1.材料 I. 1儀器 Thermo UltiMate 3000型高效液相色譜儀（DAD-3000二極管陣列檢測(cè)器，Chromeleon 7 色譜工作站，Thermo Fisher 公司）；Thermo Accucore XL C18 (250 mmX 4. 6 mm, 4 u m) 色譜柱；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀IKA-RVlO (德國(guó)艾卡公司）。
[0016] 1.2 試劑 標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸、龍膽酸、P-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸購(gòu)自北京百靈威科技 有限公司（純度> 98%)。甲醇、冰醋酸為色譜純，乙酸乙酯為分析純，實(shí)驗(yàn)所用水均為超純 水。
[0017] 1.3 樣品 諾尼果汁由海南諾尼生物工程開發(fā)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批次為20121228、20130105、 20130603、20140313、20140325 和 20140326。
[0018] 2?方法與結(jié)果 2. 1混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸50mg、龍膽酸100mg、P-羥基苯甲酸500mg、綠原酸200mg、咖 啡酸50mg、阿魏酸30mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得混合標(biāo) 準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，于冰箱4°C避光保存。使用前，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將此標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用50%甲醇稀釋 10-100倍，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，測(cè)定前經(jīng)0. 22 y m微孔濾膜過濾。
[0019] 2.2樣品的制備 取15 mL諾尼果汁，每次用45mL乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 儀(真空，40°C)濃縮后，殘?jiān)苡贗 mL 50 %甲醇中，置于冰箱4°C避光保存，待液相分析用。 測(cè)定前樣品經(jīng)0.22 微孔濾膜過濾。
[0020] 2. 3色譜條件 色譜柱：Thermo Accucore XL C18 (250 mmX4.6 mm，4 U m);柱溫：30 °C ;流動(dòng)相：A 液0. 95 %冰醋酸溶液；B液甲醇；梯度洗脫條件見表I ;流速：0. 8min/mL ;檢測(cè)器：Thermo DAD-3000 ;檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm和330nm (龍膽酸、咖啡酸和阿魏酸波長(zhǎng)切換為330nm處檢測(cè)， 沒食子酸、P-羥基苯甲酸、綠原酸在280nm處檢測(cè))。在上述色譜條件下，取標(biāo)準(zhǔn)品和樣品 制備溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。
[0021] 表1梯度洗脫條件

【權(quán)利要求】
1. 一種HPLC波長(zhǎng)切換技術(shù)測(cè)定諾尼果汁中多種酚酸含量的方法，其特征在于：按照下 述步驟同時(shí)對(duì)諾尼果汁中沒食子酸、龍膽酸、P-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸6種酚 酸進(jìn)行定性和定量分析： (1)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 分別精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸50mg、龍膽酸lOOmg、P-輕基苯甲酸500mg、綠原酸 200mg、咖啡酸50mg、阿魏酸30mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，為混 合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，于冰箱4°C避光保存；使用前，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將此標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用50%甲醇 稀釋10-100倍，配制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定前經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過濾； (2) 樣品制備 取適量諾尼果汁，經(jīng)有機(jī)溶劑多次萃取，合并有機(jī)相，濃縮，殘?jiān)苡?0 %甲醇中，測(cè)定 前樣品經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過濾，用于進(jìn)樣分析； (3) 高效液相色譜分離檢測(cè)條件 采用C18反相色譜柱，以流動(dòng)相A冰醋酸溶液；流動(dòng)相B甲醇，采用梯度洗脫，二極管 陣列檢測(cè)器波長(zhǎng)切換技術(shù)測(cè)定，檢測(cè)溫度25-35°C，流速0. 8-1. 0 mL/min ; (4) 樣品定性和定量分析 采用系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液按照步驟（1)進(jìn)行配制，按步驟（3)色譜條件進(jìn)樣；以峰面積y 對(duì)質(zhì)量濃度X繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到6種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程；每個(gè)樣品按步驟（2)進(jìn)行前 處理后，按步驟（3)色譜條件分別進(jìn)樣分析，樣品峰與標(biāo)準(zhǔn)品峰保留時(shí)間比對(duì)定性，樣品峰 面積代入相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程定量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的方法其特征在于：所述步驟（2)樣品制備最優(yōu)方法為取15 mL諾尼果汁，每次用45mL乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并有機(jī)相，濃縮后，殘?jiān)苡贗 mL 50 %甲醇中，測(cè)定前樣品經(jīng)0.22 μπι微孔濾膜過濾，用于進(jìn)樣分析。
3. 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的方法其特征在于：所述步驟（3)流動(dòng)相A為冰醋酸溶液最 佳濃度為〇. 95%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的方法其特征在于：所述步驟（3)色譜條件流動(dòng)相A為冰醋 酸溶液，流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫分離程序如下表所示:_
〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的方法其特征在于：所述步驟（3)色譜條件采用二極管陣 列檢測(cè)器波長(zhǎng)切換檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm和330nm (龍膽酸、咖啡酸和阿魏酸波長(zhǎng)切換在 330nm處檢測(cè)，沒食子酸、P-羥基苯甲酸、綠原酸波長(zhǎng)切換在280nm處檢測(cè))。
6. 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的方法其特征在于：所述步驟（3)色譜條件最佳檢測(cè)柱溫為 30°C，最佳流速為0. 8mL/min，測(cè)定時(shí)間為50min (其中0_30min為組分分離時(shí)間，30_50min 為流動(dòng)相恢復(fù)梯度初始濃度平衡時(shí)間）。
7. 根據(jù)權(quán)利要求書1-6所述的方法其特征在于：所述的諾尼果汁為純諾尼果汁或含諾 尼成分的其它產(chǎn)品。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK104374854SQ201410413704
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月21日
【發(fā)明者】程池, 陳建國(guó), 張露, 李金霞, 洪啟恩, 譚望橋 申請(qǐng)人:中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院, 海南諾尼生物工程開發(fā)有限公司