檢測鴿Ⅰ型副粘病毒的膠體金免疫層析試紙條及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測鴿Ⅰ型副粘病毒的膠體金免疫層析試紙條，它包括PVC膠板、硝酸纖維素膜、膠體金結合墊、樣品墊和吸水墊；所述PVC膠板的一端粘附有所述樣品墊，其另一端粘附有所述吸水墊，其中部依次粘附有所述膠體金結合墊、所述硝酸纖維素膜；所述膠體金結合墊的一端與所述樣品墊相粘附，其另一端與所述硝酸纖維素膜相粘附，該硝酸纖維素膜與所述吸水墊相粘附；所述膠體金結合墊包被了帶有抗鴿Ⅰ型副粘病毒F蛋白單克隆抗體的膠體金標記蛋白；所述硝酸纖維素膜上沿樣品流動方向依次設有檢測線、質(zhì)控線。本發(fā)明可快速、簡便、準確、無需任何儀器設備就能檢測鴿新城疫。
【專利說明】檢測鴿I型副粘病毒的膠體金免疫層析試紙條及制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及鴿I型副粘病毒免疫分析【技術領域】，尤其涉及檢測鴿I型副粘病毒的膠體金免疫層析試紙條及制備方法。
【背景技術】
[0002]鴻I型副粘病毒(Pigeon Paramyxovirus I, PPMV-1)病又稱鴻痕或鴻新城疫，是一種由禽I型副粘病毒(Avian Paramyxovirus I, PMV-1)引起的、流行于鴻群的高度接觸性急性傳染病，PPMV-1引起鴿群突然發(fā)病，迅速蔓延，臨床癥狀上與雞新城疫嗜神經(jīng)速發(fā)株引起的十分類似，主要臨床特點是腸炎、下痢和神經(jīng)癥狀，尤以嗜神經(jīng)速發(fā)型為多見，發(fā)病率和死亡率都很高。鴿I型副粘病毒對不同品種、不同年齡的鴿都有感染性，傳播迅速，死亡率高。在自然條件下，肉鴿、信鴿和賽鴿等各類鴿子均可感染發(fā)??；而且不同年齡的鴿子都可感染，發(fā)病率可高達80%~90%以上，死亡率因鴿子的年齡、品種及其免疫狀況和飼養(yǎng)管理狀況不同而有很大差異，為20%~80%之間，平均30%~50%，乳鴿感染后，死亡率可達60%~80%，處于孵化期的種胚感染后可全部死亡。成年鴿感染后，呈慢性經(jīng)過，無明顯的死亡高峰，最后因采食困難、消瘦衰竭死亡。該病的發(fā)生無明顯的季節(jié)性。一年四季均可發(fā)生，但多以秋冬、冬春多發(fā)。該病與新城疫一樣，通過空氣中的塵埃、污染的器具、飼料和飲水傳播，潛伏期廣10(1，一般1飛(1。鴿新城疫病其傳播迅速、發(fā)病率高，發(fā)病后死亡率較高，給養(yǎng)鴿業(yè)造成的影響和危害巨大，是養(yǎng)鴿業(yè)的重點防控的傳染病之一。
[0003]鴿I型副粘病毒病一般通過臨床癥狀和剖檢病變可作出初步診斷，單要確診，則需要進一步的方法，對于鴿新城疫的診斷方法目前大體可分為兩種:血清學方法和分子生物學方法。血清學方法除了經(jīng)典的血凝(HA)試驗、血凝抑制(HI)試驗、熒光抗體技術(IFA)、瓊脂擴散試驗(AGP)、乳膠凝集試驗(LAT)、雞胚中和試驗、蝕斑中和試驗等方法以外，還有利用單克隆抗體進行檢測ELISA診斷方法等。雖然HA和HI因具有操作簡單等優(yōu)點而被大多數(shù)的鴿場用于鴿新城疫的抗體監(jiān)測和的診斷，但HA和HI試驗常常會因為各種原因造成誤差，而且HI在檢測低水平的抗體時不夠靈敏，缺乏一定的可靠性。熒光抗體技術簡便、快速、敏感、準確、特異，適用于快速診斷，抗原在-70°C可長期保存，且全部試驗過程只需要lh，因而適用于較大規(guī)模的定性監(jiān)測SPF鴿抗體。ELIAS診斷方法是目前研究最多、進展最快的技術，各種形式的ELIAS廣泛應用于抗原、抗體的檢測；與其它血清學相比，ELIAS具有敏感性好、特異性強、操作簡便、可重復使用、抗原用量少的特點，同時結果便于長期保存，特別適合于基層獸醫(yī)部門和鴿場對NDV的血清學診斷和流行病學普查。