一種百合斑駁病毒膠體金免疫層析檢測(cè)試劑卡及制備方法
【專利摘要】一種百合斑駁病毒膠體金免疫層析檢測(cè)試劑卡及制備方法，該試劑卡包括試劑卡槽、襯板、樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙，其中膠體金結(jié)合墊上含有金標(biāo)探針，襯板固定于試劑卡槽中，樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次排列連接于襯板上表面，硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測(cè)線和對(duì)照線，檢測(cè)線和對(duì)照線上分別包被的是兔抗LMoV多克隆抗體和羊抗兔IgG純化抗體；該百合斑駁病毒膠體金免疫層析檢測(cè)試劑卡的制備方法主要是將兔抗LMoV多克隆抗體包被于免疫層析膜上，同時(shí)用其制成膠體金結(jié)合墊；該試劑卡檢測(cè)快速、準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便，無(wú)需特殊的設(shè)備和儀器。
【專利說(shuō)明】一種百合斑駁病毒膠體金免疫層析檢測(cè)試劑卡及制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)試劑卡及制備方法，具體的是一種用膠體金免疫層析法快速 檢測(cè)百合斑駁病毒（LMoV)的試劑卡及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 百合（Lilium spp)是一種集觀賞、食用、藥用價(jià)值于一身的重要經(jīng)濟(jì)作物。2005 年，觀賞百合主要生產(chǎn)國(guó)荷蘭的面積達(dá)到3800hm 2,占全球總面積的72%，每年生產(chǎn)22. 1億 個(gè)百合種球，其中約1. 〇億個(gè)出口到中國(guó)。甘肅省蘭州市及其周邊定西、臨夏等地區(qū)食用百 合的面積已近lOOOOhm2,直接參與百合種植的農(nóng)戶已超過(guò)9萬(wàn)戶，百合已成為產(chǎn)區(qū)農(nóng)戶的主 要收人來(lái)源。盡管上世紀(jì)80年代末我國(guó)就開(kāi)始了百合切花生產(chǎn)，但由于百合種球繁育技術(shù) 以及病毒檢測(cè)等技術(shù)的落后，導(dǎo)致自繁種球質(zhì)量差、增重慢、感病嚴(yán)重，生產(chǎn)中使用的種球 90%以上依賴進(jìn)口，耗資巨大。更重要的是進(jìn)口種球價(jià)格高，病毒病卻沒(méi)有保障，導(dǎo)致我國(guó) 百合切花生產(chǎn)成本居高不下而切花質(zhì)量卻參差不齊，嚴(yán)重影響了百合產(chǎn)業(yè)的健康、高效發(fā) 展。食用百合種植一茬需要3?5年的時(shí)間，主產(chǎn)區(qū)受土地面積的限制，重茬嚴(yán)重。連茬引 發(fā)的病害尤其病毒病嚴(yán)重影響了食用百合的生長(zhǎng)，使百合產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降，經(jīng)濟(jì)效益減 少。
[0003] 目前文獻(xiàn)報(bào)道侵染百合的病毒有20多種，其中百合斑駁病毒（Lily mottle virus,LMoV)和百合隱癥病毒（Lily symptomless virus,LSV)是發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重 的兩種病毒，其他病毒均為局部地區(qū)發(fā)生。LMoV可在世界范圍內(nèi)廣泛分布，特別是在適合其 寄主生長(zhǎng)的所有溫帶地區(qū)及蚜蟲(chóng)媒介豐富的地區(qū)尤為普遍。LMoV侵染百合科植物常造成葉 片有斑駁條紋甚至壞死斑，后期發(fā)展為花、葉片卷曲畸形，開(kāi)碎色花，并常伴隨植株矮小、花 與球莖的減產(chǎn)等。百合斑駁病毒屬于馬鈴薯Y病毒科、馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus)。病 毒粒子為彎曲線狀且呈螺旋對(duì)稱，大小（650?900)nmX (11?15)nm。病毒基因組為單分 子正鏈RNA，約9. 4kb，具有potyvirus屬成員的典型基因組結(jié)構(gòu)特征，包括一個(gè)Poly (A)尾 巴，編碼一個(gè)由3095個(gè)氨基酸組成的分子量為351. OkDa的多聚蛋白。多聚蛋白通過(guò)自我 剪切后形成外殼蛋白（CP)等10個(gè)不同大小的功能蛋白。LMoV CP亞基由274aa組成，大小 為30kDa左右，組裝成外殼包裹病毒RNA。
