一種同時(shí)測定四逆劑植物藥血漿中5種生物堿的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種同時(shí)測定四逆劑植物藥血漿中5種生物堿的方法。包括：（1）取哺乳類動(dòng)物給予四逆劑植物藥的含藥血漿，加入草烏甲素（內(nèi)標(biāo)），氨水堿化，渦旋，加入乙酸乙酯萃取，渦漩，離心，下層液再用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯層，氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)昧鲃?dòng)相溶解;（2）HPLC-MS-MS測定：流動(dòng)相：A相為乙腈-0.1%冰醋酸（1:99，v/v），B相為乙腈-水（99:1,?v/v）；質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），采用正離子模式檢測；檢測離子：烏頭堿m/z?646.3→586.3；新烏頭堿m/z?632.3→572.3；次烏頭堿m/z?616.3→556.3；苯甲酰新烏頭原堿m/z?590.3→558.3；苯甲酰烏頭原堿m/z?604.3→554.3。本發(fā)明適用于四逆劑植物藥中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。
【專利說明】—種同時(shí)測定四逆劑植物藥血漿中5種生物堿的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬藥物代謝動(dòng)力學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及四逆劑植物藥中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿在哺乳動(dòng)物血漿中的測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]四逆湯由附子、干姜、炙甘草等藥物組成，在保護(hù)心肌、改善心功能、防止缺血-再灌注的損傷等方面均具有較好的防治作用，但對(duì)四逆湯植物藥缺乏藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究，難以為質(zhì)量控制、劑型設(shè)計(jì)、臨床合理用藥提供依據(jù)。
[0003]四逆湯中的藥效成分主要為附子中的生物堿類成分。附子中生物堿類成分主要可以分為雙脂型生物堿、單脂型生物堿和胺基醇類生物堿。其中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等為雙脂型二萜類生物堿，單脂型生物堿如苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿是雙脂型生物堿的水解產(chǎn)物，其毒性僅約為烏頭堿的千分之一，進(jìn)一步水解為胺基醇類生物堿毒性更低，但其藥效卻未有明顯降低[陳信義，李蛾，侯麗，等[J].烏頭類生物堿研究進(jìn)展與應(yīng)用前景評(píng)述[J].中國中醫(yī)藥信息雜志2004，11 (10):922-923]。
[0004]到目前為止，文獻(xiàn)僅有 對(duì)血漿樣品中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等雙脂型二萜類生物堿的測定方法[何雷萍，狄斌，杜迎翔，等.4種附子配伍方給藥后大鼠血漿中3個(gè)烏頭類生物堿的藥動(dòng)學(xué)比較[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010,41(1): 55- 59;沈紅，朱玲英，姚楠，等.甘草與附子配伍對(duì)烏頭堿新烏頭堿、次烏頭堿大鼠藥動(dòng)學(xué)的影響[J].中藥材，2011，34(6):937-942]，尚未見四逆劑植物藥血漿樣品中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿的同時(shí)測定方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供四逆劑植物藥中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿的同時(shí)測定方法，該方法用于藥代動(dòng)力學(xué)研究，闡明四逆劑植物藥中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿的藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律。
[0006]( I)哺乳類血漿樣品預(yù)處理
取哺乳類動(dòng)物給予四逆劑植物藥的含藥血漿100μ L，加入草烏甲素(內(nèi)標(biāo))10 UL (10ng.ml/1),氨水10 μ L堿化,潤旋30s,按照1:4- 1:10體積比加入乙酸乙酯,潤鏇3-5 min,離心10 min (4000-10000 r ^mirT1),取上清液，下層液再用1:4體積比乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯層，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)昧鲃?dòng)相100 yL溶解。
[0007](2 ) HPLC-MS-MS 測定
色譜條件:色譜柱:CAPCELL PAK C18 (100 mmX4.6 mm, 5 ym),流動(dòng)相:A相為乙腈-0.1%冰醋酸(1:99，v/v)，B相為乙腈-水(99:1，v/v);質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI)，采用正離子模式檢測，檢測離子:烏頭堿[M+H]+，m/z 646.3 — 586.3，dp:120V，CE:47V ;新烏頭堿[M+H]+, m/z 632.3 — 572.3,642.3 — 640.3，dp:120V，CE:45V ;次烏頭堿[M+H]+, m/z 616.3 — 556.3,616.3 — 524.3，dp:120V，CE:47V ;苯甲酰新烏頭原堿M+H]+, m/z 590.3 — 558.3,590.3 — 540.3，dp:120V，CE:47V ;苯甲酰烏頭原堿 M+H]+，m/z 604.3 — 554.3,604.3 — 572.3，dp:120V，CE:50V。