隨著分子生物學技術的迅猛發(fā)展，現(xiàn)在也運用核酸技術對PPMV-1進行檢測，其中尤以PCR、核酸探針技術、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析(RFLP)和序列分析應用較為廣泛。以上這些方法雖然均有各自的優(yōu)點，但是均存在費時費力、需要特殊的儀器設備和專門的操作人員才能進行的缺點，很難在基層獸醫(yī)部門推廣應用。
[0004] 目前單克隆抗體在新城疫診斷方面的應用已經(jīng)十分廣泛，單克隆抗體用于NDV診斷，具有快速、靈敏和特異性強的優(yōu)點，并可用于強毒和弱毒的鑒別診斷，這是傳統(tǒng)的血清學方法所辦不到的。單克隆抗體已滲透到ND研究的許多領域。
[0005]鴿新城疫病毒編碼兩種囊膜糖蛋白，融合蛋白(F)和血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)，F(xiàn)蛋白位于囊膜外表面，形成纖突，對鴿新城疫的毒力及感染性起決定性作用，是鴿新城疫的主要免疫原性蛋白；F基因還具有較高的遺傳穩(wěn)定性，是新城疫基因分型的主要依據(jù)，也是決定鴿新城疫致病力強弱的關鍵因素；F基因的遺傳變異與鴿新城疫的變異和流行密切相關，是鴿新城疫分子流行病學研究的首選基因，因此，F(xiàn)基因是鴿新城疫的診斷和防治制劑研究的重要候選基因。
[0006]膠體金免疫層析(GICA)技術是90年代初在免疫滲濾技術基礎上建立的一種簡易快速的免疫學檢測技術，是一種將膠體金標記技術、免疫檢測技術和層析分析技術等多種方法有機結合在一起的固相標記免疫檢測技術。1971年Faulk和Taylor利用膠體金溶膠與兔抗沙門氏菌血清結合，作為標記探針，用免疫組織化學技術檢測沙門氏細菌的表面抗原，開創(chuàng)了膠體金在免疫分析領域應用的先河。免疫膠體金技術是繼熒光素、酶、同位素及乳膠標記技術之后的一種新型標記技術。免疫膠體金層析技術利用膠體金本身的顯色特點結合免疫層析技術即膠體金免疫層析法(GICA)診斷特異性的待測物，大多與單克隆抗體技術聯(lián)合應用，具有特異性強、靈敏度高、攜帶方便、檢測時間短、檢測不需任何儀器設備及安全可靠等優(yōu)勢，20世紀80年代末在臨床診斷領域開始應用，由Osikowicz和Beggst等最先用于人絨毛膜促性腺激素(HCG)的測定，近年來經(jīng)不斷完善，已有大量商品化試劑條在人醫(yī)中得到廣泛應用，也掀起了免疫膠體金技術研究和利用的熱潮。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種快速、簡便的檢測鴿I型副粘病毒的膠體金免疫層析試紙條。
[0008]本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是提供該檢測鴿I型副粘病毒的膠體金免疫層析試紙條的制備方法。
[0009]為解決上述問題，本發(fā)明所述的檢測鴿I型副粘病毒的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于:它包括PVC膠板、硝酸纖維素膜、膠體金結合墊、樣品墊和吸水墊；所述PVC膠板的一端粘附有所述樣品墊，其另一端粘附有所述吸水墊，其中部依次粘附有所述膠體金結合墊、所述硝酸纖維素膜；所述膠體金結合墊的一端與所述樣品墊相粘附，其另一端與所述硝酸纖維素膜相粘附，該硝酸纖維素膜與所述吸水墊相粘附；所述膠體金結合墊包被了帶有抗鴿I型副粘病毒F蛋白單克隆抗體的膠體金標記蛋白；所述硝酸纖維素膜上沿樣品流動方向依次設有檢測線、質(zhì)控線。