[0004] 目前與百合病毒相關(guān)的研究主要集中在病毒脫除和病毒檢測(cè)上，病毒檢測(cè)研究雖 然有電子顯微鏡技術(shù)、酶聯(lián)免疫法（ELISA)以及分子生物學(xué)技術(shù)（RT-PCR和基因芯片技術(shù)） 等的相關(guān)報(bào)道，但都還停留在研究和實(shí)驗(yàn)室階段，無(wú)法滿足百合種植現(xiàn)場(chǎng)及田間快速檢測(cè) 的需求，從而無(wú)法掌握百合病毒感染的準(zhǔn)確信息。此外，包括ELISA和RT-PCR等方法在內(nèi) 的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法都存在程序復(fù)雜，檢測(cè)費(fèi)用高、對(duì)儀器設(shè)備和檢測(cè)條件要求高，需要 長(zhǎng)期經(jīng)驗(yàn)積累和具有專業(yè)操作技能的人員才能完成等實(shí)際問(wèn)題，因此使用范圍受到很大的 局限性。
[0005] 膠體金免疫層析是以硝酸纖維素膜為載體，通過(guò)液體的滲移，利用抗原抗體的結(jié) 合，以及膠體金呈現(xiàn)顏色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)抗原或抗體。該方法可以避免以上幾種檢測(cè)方法的缺 點(diǎn)，以其特異性強(qiáng)、成本低、操作簡(jiǎn)便、不需任何儀器、適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛接 受，已用于多種植物病毒的檢測(cè)等，包括馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、煙草斑駁病毒、南瓜 花葉病毒等。作為一種快速篩查的手段，既可節(jié)省檢測(cè)成本，又可用于廣大基層單位開(kāi)展百 合病毒的檢測(cè)和防控工作中，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。但是至今國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有用 膠體金免疫層析法檢測(cè)LMoV的相關(guān)報(bào)道，更無(wú)商品化的LMoV膠體金免疫層析檢測(cè)試劑卡， 很難滿足國(guó)內(nèi)觀賞及食用百合的病毒檢測(cè)需求。因此建立科學(xué)、快速、靈敏、穩(wěn)定、易操作的 LMoV檢測(cè)方法及試劑卡，是生產(chǎn)百合脫毒株的基礎(chǔ)，是提高百合產(chǎn)量和品質(zhì)的前提。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種用膠體金免疫層析法快速檢測(cè)LMoV的試劑卡及其制備 方法。本發(fā)明試劑卡檢測(cè)快速，檢測(cè)準(zhǔn)確率高，特異性強(qiáng)，攜帶方便，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)重復(fù)性 好，無(wú)需任何儀器和設(shè)備。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0008] -種百合斑駁病毒膠體金免疫層析檢測(cè)試劑卡，包括：試劑卡槽（1)，襯板（10)， 樣品墊（6)，膠體金結(jié)合墊（7)，硝酸纖維素膜（8)，吸水濾紙（9)，試劑卡槽（1)包括上殼體 和下殼體，上殼體和下殼體通過(guò)卡扣連接，上殼體設(shè)有第一孔洞（2)和第二孔洞（3)，樣品 墊（6)置于第一孔洞（2)下方，硝酸纖維素膜（8)置于第二孔洞（3)下方，膠體金結(jié)合墊 ⑵上含有金標(biāo)探針，襯板（10)固定于試劑卡槽⑴中，樣品墊（6)、膠體金結(jié)合墊（7)、硝 酸纖維素膜（8)和吸水濾紙（9)依次排列連接于襯板（10)上表面，硝酸纖維素膜（8)上設(shè) 有檢測(cè)線（4)和對(duì)照線（5)，檢測(cè)線（4)上包被的是兔抗LMoV多克隆抗體，對(duì)照線（5)上包 被的是羊抗兔IgG純化抗體，兔抗LMoV多克隆抗體合適包被量為1. 5?2. 0 μ g蛋白，金標(biāo) 探針合適抗體標(biāo)記量為18 μ g/mL,羊抗兔IgG純化抗體合適包被量為2. 0?2. 5yg蛋白。
[0009] 其中在用所述試劑卡檢測(cè)時(shí)，在所述第一孔洞處加入少量百合樣品的待檢溶液， 對(duì)比檢測(cè)線和對(duì)照線的顏色，即可判定被檢測(cè)百合是否感染了百合斑駁病毒；
