一種毛細(xì)管電泳篩選棘白菌素類藥物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種毛細(xì)管電泳篩選棘白菌素類藥物的方法，采用從活性和結(jié)構(gòu)兩方面入手的新型篩選途徑，以抗原抗體競爭結(jié)合為模型，使用毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光(CE-LIF)的檢測方法，來進(jìn)行棘白菌素類抗真菌藥物的篩選。本發(fā)明提出抗原抗體競爭結(jié)合的毛細(xì)管電泳篩選模型，建立并驗(yàn)證篩選標(biāo)準(zhǔn)，以菌種發(fā)酵液為篩選介質(zhì)，成功篩選出了有效的菌種。本發(fā)明開發(fā)的方法具有較高的選擇性和特異性，利用競爭結(jié)合模式，有利于發(fā)現(xiàn)全新的活性化合物。CE-LIF技術(shù)的應(yīng)用，提高了方法的檢測靈敏度，且通過毛細(xì)管電泳的分離性能可以降低篩選過程中假陽性反應(yīng)發(fā)生的可能性，進(jìn)一步提高篩選效率。
【專利說明】一種毛細(xì)管電泳篩選棘白菌素類藥物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及棘白菌素類藥物篩選領(lǐng)域，具體的說涉及一種毛細(xì)管電泳篩選棘白菌素類藥物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]從活性開始的藥物篩選，首先對大量化合物進(jìn)行活性檢測，然后對篩選出來的新化合物(new chemical entities, NCEs)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和性能測試,根據(jù)具體的結(jié)果設(shè)計(jì)下步的優(yōu)化修飾。雖然高通量藥物篩選(High-throughput drug screening, HTS)提高了所篩選化合物的種類和數(shù)量，但是，在實(shí)際篩選中，從活性開始的研究過程非常慢，耗時(shí)長，并且花費(fèi)巨大。這主要是因?yàn)閱渭兊卦黾臃N類和數(shù)量，并不一定會同等比例地篩選出更多的活性化合物，大部分只是增大了工作量，浪費(fèi)了時(shí)間、經(jīng)歷和錢財(cái)在無效的化合物上。另外由于藥物作用是一個復(fù)雜的過程，只依靠某個指標(biāo)進(jìn)行篩選，獲得活性排序，有很大的誤導(dǎo)性，而選用不同性能和指標(biāo)來進(jìn)行篩選，選定的活性化合物及其排序可能完全不一樣，并且單一活性標(biāo)準(zhǔn)篩選出的化合物其他方面不一定適合作為先導(dǎo)化合物。目前有一些方法能夠提高該途徑獲得先導(dǎo)化合物的幾率，如限制待篩選物為已知的與相關(guān)疾病有關(guān)的天然化合物庫(植物、微生物代謝物等)中的化合物，如與老年癡呆癥有關(guān)的乙酰膽堿酯酶，從相關(guān)性化合物庫中尋找能夠影響該酶活性的化合物。與傳統(tǒng)的從活性入手篩選方法比，此法篩選速度快。美國Eureka公司和Tang等都從天然產(chǎn)物中篩選了此酶的抑制劑。
[0003]從藥物結(jié)構(gòu)開始的藥物篩選，即找到藥物具有活性的核心結(jié)構(gòu)，以該結(jié)構(gòu)為篩選標(biāo)準(zhǔn)，對篩選鑒定或合成的結(jié)構(gòu)類似物，在進(jìn)行活性測定。該途徑的基礎(chǔ)在于化合物的藥物活性、與機(jī)體的相互作用及物理性質(zhì)歸根結(jié)底是由其分子結(jié)構(gòu)決定的，這樣篩選出來的結(jié)構(gòu)類似物具有了關(guān)鍵性的核心結(jié)構(gòu)，則其理論上就具有了相應(yīng)的藥物活性，接下來可以通過化學(xué)修飾增大其藥物活性或提高其生物利用度。該法可以大大地提高研發(fā)效率。但是這種方法也有其局限性，隨著藥物研發(fā)的高速發(fā)展，可供選擇的核心化合物越來越少，相應(yīng)的競爭就越來越激烈。
[0004]從藥物活性和結(jié)構(gòu)開始的藥物篩選方法先以活性藥物的核心結(jié)構(gòu)作為抗原，生產(chǎn)出相應(yīng)的多克隆抗體。然后利用此抗體，從具有相關(guān)性能的化合物庫中篩選相近化學(xué)結(jié)構(gòu)的分子。最后通過化學(xué)修飾得到具有獨(dú)特核心結(jié)構(gòu)的活性化合物。由該方法篩選出來的化合物，結(jié)構(gòu)新穎，性能明確，活性好。Yao等在該方面做了很多研究，首次使用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)的方法從發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)包括氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類抗菌素以及糖基多肽類等新的天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。