[0010]所述檢測線為以線形包被純化的抗鴿I型副粘病毒F蛋白單克隆抗體。
[0011]所述質(zhì)控線為以線形包被純化的羊抗鼠抗體。
[0012]如上所述的檢測鴿I型副粘病毒的膠體金免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟:
⑴免疫抗原的制備:
把鴿I型副粘病毒F基因片段連接到PGEX-4T-1原核表達載體中，經(jīng)IPTG誘導和分析，F(xiàn)蛋白在大腸桿菌BL21中得到高效表達，提取包涵體蛋白作為免疫抗原；
⑵抗體的制備: 將抗鴿I型副粘病毒F蛋白免疫BALB/C小鼠按照常規(guī)的單克隆抗體制備技術制備抗鴿I型副粘病毒F蛋白單克隆抗體，并進行純化，即得純化后的抗鴿I型副粘病毒F蛋白單克隆抗體；
⑶將硝酸纖維素膜粘附于PVC膠板的中部；
⑷將所述純化后的抗鴿I型副粘病毒F蛋白單克隆抗體涂到硝酸纖維素膜上，包被所述硝酸纖維素膜的一個區(qū)域，得到檢測線；
(5)將純化的羊抗鼠抗體包被所述硝酸纖維素膜的另一個區(qū)域，得到質(zhì)控線；
(6)制備抗鴻I型副粘病毒F蛋白單克隆抗體的父體金標記蛋白溶液:
首先按檸檬酸還原法制備膠體金溶液，然后用0.1moVLK2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至9.(T9.5，分別取ImL膠體金和50 μ g的所述純化后的抗鴿I型副粘病毒F蛋白單克隆抗體，攪拌混合，40min后再加體積濃度為5%BSA使其最終濃度為1%，其次以3000r/min的速率離心20min，棄去由凝聚的金膠粒形成的沉淀，得到上清液；最后，所述上清液在溫度為40C的條件下以12000rpm的速率離心30min，得到沉淀物，該沉淀物用100 μ L的0.015Μ且ρΗ=7.4的膠體金復溶液溶解，在4°C下保存，即得抗鴿I型副粘病毒F蛋白單克隆抗體的膠體金標記蛋白溶液；
⑴將玻璃纖維膜浸在所述抗鴿I型副粘病毒F蛋白單克隆抗體的膠體金標記蛋白溶液中，經(jīng)浸透、晾干，即得膠體金結合墊；所述膠體金結合墊在37°C下干燥至恒重后，粘附于所述硝酸纖維素膜上遠離所述質(zhì)控線的一端；
⑶將樣品墊放入0.05M、pH=8.5的Tris溶液中浸沒處理，得到處理后的樣品墊；
⑶在所述膠體金結合墊的一端在粘上所述處理后的樣品墊，其另一端粘附所述硝酸纖維素膜；所述處理后的樣品墊粘附于所述PVC膠板的一端；所述吸水墊與所述硝酸纖維素膜粘附，并粘附于所述PVC膠板的另一端。
[0013]所述步驟(6)中0.015M且pH=7.4的膠體金復溶液是指在IL PBS溶液中含有20g蔗糖、Ig BSA、lgPVP、0.02g疊氮鈉的PBS溶液。
[0014]所述步驟⑶中0.05M、pH=8.5的Tris溶液是指在IL Tris溶液中含有Ig BSAUgPVP.500mT, Tween_20、0.02g 疊氣納的 Tris 溶液。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點:
1、本發(fā)明首先構建鴿新城疫F蛋白原核表達載體，在大腸桿菌高效表達F蛋白，分析重組蛋白的免疫原性，用表達的F蛋白免疫小鼠制備單克隆抗體。然后采用檸檬酸三鈉還原法成功制備膠體金，以制備好的膠體金對單克隆抗體進行標記。再以膠體金標記的單克隆抗體制備免疫金墊，吸附于玻璃纖維；最后以單克隆抗體和羊抗鼠IgG分別噴點于硝酸纖維素膜上，成為T線和C線，制備成一種快速、簡便、準確、無需任何儀器設備就能檢測鴿新城疫免疫層析快速檢測試紙條。