[0010] 其中將少量待檢溶液加入所述第一孔洞處5?10分鐘后，若待檢溶液中含有 LMoV，檢測(cè)樣品經(jīng)過(guò)所述膠體金結(jié)合墊時(shí)，LMoV與金標(biāo)墊上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物， 然后繼續(xù)向所述檢測(cè)線方向滲移，當(dāng)接觸到所述檢測(cè)線時(shí)發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留 下來(lái)，形成可見(jiàn)的棕紅色條帶；未與檢測(cè)線結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述對(duì)照線方向滲移，當(dāng)接 觸到所述對(duì)照線時(shí)與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來(lái)，形成可見(jiàn)的棕紅色條帶；當(dāng) 檢測(cè)線和對(duì)照線上均出現(xiàn)棕紅色的條帶時(shí)，則判定被檢樣品感染了百合斑駁病毒；
[0011] 其中將少量待檢溶液加入所述第一孔洞處5?10分鐘后，若待檢溶液中不含 LMoV,檢測(cè)樣品經(jīng)過(guò)所述膠體金結(jié)合墊時(shí)，則不能與金標(biāo)墊上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接 觸到所述檢測(cè)線時(shí)不發(fā)生反應(yīng)，金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述對(duì)照線方向滲移，當(dāng)接觸到所 述對(duì)照線時(shí)與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來(lái)，形成可見(jiàn)的棕紅色條帶；當(dāng)檢測(cè)線 沒(méi)有顏色變化而僅對(duì)照線出現(xiàn)棕紅色的條帶時(shí)，則判定被檢樣品沒(méi)有感染百合斑駁病毒。
[0012] 一種百合斑駁病毒膠體金免疫層析檢測(cè)試劑卡的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：1、 兔抗LMoV多克隆抗體的制備：從感染了 LMoV的百合葉片中提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)，擴(kuò)增LMoV的CP基因片段。通過(guò)酶切克隆至pET-28a載體。重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21，37°C培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，鎳柱親和層析純化獲得大小30. OkDa的 LMoV CP基因工程融合蛋白。用lmg/mL的LMoV CP基因工程融合蛋白作為免疫原免疫新西 蘭大白兔，獲得抗血清。所得抗血清依次通過(guò)20%、50%、33%三個(gè)飽和度的硫酸銨沉淀粗 提后，透析至PH7. 8的磷酸緩沖液，然后使用DE52陰離子交換柱進(jìn)行純化而獲得兔抗LMoV 多克隆抗體IgG ;2、膠體金標(biāo)記兔抗LMoV多克隆抗體的方法：分別取半徑為30nm的膠體金 10mL及兔抗LMoV多克隆抗體180 μ g，在PH7. 4的條件下通過(guò)磁力攪拌震蕩使其結(jié)合，加牛 血清白蛋白（BSA)作為穩(wěn)定劑，且使得終濃度為1%，采用高速離心法除去未結(jié)合的多克隆 抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝聚物，在離心管底部的深紅色沉淀即為膠體金-抗體結(jié) 合物；3、膠體金結(jié)合墊的制備：用1/10標(biāo)記前膠體金溶液體積的重懸液懸浮膠體金-抗體 結(jié)合物，離心，上清液用噴涂設(shè)備涂于玻璃纖維素膜上，37°C烘干，制成膠體金結(jié)合墊；4、免 疫層析膜的包被：檢測(cè)線上包被的是兔抗LMoV多克隆抗體，對(duì)照線上包被的是羊抗兔IgG 純化抗體；5、試劑卡的組裝：將聚氯乙烯襯板作為支撐載體固定于試劑卡槽下殼體中，然 后樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次排列連接于襯板上表面，再將試劑 卡槽上殼體與下殼體通過(guò)卡扣連接，就得到LMoV膠體金免疫層析檢測(cè)試劑卡。
[0013] 本發(fā)明的試劑卡具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0014] 檢測(cè)時(shí)，吸取少量百合樣品的待檢測(cè)溶液，滴在試劑卡槽上殼體第一孔洞處，對(duì)比 檢測(cè)線和對(duì)照線的顏色，即可判定百合植株是否感染了 LMoV。
[0015] 1、檢測(cè)快速：檢測(cè)時(shí)間只需5?10分鐘，可以滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要。
