一種測(cè)定血漿中5’-甲氧基-3’, 4’-亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺濃度的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定血漿中5’-甲氧基-3’,4’-亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺濃度的方法,采用液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)測(cè)定,先取待測(cè)樣品,加入一定量的有機(jī)溶媒進(jìn)行萃取,預(yù)處理后,經(jīng)色譜柱分離,用質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè),本發(fā)明方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便,適合于測(cè)定血漿中5’-甲氧基-3’,4’-亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺的濃度。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種測(cè)定血漿中5’ -甲氧基-3’,4’ -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺濃度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物分析【技術(shù)領(lǐng)域】,涉及體內(nèi)藥物的分析測(cè)定方法,具體涉及測(cè)定血漿中5’ -甲氧基_3’,4’ -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺濃度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大葉筠(Piper Laetispicum C.DC.)為胡椒科胡椒屬植物,主要產(chǎn)于海南、廣東、廣西、云南等地,民間用于活血、消腫、止痛,主治跌打損傷、瘀血腫痛。近期研究發(fā)現(xiàn)大葉筠具有較強(qiáng)的抗抑郁作用,其活性和一系列酰胺類(lèi)化合物有關(guān)。其中5’-甲氧基_3’,4’_亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺(C15H19N04) (K6)為其中含量最高的生物堿。
[0003]目前關(guān)于人體服用大葉筠有效部位提取物后血漿中K6的測(cè)定方法沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明建立了大葉筠有效部位提取物中主要有效成分K6在人體內(nèi)的測(cè)定方法,通過(guò)該方法對(duì)K6在人體內(nèi)的藥物代謝情況進(jìn)行探索性研究,以期服務(wù)于新藥開(kāi)發(fā)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種測(cè)定血漿中5’ -甲氧基-3’,4’ -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺濃度的方法。
[0005]為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0006]一種測(cè)定血漿中5’ -甲氧基-3’,4’ -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺(K6)濃度的方法,血漿樣品經(jīng)預(yù)處理后經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)其濃度,具體方法包括如下步驟:
[0007](I)血漿樣品預(yù)處理:取血漿樣品,加入內(nèi)標(biāo)替硝唑溶液,加入乙酸乙酯萃取,吸取上層有機(jī)相,40 V下減壓濃縮揮干,加入80v/v %甲醇水溶液溶解,離心后取上清液;
[0008](2)將步驟(I)預(yù)處理后的血漿樣品進(jìn)行液相色譜分離:色譜柱為Agilent ZOBAXSB C18,4.6X150mm,5ym ;流動(dòng)相:體積比為80:20的甲醇與0.2mmol.L-1醋酸胺水溶液;流速:400mL.mirT1 ;柱溫:35°C ;進(jìn)樣量:5 μ L ;洗脫方式為等度洗脫;
[0009](3)質(zhì)譜測(cè)定:條件為:離子源:電噴霧離子化電離源ESI ;離子檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);離子極性:正離子;離子源電壓IS:5000V ;離子源溫度TEM:400°C ;碰撞氣CAD:10L.mirT1 ;氣簾氣 CUR:20L.mirT1 ;離子源 Gasl:60L.mirT1 ;離子源 Gas2:70L.mirT1 ;檢測(cè)對(duì)象的離子選擇通道:5’ -甲氧基-3’,4’ -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺,[M+H]+,m/z278.1/205.1,DP140, EP10, CE21, CXP9 ;內(nèi)標(biāo)替硝唑,[M+H]+,m/z248.1/128.0, DP100,EP10, CE30, CXP8 ;
[0010](4)計(jì)算:采用內(nèi)標(biāo)法,以5’ -甲氧基_3’,4’ -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺和內(nèi)標(biāo)替硝唑的峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算5’ -甲氧基-3’,4’ -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺濃度。