[0016]2、本發(fā)明經(jīng)試驗，所得的試紙條特異性強，不與雞傳染性支氣管炎、雞減蛋綜合征、雞馬立克、豬瘟、豬傳染性胃腸炎、羊痘、大腸桿菌、沙門氏菌等其它樣品發(fā)生交叉反應，但可與新城疫發(fā)生交叉反應，因此，可用于鴿I型副粘病毒病和雞新城疫的診斷；同時，本發(fā)明準確性高；批間和批內(nèi)的重復性較好；且制備的試紙條置4°c避光密封干燥保存一年，37°C放置10天，對其性能沒有任何影響。
[0017]⑴有效性檢驗:隨機從同批待測試劑盒中抽取10個試紙條，在加樣孔加入100 μ L生理鹽水，平放，等待3~5min觀察檢測卡中部檢視窗的結果,但不可超過20min讀結果,兩條檢測線中當質(zhì)控線出現(xiàn)反應而檢測線不出現(xiàn)反應時，可判定試紙條有效；當兩線同時出現(xiàn)反應或只有檢測線出現(xiàn)反應，而質(zhì)控線不反應時，可判定該試紙條無效。
[0018]結果:10條試紙條的質(zhì)控線均出現(xiàn)紅色條帶，而檢測線均未出現(xiàn)條帶，表明所制備的試紙條均有效。
[0019]⑵陰陽相符合試驗:
①陽性符合試驗:
隨機從同批待測試劑盒中抽取10個試紙條，檢測鴿I型副黏病毒陽性樣品10份，測定時取100 μ L樣加在試紙 條加樣孔中，平放，等待3~5min觀察檢測卡中部檢視窗的結果，但不可超過20min讀結果，兩條檢測線同時出現(xiàn)時，判為陽性。
[0020]結果:10條試紙條兩條檢測線均出現(xiàn)紅色條帶，表明陽性符合率為100%。
[0021]②陰性符合試驗:
隨機從同批待測試劑盒中抽取10個試紙條，檢測鴿I型副黏病毒陰性樣品10份，測定時取100 μ L陰性樣品加在試紙條加樣孔中，平放，等待:T5min觀察試紙條中部檢視窗的結果，但不可超過20min讀結果，兩條檢測線中當質(zhì)控線出現(xiàn)反應而檢測線不出現(xiàn)反應時，判為陰性。
[0022]結果:10條試紙條的質(zhì)控線均出現(xiàn)紅色條帶而檢測線均沒有出現(xiàn)紅色條帶，表明陰性符合率為100%。
[0023]⑶重復性:
將不同批次的試紙條各檢測3份鴿I型副黏病毒陽性尿囊液和3份陰性尿囊液，每個樣品重復檢測5次，看其重復性是否良好。
[0024]結果:檢測結果一致，表明重復性良好。
[0025]⑷靈敏性試驗:
將3份不同血凝價的鴿I型副黏病毒尿囊液進行倍比稀釋后用試紙條檢測，比較血凝試驗和試紙條靈敏度。結果見表1。
[0026]表1靈敏性試驗結果
【權利要求】
1.檢測鴿I型副粘病毒的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于:它包括PVC膠板(I)、硝酸纖維素膜(2)、膠體金結合墊(3)、樣品墊(4)和吸水墊(5);所述PVC膠板(I)的一端粘附有所述樣品墊(4)，其另一端粘附有所述吸水墊(5)，其中部依次粘附有所述膠體金結合墊(3)、所述硝酸纖維素膜(2);所述膠體金結合墊(3)的一端與所述樣品墊(4)相粘附，其另一端與所述硝酸纖維素膜(2)相粘附，該硝酸纖維素膜(2)與所述吸水墊(5)相粘附；所述膠體金結合墊(3)包被了帶有抗鴿I型副粘病毒F蛋白單克隆抗體的膠體金標記蛋白；所述硝酸纖維素膜(2)上沿樣品流動方向依次設有檢測線(6)、質(zhì)控線(7)。
2.如權利要求1所述的檢測鴿I型副粘病毒的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于:所述檢測線(6)為以線形包被純化的抗鴿I型副粘病毒F蛋白單克隆抗體。
3.如權利要求1所述的檢測鴿I型副粘病毒的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于:所述質(zhì)控線(7)為以線形包被純化的羊抗鼠抗體。