[0016] 2、檢測(cè)準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)：本反應(yīng)與其他百合主要病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)，檢測(cè)靈敏 度高。
[0017] 3、攜帶方便，操作簡(jiǎn)便：本發(fā)明不需要借助其他儀器設(shè)備，適合廣大基層單位開(kāi)展 百合病毒的檢測(cè)和防控工作，也適合百合生產(chǎn)的企業(yè)、公司以及百合種植的農(nóng)戶使用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為本發(fā)明百合斑駁病毒膠體金免疫層析檢測(cè)試劑卡平面結(jié)構(gòu)示意圖
[0019] 圖2為本發(fā)明百合斑駁病毒膠體金免疫層析檢測(cè)試劑卡內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖

【具體實(shí)施方式】
[0020] 如圖1和圖2所示的LMoV膠體金免疫層析檢測(cè)試劑卡，包括試劑卡槽1，襯板10， 樣品墊6,膠體金結(jié)合墊7,硝酸纖維素膜8,吸水濾紙9,其中試劑卡槽1包括上殼體和下殼 體，上殼體和下殼體通過(guò)卡扣連接，上殼體設(shè)有第一孔洞2和第二孔洞3,樣品墊6置于第 一孔洞2下方，硝酸纖維素膜8置于第二孔洞3下方，膠體金結(jié)合墊7上含有金標(biāo)探針，襯 板10固定于試劑卡槽1中，樣品墊6、膠體金結(jié)合墊7、硝酸纖維素膜8和吸水濾紙9依次 排列連接于襯板10上表面，硝酸纖維素膜8上設(shè)有檢測(cè)線4和對(duì)照線5,檢測(cè)線4上包被的 是兔抗LMoV多克隆抗體，對(duì)照線5上包被的是羊抗兔IgG純化抗體，兔抗LMoV多克隆抗體 合適包被量為1.5?2. Oyg蛋白，金標(biāo)探針合適抗體標(biāo)記量為18 μ g/mL,羊抗兔IgG純化 抗體合適包被量為2. 0?2. 5 μ g蛋白。
[0021] 其中，樣品墊和膠體金結(jié)合墊材質(zhì)均為玻璃纖維素膜，襯板為聚氯乙烯材質(zhì)做成， 起支持作用。
[0022] 本發(fā)明試劑卡的制備方法：
[0023] 1、本發(fā)明中兔抗LMoV多克隆抗體的制備方法
[0024] 從感染了 LMoV的百合葉片中提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)，擴(kuò) 增LMoV的CP基因片段。通過(guò)酶切克隆至pET-28a載體。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21， 37°C培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，鎳柱親和層析純化獲得大小30. OkDa的LMoV CP基因工程融合蛋 白。用lmg/mL的LMoV CP基因工程融合蛋白作為免疫原免疫新西蘭大白兔。初次免疫中， 將蛋白抗原與弗氏完全佐劑等體積充分混勻，進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射。兩周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，將 蛋白抗原與弗氏不完全佐劑等體積充分混勻，進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射。以后每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一 次，在第4次加強(qiáng)免疫后的5?7天頸動(dòng)脈采血，靜至，離心，收集到的血清加入質(zhì)量百分比 濃度0.02%的疊氮鈉，-20°C保存。所得抗血清依次通過(guò)20%、50%、33%三個(gè)飽和度的硫 酸銨沉淀粗提后，透析至PH7. 8的磷酸緩沖液，然后使用DE52陰離子交換柱進(jìn)行純化而獲 得兔抗LMoV多克隆抗體IgG。
[0025] 2、膠體金標(biāo)記兔抗LMoV多克隆抗體的方法
[0026] 分別取半徑為30nm的膠體金10mL及兔抗LMoV多克隆抗體180 μ g，在PH7. 4的條 件下通過(guò)磁力攪拌震蕩使其結(jié)合，加牛血清白蛋白（BSA)作為穩(wěn)定劑，使得終濃度為1%， 采用高速離心法除去未結(jié)合的多克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及去凝聚物，在離心管底 部的深紅色沉淀即為膠體金-抗體結(jié)合物。
[0027] 3、膠體金結(jié)合墊的制備