[0011]步驟(I)中,于10.0mL玻璃試管中精密加入血漿樣品0.5mL,精密加入內(nèi)標(biāo)105.6ng.mL—1替硝唑溶液20 μ L,旋渦10s,加入4.0mL乙酸乙酯,旋渦振蕩3min,3000r.mirT1離心1min,吸取上層有機(jī)相4mL, 40°C下減壓濃縮揮干,加入10 μ L80v/v%甲醇水溶液復(fù)溶,旋潤(rùn)lmin, 12000r.mirT1離心5min,吸取上清液。
[0012]其中,所述的血漿為口服大葉筠有效部位提取物后的血漿。本發(fā)明對(duì)大葉筠有效部位提取物如何制備沒(méi)有具體限定,現(xiàn)有的制備方法都可以采用。本發(fā)明方法重點(diǎn)是保護(hù)口服大葉筠有效部位提取物后,血漿內(nèi)K6的檢測(cè)方法,從而為研究K6的體內(nèi)代謝奠定基礎(chǔ)。
[0013]其中,所述血漿為人或動(dòng)物的血漿。
[0014]有益效果:本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有如下優(yōu)勢(shì):
[0015](I)預(yù)處理方法簡(jiǎn)便:有機(jī)溶媒液液萃取法,適用于常規(guī)測(cè)定。
[0016](2)專(zhuān)屬性強(qiáng):采用ZOBAX SB C18色譜柱作為固定相,甲醇和水(0.2mmol -T1醋酸胺)的混合液作為流動(dòng)相,等度洗脫,K6保留時(shí)間為5.3min左右,內(nèi)標(biāo)替硝唑保留時(shí)間為3.7min左右,6.5分鐘完成測(cè)定,內(nèi)源性物質(zhì)不干擾二者的測(cè)定。
[0017](3)靈敏度高:血漿最低定量限為0.1006ng.mL—1。
[0018](4)本發(fā)明方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便,為K6的臨床血藥物濃度測(cè)定提供依據(jù),服務(wù)于新藥研究開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用。本方法的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍為0.1006?25.75ng.ml/1,日內(nèi)和日間精密度RSD均小于10%。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為質(zhì)譜圖。
[0020]其中,A為人空白血漿的質(zhì)譜圖。B為甲醇加入標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖。C人空白血漿加入標(biāo)準(zhǔn)品后的質(zhì)譜圖。D為人空腹服用大葉筠有效部位提取物(含K620.8mg)3h后血漿樣品的質(zhì)譜圖。
[0021]注:圖中離子選擇通道I為K6,[M+H]+,m/z278.1/205.1 ;保留時(shí)間為5.3min左右;離子選擇通道2為內(nèi)標(biāo)替硝唑,[M+H]+,m/z248.1/128.0,保留時(shí)間為3.7min左右。
【具體實(shí)施方式】
[0022]根據(jù)下述實(shí)施例,可以更好地理解本發(fā)明。然而,本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解,實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明,而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0023]實(shí)施例1:人血漿中K6濃度的測(cè)定。
[0024]一、實(shí)驗(yàn)材料與儀器
[0025]K6對(duì)照品:由蘇州頤華生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司提供,批號(hào):20131121 ;替硝唑?qū)φ掌?由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供,批號(hào):100336-200402 ;試驗(yàn)用水:超純水;甲醇:色譜純(Merck Company)。
[0026]API4000LC/MS/MS聯(lián)用儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司),色譜工作站=Analystl.4.2 ;梅特勒MT-5電子天平(瑞士梅特勒公司);LEGEND MICR017R冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);80-2離心機(jī)(江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司)Millipore Drict_Q5超純水機(jī)(法國(guó) Millipore 公司)。離心濃縮儀:Labconco CentriVap Console (美國(guó) Labconco 公司)
[0027]二、液質(zhì)條件
[0028]1.液相色譜條件
[0029]色譜柱:AgilentZOBAX SB C18 (4.6 X 150mm, 5 μ m);流動(dòng)相:甲醇一水(即0.2mmol/L 醋酸胺水溶液)(80:20,v/v);流速:400 μ L.mirT1 ;柱溫:35°C。
[0030]2.質(zhì)譜條件
[0031]離子源:離子源:電噴霧離子化電離源ESI ;離子檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);離子極性:正離子;離子源電壓is:5000V ;離子源溫度TEM:400°C;碰撞氣CAD:10L.mirT1 ;氣簾氣CUR:20L.min- 1 ;離子源Gasl:60L.min 1 ;離子源Gas2:70L.min-1、檢測(cè)對(duì)象的離子選擇通道:K6,[M+H]+, m/z278.1/205.1,DP140, EP10, CE21, CXP9 ;內(nèi)標(biāo)替硝唑,[M+H]+,m/z248.1/128.0,DP100, EP10, CE30, CXP8。