[0008]所述四逆劑包括附子干姜湯、四逆湯及其制劑；所述步驟(1)采用草烏甲素為內(nèi)標(biāo)物；所述步驟(2)采用正離子模式檢測。
[0009]本發(fā)明在液液萃取中，被檢測組分在不相混溶的兩種溶劑中分配，選擇合適的有機(jī)溶劑及合適的比例，可使溶于血漿中的非極性組分提取進(jìn)入有機(jī)相，再將有機(jī)相用氮?dú)獯蹈筛患?。利用HPLC法將被檢測組分與其他化學(xué)成分分離，最后聯(lián)用MS檢測器進(jìn)行檢測。
[0010]本發(fā)明采用草烏甲素作為內(nèi)標(biāo)，使分析方法更加靈敏、準(zhǔn)確，有利于四逆湯植物藥中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿的同時(shí)測定。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1四逆湯植物藥中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿HPLC-MS-MS色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面將結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)例及實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明方法。應(yīng)理解，這些實(shí)驗(yàn)例及實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的范圍。此外，應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或者修改，這些等價(jià)形式同樣落后于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0013]實(shí)驗(yàn)例I非內(nèi)標(biāo)法線性關(guān)系考察
取空白血漿7份，每份ΙΟΟμ 1，加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使血漿中的烏頭堿濃度為
0.06,0.6、3、6、30、60、300 ng.πι?Λ 新烏頭堿濃度為 0.102,1.02,5.1,10.2、51、102、510ng ^mL4,次烏頭堿 0.13、1.3、6.5、13、65、130、650 ng ^mL4,苯甲酰新烏頭堿濃度為 0.1、1、
5、10、50、100、500 ng.mL'苯甲酰烏頭原堿濃度為 0.12、1.2、6、12、60、120、600 ng.πι?Λ制得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0014]以各對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)，以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法回歸(權(quán)重系數(shù)1/C)，得到各對(duì)照品的回歸方程?；貧w曲線結(jié)果表明:
烏頭堿在0.06-300 ng.mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好:y = 0.486 x -1.68 (r =
0.9765);苯甲酰烏頭原堿在0.12-600 ng.mL—1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好:y = 0.1472x-1.45 (r = 0.9638);苯甲酰新烏頭堿在0.1-1000 ng.mL—1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好:y=0.324 X -0.654 (r = 0.9754);次烏頭堿在0.13-650 ng.mL—1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好:y = 1.09 X -8.63 (r = 0.9658);新烏頭堿在0.102-500 ng.ml/1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好:y = 0.389 X -1.86 (r = 0.9542)。
[0015]實(shí)驗(yàn)例2內(nèi)標(biāo)法線性關(guān)系考察
取空白血漿7份，每份?οομ 1，加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使血漿中的烏頭堿濃度為
0.06,0.6、3、6、30、60、300 ng.πι?Λ 新烏頭堿濃度為 0.102,1.02,5.1,10.2、51、102、510ng ^mL4,次烏頭堿 0.13、1.3、6.5、13、65、130、650 ng ^mL4,苯甲酰新烏頭堿濃度為 0.1、1、
5、10、50、100、500 ng.mL'苯甲酰烏頭原堿濃度為 0.12、1.2、6、12、60、120、600 ng.πι?Λ制得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0016]以各對(duì)照品的濃度與內(nèi)標(biāo)濃度比值X為橫坐標(biāo)，以對(duì)照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積百分比Y為縱坐標(biāo)，以Y對(duì)X作加權(quán)最小二乘法回歸(權(quán)重系數(shù)1/C)，得到各對(duì)照品的回歸方程?；貧w曲線結(jié)果表明:
烏頭堿在0.06-300 ng.HiL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好:y = 0.467 x -1.54 (r =