[0028] 用1/10標(biāo)記前膠體金溶液體積的重懸液懸浮膠體金-抗體結(jié)合物，離心，上清液 用噴涂設(shè)備涂于玻璃纖維素膜上，37 °C烘干，制成膠體金結(jié)合墊。
[0029] 4、免疫層析膜的包被
[0030] 檢測(cè)線包被的是兔抗LMoV多克隆抗體，對(duì)照線包被的是羊抗兔IgG純化抗體，每 條線寬2mm，兔抗LMoV多克隆抗體合適包被量為1. 5?2. 0 μ g蛋白，羊抗兔IgG純化抗體 合適包被量為2. 0?2. 5 μ g蛋白。
[0031] 5、膠體金試劑卡的組裝
[0032] 聚氯乙烯襯板作為支撐載體固定于試劑卡槽下殼體中，然后樣品墊、膠體金結(jié)合 墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次排列連接于聚氯乙烯襯板上表面，再將試劑卡槽上殼體 與下殼體通過(guò)卡扣連接。
[0033] 6、膠體金試劑卡的使用及結(jié)果判定
[0034] 吸取少量百合樣品的待檢測(cè)溶液，滴在試劑卡槽上殼體第一孔洞2處，由于毛細(xì) 效應(yīng)液體往前移動(dòng)，若待測(cè)液中含有LMoV，檢測(cè)樣品經(jīng)過(guò)膠體金結(jié)合墊時(shí)，LMoV與金標(biāo)墊 上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述檢測(cè)線方向?qū)游鲇緞?dòng)，當(dāng)接觸到檢測(cè)線 時(shí)發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來(lái)，形成可見(jiàn)的棕紅色條帶；未結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向 對(duì)照線方向滲移，當(dāng)接觸到對(duì)照線時(shí)與固定在對(duì)照線上的羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截 留下來(lái)，形成可見(jiàn)的棕紅色條帶。即當(dāng)檢測(cè)線和對(duì)照線上均出現(xiàn)棕紅色的條帶時(shí)，則判定被 檢樣品感染了百合斑駁病毒。
[0035] 若待測(cè)液中不含LMoV，檢測(cè)樣品經(jīng)過(guò)膠體金結(jié)合墊時(shí)，則不能與金標(biāo)墊上的金標(biāo) 多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述檢測(cè)線時(shí)不發(fā)生反應(yīng)，金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向?qū)φ站€方向 滲移，當(dāng)接觸到對(duì)照線時(shí)與固定在對(duì)照線上的羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來(lái)，形 成可見(jiàn)的棕紅色條帶。即當(dāng)檢測(cè)線沒(méi)有顏色變化而僅對(duì)照線出現(xiàn)棕紅色的條帶時(shí)，則判定 被檢樣品沒(méi)有感染百合斑駁病毒。
[0036] 上述實(shí)施例可以看出，本發(fā)明可直接對(duì)LMoV進(jìn)行檢測(cè)，一般人員不需專門(mén)培訓(xùn)即 可操作，5?10分鐘就可出結(jié)果，從而達(dá)到快速、簡(jiǎn)便、及時(shí)檢測(cè)該病毒的目的。
【權(quán)利要求】
1. 一種百合斑駁病毒膠體金免疫層析檢測(cè)試劑卡，包括：試劑卡槽（1)，襯板（10)，樣 品墊（6)，膠體金結(jié)合墊（7)，硝酸纖維素膜（8)，吸水濾紙（9)，其特征在于：試劑卡槽（1) 包括上殼體和下殼體，上殼體和下殼體通過(guò)卡扣連接，上殼體設(shè)有第一孔洞（2)和第二孔 洞（3)，樣品墊（6)置于第一孔洞（2)下方，硝酸纖維素膜（8)置于第二孔洞（3)下方，膠 體金結(jié)合墊（7)上含有金標(biāo)探針，襯板（10)固定于試劑卡槽（1)中，樣品墊（6)、膠體金結(jié) 合墊（7)、硝酸纖維素膜⑶和吸水濾紙（9)依次排列連接于襯板（10)上表面，硝酸纖維 素膜（8)上設(shè)有檢測(cè)線（4)和對(duì)照線（5)，檢測(cè)線（4)上包被的是兔抗LMoV多克隆抗體， 對(duì)照線（5)上包被的是羊抗兔IgG純化抗體，兔抗LMoV多克隆抗體合適包被量為1. 5? 2. 0 μ g蛋白，金標(biāo)探針合適抗體標(biāo)記量為18 μ g/mL,羊抗兔IgG純化抗體合適包被量為 2.0?2.5yg蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的百合斑駁病毒膠體金免疫層析檢測(cè)試劑卡，其中在用所述百 合斑駁病毒膠體金免疫層析檢測(cè)試劑卡檢測(cè)時(shí)，在所述第一孔洞處加入少量百合樣品的待 檢溶液，對(duì)比檢測(cè)線和對(duì)照線的顏色，即可判定被檢測(cè)百合是否感染了百合斑駁病毒。