但是由于使用的為ELISA來檢測分析，故而具有了 ELISA常見的缺點(diǎn)，操作繁瑣，多次的洗脫加樣也增大了出現(xiàn)假陽性反應(yīng)的幾率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種毛細(xì)管電泳篩選棘白菌素類藥物的方法，從藥物活性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行篩選，并使用毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測，克服現(xiàn)有技術(shù)中一般的藥物篩選周期長，而且耗費(fèi)巨大，常出現(xiàn)假陽性反應(yīng)的問題。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0007]—種毛細(xì)管電泳篩選棘白菌素類藥物的方法，包括以下步驟:
[0008](I)活性核心結(jié)構(gòu)EBN與熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，標(biāo)記混合物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，計(jì)算電泳淌度；
[0009](2)標(biāo)記混合物與Ab反應(yīng)，反應(yīng)后進(jìn)行毛細(xì)管電泳，計(jì)算電泳淌度；
[0010](3)標(biāo)記混合物、Ab、發(fā)酵液反應(yīng)，反應(yīng)后進(jìn)行毛細(xì)管電泳，計(jì)算電泳淌度；
[0011](4)比較電泳淌度差值變化情況，判斷是否有競爭結(jié)合。
[0012]所述步驟(I)中毛細(xì)管電泳檢測器為激光誘導(dǎo)熒光檢測器。
[0013]所述步驟(I)中熒光標(biāo)記物為FITC、羅丹明B、TRITC、吖啶黃或Cy3。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明利用抗原抗體競爭結(jié)合模型和毛細(xì)管電泳分離檢測手段，建立了一種新型藥物篩選方法，并成功篩選出了有效物質(zhì)，該技術(shù)具有較高的選擇性和特異性，篩選的對象為特定的化合物庫，有助于篩選效率的提高，利用競爭結(jié)合模式，有利于發(fā)現(xiàn)全新的活性化合物，以往無法偵查漏網(wǎng)的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)也有重新被發(fā)現(xiàn)的可能。CE-LIF技術(shù)的應(yīng)用，提高了方法的檢測靈敏度，簡化了檢測步驟，且通過毛細(xì)管電泳的分離性能可以降低篩選過程中假陽性反應(yīng)發(fā)生的可能性，進(jìn)一步提高篩選效率。
[0015]本發(fā)明采用從活性和結(jié)構(gòu)兩方面入手的新型篩選途徑，以抗原抗體競爭結(jié)合為模型，使用毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光(CE-LIF)檢測方法進(jìn)行棘白菌素類抗真菌藥物的篩選。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為CE-LIF檢測ECB與Ag*競爭結(jié)合情況圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。
[0018]本發(fā)明旨在建立一種毛細(xì)管電泳篩選棘白菌素類藥物的方法，選取抗真菌藥物棘白菌素 B(Echinocandin B, ECB)的母核結(jié)構(gòu)(EchinocandinBnucleus, EBN)為抗原，開發(fā)出相應(yīng)的多克隆抗體，以抗原抗體之間的特異性識別和高親和能力為前提，從具有相關(guān)性能的化合物庫(菌種發(fā)酵液)中篩選相近化學(xué)結(jié)構(gòu)的分子，具體技術(shù)方案如下:
[0019]競爭結(jié)合模型篩選原理
[0020]CE常用的傳統(tǒng)檢測器為紫外檢測器，但是其檢測限高，一般為10_6M，并且其特異性差，大多物質(zhì)均具有紫外吸收，而藥物篩選的介質(zhì)具有復(fù)雜的特性，大多數(shù)情況下目標(biāo)物質(zhì)在介質(zhì)中的濃度較低，所以該檢測器并不是非常適用于藥物篩選。激光誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測器采用能夠單向發(fā)光、亮度極高的激光激發(fā)樣品發(fā)射熒光，通過檢測熒光強(qiáng)度進(jìn)行定性定量分析，檢測限達(dá)到10_1(ι-10_12Μ，能夠提高對低濃度物質(zhì)的檢測，并且其特異性強(qiáng)，只有具有熒光發(fā)射的化合物才能夠被檢測到，排除了其他物質(zhì)的干擾。