[0032]三、實(shí)驗(yàn)過(guò)程:
[0033]1.Κ6標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:
[0034]精密稱(chēng)取Κ6對(duì)照品10.30mg,置于1mL容量瓶中,加入甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,即得1030 μ g -mL-1K6儲(chǔ)備液,再以甲醇依次稀釋?zhuān)涑蓾舛确謩e為5.029,10.06,20.12,40.23,80.47,160.9,321.9,643.8,1288ng.mL_1 的 K6 標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0035]2.人血漿樣品的處理:
[0036]6名男性空腹服用大葉筠有效部位提取物(含K620.8mg),用250mL溫開(kāi)水送服;于給藥后3h采集外周靜脈血4ml,注入肝素管內(nèi),避光,離心(3000r *min_1, 1min),分取血漿0.5mL于10.0mL玻璃試管中,精密加入內(nèi)標(biāo)替硝唑溶液(105.6ng.mL-1) 20 μ L,旋渦10s,加入4.0mL乙酸乙酯,旋潤(rùn)振蕩3min,3000r.mirT1離心1min,吸取上層有機(jī)相4mL,40°C下減壓濃縮揮干,加入100 μ L80%甲醇溶液復(fù)溶,旋渦lmin,12000r.mirT1離心5min,吸取上清液5 μ L進(jìn)樣(見(jiàn)圖1中D),計(jì)算K6和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值fl,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算濃度。
[0037]3.專(zhuān)屬性:
[0038]取沒(méi)有給予過(guò)大葉筠有效部位提取物的人空白血漿0.5mL于10.0mL玻璃試管中,加入4.0mL乙酸乙酯,旋潤(rùn)振蕩3min,3000r.mirT1離心1min,吸取上層有機(jī)相4mL,40°C下減壓濃縮揮干,加入100 μ L80%甲醇溶液復(fù)溶,旋渦lmin,12000r.mirT1離心5min,吸取上清液5μ L進(jìn)樣(見(jiàn)圖1中Α)。
[0039]取1.0mL塑料離心管精密加入Κ6標(biāo)準(zhǔn)溶液(160.9ng.mL—1) 10 μ L,加入內(nèi)標(biāo)替硝唑溶液(105.6ng.mL-1) 20 μ L, 80 % 甲醇 70 μ L,旋潤(rùn) lmin,于 12000r.mirT1 離心 5min,吸取上清液5 μ L進(jìn)樣(見(jiàn)圖1中B)。
[0040]取沒(méi)有給予過(guò)大葉筠有效部位提取物的人空白血漿0.5mL于10.0mL玻璃試管中,精密加入K6標(biāo)準(zhǔn)溶液(103.0ng.mL—1) 10 μ L,內(nèi)標(biāo)替硝唑溶液(105.6ng.mL—1) 20 μ L,旋渦10s,加入4.0mL乙酸乙酯,旋潤(rùn)振蕩3min,3000r *min-l離心1min,吸取上層有機(jī)相4mL,40°C下減壓濃縮揮干,加入100 μ L80%甲醇溶液復(fù)溶,旋渦lmin,12000r.mirT1離心5min,吸取上清液5 μ L進(jìn)樣(見(jiàn)圖1中C)。
[0041]結(jié)果顯示,在本實(shí)驗(yàn)所采用的LC-MS-MS條件下,血漿樣品無(wú)雜峰對(duì)檢測(cè)組分造成干擾,Κ6保留時(shí)間在5.3min左右,內(nèi)標(biāo)替硝唑保留時(shí)間在3.7min左右。K6和內(nèi)標(biāo)互不干擾,峰形良好,基線(xiàn)平穩(wěn)。
[0042] 4.線(xiàn)性試驗(yàn)
[0043]人血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):取10.0mL玻璃試管數(shù)支,分別加入沒(méi)有給予過(guò)大葉筠有效部位提取物的空白血漿0.5mL,再分別精密加入不同濃度的K6標(biāo)準(zhǔn)液10 μ L,旋渦1s混勻,配成含 Κ6 的濃度分別為 0.1006,0.2012,0.4023,0.8047、1.609,3.219,6.438、12.88、25.75ng ?ιn-1的含藥血漿,按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作。計(jì)算Κ6峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f (f = As/Ai),以峰面積比值f對(duì)血藥濃度C作回歸計(jì)算。以平均比值f對(duì)血藥濃度C作回歸計(jì)算,得回歸方程:f = 0.137XC+0.00898 (r = 0.9990,權(quán)重系數(shù)w = 1/C*C),K6血漿濃度在0.1006~25.75ng -ml-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。最低定量限為0.1006ng.mL'
[0044]5.準(zhǔn)確度和精密度