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的百合斑駁病毒膠體金免疫層析檢測(cè)試劑卡，其中將少量待檢 溶液加入所述第一孔洞處5?10分鐘后，若待檢溶液中含有LMoV，檢測(cè)樣品經(jīng)過(guò)所述膠體 金結(jié)合墊時(shí)，LMoV與金標(biāo)墊上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述檢測(cè)線方向 滲移，當(dāng)接觸到所述檢測(cè)線時(shí)與兔抗LMoV多克隆抗體發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下 來(lái)，形成可見(jiàn)的棕紅色條帶；未與檢測(cè)線結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述對(duì)照線方向滲移，當(dāng)接觸 到所述對(duì)照線時(shí)與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來(lái)，形成可見(jiàn)的棕紅色條帶；當(dāng)檢 測(cè)線和對(duì)照線上均出現(xiàn)棕紅色的條帶時(shí)，則判定被檢樣品感染了百合斑駁病毒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的百合斑駁病毒膠體金免疫層析檢測(cè)試劑卡，其中將少量待檢 溶液加入所述第一孔洞處5?10分鐘后，若待檢溶液中不含LMoV，檢測(cè)樣品經(jīng)過(guò)所述膠體 金結(jié)合墊時(shí)，則不能與金標(biāo)墊上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述檢測(cè)線時(shí)不發(fā)生反 應(yīng)，金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述對(duì)照線方向滲移，當(dāng)接觸到所述對(duì)照線時(shí)與羊抗兔IgG純 化抗體結(jié)合而被截留下來(lái)，形成可見(jiàn)的棕紅色條帶；當(dāng)檢測(cè)線沒(méi)有顏色變化而僅對(duì)照線出 現(xiàn)棕紅色的條帶時(shí)，則判定被檢樣品沒(méi)有感染百合斑駁病毒。
5. -種如權(quán)利要求1-4所述百合斑駁病毒膠體金免疫層析檢測(cè)試劑卡的制備方法， 其特征在于按以下步驟進(jìn)行：（1)兔抗LMoV多克隆抗體的制備；（2)膠體金標(biāo)記兔抗LMoV 多克隆抗體的制備：分別取半徑為30nm的膠體金10mL及兔抗LMoV多克隆抗體180 μ g， 在PH7.4的條件下通過(guò)磁力攪拌震蕩使其結(jié)合，加牛血清白蛋白（BSA)作為穩(wěn)定劑，且使 得終濃度為1 %，采用高速離心法除去未結(jié)合的多克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝 聚物，在離心管底部的深紅色沉淀即為膠體金-抗體結(jié)合物；(3)膠體金結(jié)合墊的制備：用 1/10標(biāo)記前膠體金溶液體積的重懸液懸浮膠體金-抗體結(jié)合物，離心，上清液用噴涂設(shè)備 涂于玻璃纖維素膜上，37°C烘干，制成膠體金結(jié)合墊；(4)免疫層析膜的包被：在硝酸纖維 素膜上分別包被兔抗LMoV多克隆抗體檢測(cè)線和羊抗兔IgG純化抗體對(duì)照線，每條線寬2mm， 兔抗LMoV多克隆抗體合適包被量為1. 5?2. 0 μ g蛋白，羊抗兔IgG純化抗體合適包被量 為2. 0?2. 5 μ g蛋白；（5)試劑卡的組裝：將聚氯乙烯襯板作為支撐載體固定于試劑卡槽 下殼體中，然后樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次排列連接于襯板上表 面，再將試劑卡槽上殼體與下殼體通過(guò)卡扣連接，就得到LMoV膠體金免疫層析檢測(cè)試劑
【文檔編號(hào)】G01N33/531GK104122389SQ201410151332
【公開(kāi)日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年4月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月14日
【發(fā)明者】張玉寶, 王亞軍, 郭志鴻, 謝忠奎, 王若愚, 何玉惠 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所