[0021]由于我們選用的抗體為多克隆抗體，其組分復(fù)雜，并不利于熒光標(biāo)記，且抗體為大分子化合物，與抗原(EBN)結(jié)合后電泳性質(zhì)不易發(fā)生改變。而EBN具有一個游離的氨基，且分子較小，與抗體反應(yīng)后其電泳性質(zhì)的改變較易觀察，故而選擇使用異硫氰酸熒光素(FITC)對EBN進(jìn)行標(biāo)記，得到Ag*。
[0022]Ag* (標(biāo)記EBN)與其Ab (多克隆抗體)結(jié)合后，其CE性質(zhì)會發(fā)生改變，包括其電泳淌度、峰面積等的變化，而在該混合體系中加入另一種能夠與Ab結(jié)合的物質(zhì)，如ECB，當(dāng)Ab少量時(shí)，ECB就會與Ag*競爭結(jié)合抗體，Ag*與Ab的結(jié)合作用就會減弱，而激光誘導(dǎo)熒光檢測只能夠顯示有熒光發(fā)射的物質(zhì)狀態(tài)，故而在電泳圖譜中就會顯現(xiàn)出Ag*電泳性質(zhì)的改變強(qiáng)度的減弱。通過該方法我們就可以建立一種簡單的競爭結(jié)合模型，在后續(xù)的篩選中，將ECB換為菌種發(fā)酵液，若其中含有EBN類似物，則會出現(xiàn)競爭結(jié)合現(xiàn)象。
[0023]實(shí)施例1
[0024]ECB與EBN競爭結(jié)合模型的建立，及判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定。
[0025]EBN與FITC以1:2的質(zhì)量比混合，溶于一定體積的0.05M pH9.0碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液溶解，另配制相同濃度的FITC空白溶液，震蕩混合均勻，在4°C冰箱中反應(yīng)12h (避光、過夜反應(yīng))。
[0026]用蒸餾水配制Ab，加入標(biāo)記混合物中(含Ag*)，磷酸調(diào)pH7.0、30°C溫度下避光反應(yīng)lOmin，電泳檢測。在混合體系中加入一定量的ECB，相同條件下反應(yīng)，電泳檢測觀察變化。
[0027]結(jié)果如圖1所示標(biāo)記混合物中按出峰時(shí)間，第一個峰為Ag*，第二個峰為過量的FITC0，對應(yīng)的毛細(xì)管電泳條件為:毛細(xì)管總長27cm，有效長度20cm，內(nèi)徑75 μ m，緩沖液為20mMpH7.45Tris_磷酸，正模式運(yùn)行，運(yùn)行電壓為8kV，氣壓進(jìn)樣3s，運(yùn)行電壓8kv，激光誘導(dǎo)熒光檢測，激發(fā)波長473nm，熒光發(fā)射波長520nm。標(biāo)記混合物與Ab結(jié)合后，Ag*與FITC的峰型均拖后展寬，熒光發(fā)射強(qiáng)度也都發(fā)生了變化，由于Ab對于FITC的響應(yīng)強(qiáng)度有明顯的影響，那么就不能排除Ag*峰強(qiáng)度的變化是由于Ab對其上的FITC的影響還是對Ag*本身的影響導(dǎo)致的，而在毛細(xì)管電泳中，電泳淌度的變化也是能夠表征結(jié)合狀態(tài)的，為了去除FITC的變化對結(jié)果的影響,故后續(xù)篩選中選擇通過比較Ag*與FITC之間的相對電泳淌度的變化來表征Ag*與Ab的反應(yīng)情況。
[0028]在加入Ab后，Ag*與FITC 二者出峰時(shí)間差距增大，電泳淌度差值增大。而當(dāng)在混合體系中引入ECB作為競爭結(jié)合物后，電泳淌度差值又呈現(xiàn)減小趨勢，說明在體系中存在競爭結(jié)合情況，ECB能夠與Ag*競爭結(jié)合Ab，減弱了 Ag*與Ab的結(jié)合，并且對于Ag*與Ab的結(jié)合影響較大，故后續(xù)的篩選中以Ag*與Ab的電泳淌度差值的變化作為篩選依據(jù)。
[0029]實(shí)施例2
[0030]篩選模型的驗(yàn)證
[0031]我們選取的篩選介質(zhì)為菌種發(fā)酵液，采用的樣品前處理方法為簡單的甲醇提取法，故篩選介質(zhì)中成分復(fù)雜，在進(jìn)行篩選前，使用陽性和陰性菌種發(fā)酵液對篩選模型和判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)合反應(yīng)條件同實(shí)施例1。
[0032]三種白僵菌模式菌株NRRL8112、8113、11440，能夠產(chǎn)生ECB，為陽性菌種，其發(fā)酵液能夠與Ag*競爭結(jié)合，電泳檢測能夠出現(xiàn)陽性反應(yīng)。四種曲霉菌ACCC32292、32416、30005、31880，為陰性菌種，這是因?yàn)镋CB能夠抑制曲霉的生長，故而四種曲霉的發(fā)酵液中不會含有ECB及其類似物，可以作為陰性對照。