[0045]按照人血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方法配制含K6濃度為0.2060,2.060,20.60ng.mL—1的低、中、高的血漿樣品,按“人血漿樣品的處理”處理方法分別處理。連續(xù)做3天,每天每個(gè)濃度各做5份樣品,計(jì)算K6峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f,代入當(dāng)天的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中求得K6實(shí)測(cè)濃度,由實(shí)測(cè)濃度計(jì)算日內(nèi)、日間精密度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),實(shí)測(cè)濃度與加入濃度的比值即為準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示,日內(nèi)和日間精密度RSD均小于10%,準(zhǔn)確度符合要求。
[0046]6.測(cè)定結(jié)果
[0047]上述給予過(guò)大葉筠有效部位提取物的6名男性血漿中K6含量分別為4.969、
5.2636、9.008、5.006、1.295、4.254ng.mL、
[0048]實(shí)施例2:人血漿中K6濃度的測(cè)定
[0049]參照實(shí)施例1,6名女性空腹服用大葉筠有效部位提取物(含K620.8mg),用250mL溫開(kāi)水送服;于給藥后3h 采集外周靜脈血4mL,注入肝素管內(nèi),避光,離心(3000r.mirT1,1min)制備血漿。含藥血漿樣品處理及測(cè)定條件相同,結(jié)果給予過(guò)大葉筠有效部位提取物的 6 名女性血漿中 K6 含量分別為 9.323、12.54、12.55、13.09,5.011,7.569ng.mL'
【權(quán)利要求】
1.一種測(cè)定血漿中5’-甲氧基_3’,4’-亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺濃度的方法,其特征在于,血漿樣品經(jīng)預(yù)處理后經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)其濃度,具體方法包括如下步驟: (1)血漿樣品預(yù)處理:取血漿樣品,加入內(nèi)標(biāo)替硝唑溶液,加入乙酸乙酯萃取,吸取上層有機(jī)相,40°C下減壓濃縮揮干,加入80v/v%甲醇水溶液溶解,離心后取上清液; (2)將步驟(I)預(yù)處理后的血漿樣品進(jìn)行液相色譜分離:色譜柱為AgilentZOBAX SBα8,4.6Χ150πιπι,5μπι;流動(dòng)相:體積比為80:20的甲醇與0.2mmol.L-1醋酸胺水溶液;流速:400mL.miiT1 ;柱溫:35°C ;進(jìn)樣量:5 μ L ;洗脫方式為等度洗脫; (3)質(zhì)譜測(cè)定:條件為:離子源:電噴霧離子化電離源ESI;離子檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè);離子極性:正離子;離子源電壓IS:5000V ;離子源溫度TEM:400 0C ;碰撞氣CAD:1L.mirf1 ;氣簾氣 CUR:20L.mirf1 ;離子源 Gasl:60L.mirf1 ;離子源 Gas2:70L.mirf1 ;檢測(cè)對(duì)象的離子選擇通道:5’ -甲氧基_3’,4’ -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺,[M+H]+,m/z278.1/205.1,DP140, EP10, CE21, CXP9 ;內(nèi)標(biāo)替硝唑,[M+H]+,m/z248.1/128.0, DP100,EP10, CE30, CXP8 ; (4)計(jì)算:采用內(nèi)標(biāo)法,以5’-甲氧基_3’,4’ -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺和內(nèi)標(biāo)替硝唑的峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算5’ -甲氧基_3’,4’ -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定血漿中5’-甲氧基-3’,4’ -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺濃度的方法,其特征在于,步驟(I)中,于10.0mL玻璃試管中精密加入血漿樣品0.5mL,精密加入內(nèi)標(biāo)105.6ng.mL—1替硝唑溶液20 μ L,旋渦1s,加入4.0mL乙酸乙酯,旋潤(rùn)振蕩3min,3000r.mirT1離心1min,吸取上層有機(jī)相4mL, 4(TC下減壓濃縮揮干,加入100 μ L80v/v%甲醇水溶液復(fù)溶,旋渦lmin,12000r.mirT1離心5min,吸取上清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定血漿中5’-甲氧基-3’,4’ -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺濃度的方法,其特征在于,所述的血漿為口服大葉筠有效部位提取物后的血漿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定血漿中5’-甲氧基-3’,4’ -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺濃度的方法,其特征在于,所述血漿為人或動(dòng)物的血漿。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK104076116SQ201410303081
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月27日
【發(fā)明者】張軍, 儲(chǔ)繼紅, 李長(zhǎng)印, 居文政, 吳婷, 許美娟, 劉史佳 申請(qǐng)人:江蘇省中醫(yī)院