0.9986);苯甲酰烏頭原堿在0.12-600 ng.ml/1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好:y = 0.147 x-1.37 (r = 0.9966);苯甲酰新烏頭堿在0.1-1000 ng.mL—1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好:y=0.306 X -0.484 (r = 0.9955);次烏頭堿在0.13-650 ng.mL—1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好:y = 1.07 X -7.75 (r = 0.9974);新烏頭堿在0.102-500 ng.mL—1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好:y = 0.409 X -2.32 (r = 0.9982)。
[0017]實(shí)驗(yàn)例3 精密度和回收率考察
取空白血漿100 μ I，加入草烏甲素(內(nèi)標(biāo))溶液及不同濃度的對(duì)照品溶液，配制各含烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰新烏頭堿1、10、100 WmL-S個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，每個(gè)濃度各做5份樣品，測定方法學(xué)精密度。
[0018]另取空白血漿，得到空白血漿上清液，然后加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液及草烏甲素溶液制得各含烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰新烏頭堿1、10、100ng^L-1的對(duì)照溶液。進(jìn)樣分析，計(jì)算提取回收率。見表1。由表可以看出，烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿的精密度和提取回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果均符合生物樣品分析的要求。
[0019]` 表1精密度和回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)
實(shí)驗(yàn)例4穩(wěn)定性考察
取空白血漿100 μ 1，，加入內(nèi)標(biāo)溶液及對(duì)照品溶液，制備含藥血漿樣品，分別在室溫放置0、18 h、反復(fù)凍融(_20°C) 3次和長期冰凍，進(jìn)樣前加入草烏甲素溶液(內(nèi)標(biāo))，后進(jìn)樣分析。結(jié)表明樣品在18 h，-20°C反復(fù)凍融3次及長期冰凍條件下均穩(wěn)定，結(jié)果見表2。
[0020]表2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)
【權(quán)利要求】
1.一種同時(shí)測定四逆劑植物藥血漿中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿的方法，包括下列步驟: (1)哺乳類血漿樣品預(yù)處理 將哺乳類給予四逆劑植物藥的含藥血漿，加入內(nèi)標(biāo)物，氨水堿化，渦旋30s，按照1:4-1:10體積比加入乙酸乙酯，潤鏇3-5 min,離心10 min,轉(zhuǎn)速為4000-10000 r.mirT1,移出上清液，下層液再用1:4體積比乙酸乙酯同樣操作2次，合并3次上清液，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)昧鲃?dòng)相100 μ L溶解； (2)HPLC_MS_MS測定色譜條件:色譜柱:C18,100mmX4.6 mm, 5 μπι，流動(dòng)相:A相為乙腈-0.1%冰醋酸(1:99，v/v)，B相為乙腈-水(99:1，v/v);質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI)，采用正離子模式檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種同時(shí)測定四逆劑植物藥血漿中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿的方法，其特征在于，所述四逆劑包括附子干姜湯、四逆湯及其制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種同時(shí)測定四逆劑植物藥血漿中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿的方法，其特征在于，所述步驟(1)加入內(nèi)標(biāo)物為草烏甲素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種同時(shí)測定四逆劑植物藥血漿中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿的方法，其特征在于，檢測離子:烏頭堿[M+H]+，m/z 646.3 — 586.3，dp:120V，CE:47V ;新烏頭堿[M+H]+，m/z 632.3 — 572.3，642.3 — 640.3，dp: 120V, CE:45V ;次烏頭堿[M+H]+，m/z 616.3 — 556.3,616.3 — 524.3，dp:120V, CE:47V ;苯甲酰新烏頭原堿M+H]+，m/z 590.3 — 558.3,590.3^540.3, dp:120V，CE47V ;苯甲酰烏頭原堿 M+H]+，m/z 604.3 — 554.3,604.3 — 572.3，dp:120V，CE:50V。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103512989SQ201210220910
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月29日
【發(fā)明者】洪燕龍, 馮怡, 阮克鋒, 趙懷彬, 吳飛, 王優(yōu)杰 申請(qǐng)人:上海張江中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)工程研究中心