[0033]結(jié)果如表1、2所示，加入標(biāo)記混合物與Ab結(jié)合后，Ag*與FITC之間相對電泳淌度差值增大。而加入ECB競爭結(jié)合時(shí)，其差值變化減小，說明ECB與Ag*之間存在競爭結(jié)合。后加入NRRL8112，NRRL8113, NRRLl 1440白僵菌發(fā)酵液，含ECB，與Ag*競爭結(jié)合，可以看到電泳淌度差值變化減小，存在競爭結(jié)合?？梢钥闯鲆阅壳暗臋z測水平，能夠?qū)渭兗状继崛『蟮陌l(fā)酵液進(jìn)行檢測。
[0034]而對于陰性菌株，加入陰性發(fā)酵液競爭結(jié)合時(shí)，其差值變化增大，與加入ECB和陽性發(fā)酵液時(shí)差值減小的現(xiàn)象相反，說明陰性發(fā)酵液與Ag*之間不存在競爭結(jié)合，反而其能夠與Ag*進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)一步加大其反應(yīng)結(jié)果，使得電泳淌度差值變化增大。這里考慮ECB能夠抑制曲霉的生長，而我們對發(fā)酵液采用的是較為簡單的甲醇提取，這樣曲霉細(xì)胞內(nèi)能夠溶解于有機(jī)相的物質(zhì)都存在與篩選介質(zhì)中，則其中與β_(1，3)-葡聚糖合成相關(guān)的物質(zhì)則能夠與Ag*進(jìn)行反應(yīng),這樣Ab與發(fā)酵液都能夠與Ag*進(jìn)行反應(yīng),進(jìn)一步加大Ag*與FITC之間相對電泳淌度差值。
[0035]實(shí)施例3
[0036]藥物篩選
[0037]結(jié)合反應(yīng)條件同實(shí)施例1，對7種未知菌種ZXL07252a，ZXL07293a, DH08037,ZLK2-163-1F，ZL2-91-1F，ZL2-17-1F，ZJ2-320-1F發(fā)酵液進(jìn)行篩選，結(jié)果如表3所示，結(jié)果可以看出，加入標(biāo)記混合物與抗體結(jié)合后，標(biāo)記抗原與FITC之間相對電泳淌度差值增大。加入菌種ZJ2-320-1F，ZLK2-163-1F，ZL2-91-1F發(fā)酵液甲醇提取物后，該差值減小，其中ZJ2-320-1F，ZLK2-163-1F基本與空白標(biāo)記混合物中二者差值相符，這一現(xiàn)象符合陽性發(fā)酵液結(jié)果，故判斷這三種發(fā)酵液產(chǎn)物中可能有結(jié)構(gòu)與EBN相似的活性化合物。菌種DH08037的發(fā)酵液加入后結(jié)果變化不大，其余三種發(fā)酵液加入后差值繼續(xù)增大，符合陰性發(fā)酵液的結(jié)果，故而判斷這四種發(fā)酵液為陰性，不含有EBN結(jié)構(gòu)類似的活性物質(zhì)。
[0038]表1陽性菌種發(fā)酵液與Ag*競爭結(jié)合結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種毛細(xì)管電泳篩選棘白菌素類藥物的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)活性核心結(jié)構(gòu)EBN與熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，標(biāo)記混合物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，計(jì)算電泳淌度； (2)標(biāo)記混合物與Ab反應(yīng)，反應(yīng)后進(jìn)行毛細(xì)管電泳，計(jì)算電泳淌度； (3)標(biāo)記混合物、Ab、發(fā)酵液反應(yīng)，反應(yīng)后進(jìn)行毛細(xì)管電泳，計(jì)算電泳淌度； (4)比較電泳淌度差值變化情況，判斷是否有競爭結(jié)合。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述毛細(xì)管電泳篩選棘白菌素類藥物的方法，其特征在于，所述步驟(I)中毛細(xì)管電泳檢測器為激光誘導(dǎo)熒光檢測器。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述毛細(xì)管電泳篩選棘白菌素類藥物的方法，其特征在于，所述步驟(I)中熒光標(biāo)記物為F ITC、羅丹明匕了1?11'(:、吖啶黃或073。
【文檔編號】G01N33/15GK103995038SQ201410234389
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】李優(yōu)鑫, 包建民, 高赫男, 孫超慧 申請人:天津大學(xué)