4.如權利要求1所述的檢測鴿I型副粘病毒的膠體金免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟: ⑴免疫抗原的制備: 把鴿I型副粘病毒F基因片段連接到PGEX-4T-1原核表達載體中，經(jīng)IPTG誘導和分析，F(xiàn)蛋白在大腸桿菌BL21中得到高效表達，提取包涵體蛋白作為免疫抗原； ⑵抗體的制備: 將抗鴿I型副粘病毒F蛋白免疫BALB/C小鼠按照常規(guī)的單克隆抗體制備技術制備抗鴿I型副粘病毒F蛋白單克隆抗體，并進行純化，即得純化后的抗鴿I型副粘病毒F蛋白單克隆抗體； ⑶將硝酸纖維素膜(2)粘附于PVC膠板(I)的中部； ⑷將所述純化后的抗鴿I型副粘病毒F蛋白單克隆抗體涂到硝酸纖維素膜(2)上，包被所述硝酸纖維素膜(2)的一個區(qū)域，得到檢測線(6)； (5)將純化的羊抗鼠抗體包被所述硝酸纖維素膜(2)的另一個區(qū)域，得到質(zhì)控線(7)； (6)制備抗鴻I型副粘病毒F蛋白單克隆抗體的父體金標記蛋白溶液: 首先按檸檬酸還原法制備膠體金溶液，然后用0.1moVLK2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至9.(T9.5，分別取ImL膠體金和50 μ g的所述純化后的抗鴿I型副粘病毒F蛋白單克隆抗體，攪拌混合，40min后再加體積濃度為5%BSA使其最終濃度為1%，其次以3000r/min的速率離心20min，棄去由凝聚的金膠粒形成的沉淀，得到上清液；最后，所述上清液在溫度為40C的條件下以12000rpm的速率離心30min，得到沉淀物，該沉淀物用100 μ L的0.015Μ且ρΗ=7.4的膠體金復溶液溶解，在4°C下保存，即得抗鴿I型副粘病毒F蛋白單克隆抗體的膠體金標記蛋白溶液； ⑴將玻璃纖維膜浸在所述抗鴿I型副粘病毒F蛋白單克隆抗體的膠體金標記蛋白溶液中，經(jīng)浸透、晾干，即得膠體金結合墊(3);所述膠體金結合墊(3)在37°C下干燥至恒重后，粘附于所述硝酸纖維素膜(2)上遠離所述質(zhì)控線(7)的一端； ⑶將樣品墊(4)放入0.05M、pH=8.5的Tris溶液中浸沒處理，得到處理后的樣品墊(4)； ⑶在所述膠體金結合墊(3)的一端在粘上所述處理后的樣品墊(4)，其另一端粘附所述硝酸纖維素膜(2);所述處理后的樣品墊(4)粘附于所述PVC膠板(I)的一端；所述吸水墊(5 )與所述硝酸纖維素膜(2 )粘附，并粘附于所述PVC膠板(I)的另一端。
5.如權利要求4所述的檢測鴿I型副粘病毒的膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于:所述步驟(6)中0.015M且pH=7.4的膠體金復溶液是指在IL PBS溶液中含有20g蔗糖、Ig BSA、IgPVP、0.02g疊氮鈉的PBS溶液。
6.如權利要求4所述的檢測鴿I型副粘病毒的膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于:所述步驟⑶中0.05M、pH=8.5的Tris溶液是指在IL Tris溶液中含有Ig BSA、Ig PVP.500mT, Tween_20、0.02g 疊氣納的 Tris 溶液。
【文檔編號】G01N33/577GK103983780SQ201410219718
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月22日 優(yōu)先權日:2014年5月22日
【發(fā)明者】賀泂杰, 時永杰, 楊明, 張茜, 賀奮義, 郭慧琳, 朱新強, 張登基, 曾玉峰, 周磊 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所