一種單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組抗人表皮生長因子受體單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法。將人肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞H292細(xì)胞與不同濃度的抗EGFR單抗孵育，加入細(xì)胞計(jì)數(shù)染色試劑CCK-8，用酶標(biāo)讀數(shù)儀測定活細(xì)胞染色的吸光值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用計(jì)算機(jī)程序處理，計(jì)算抗EGFR樣品相對于抗EGFR標(biāo)準(zhǔn)品的生物學(xué)活性。本發(fā)明所采用的檢測細(xì)胞H292細(xì)胞株對于不同親和力的抗體均適用，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間短，需要的細(xì)胞數(shù)量較少；而且本發(fā)明改進(jìn)了MTT比色法的染色液，改用CCK-8染色液，產(chǎn)物的溶解度較好，不需要進(jìn)一步的溶解處理，加入染色液后可以在不同的時(shí)間檢測結(jié)果，顯色結(jié)果穩(wěn)定，質(zhì)量更可控。該方法測定的生物學(xué)活性與臨床療效相關(guān)，符合FDA相關(guān)的技術(shù)要求。
【專利說明】一種單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗體的生物學(xué)活性測定【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地說涉及重組抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]表皮生長因子受體(Epithelialgrowth factor receptor,EGFR)是一種糖蛋白，屬于酪氨酸激酶型受體，廣泛分布于哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面，其信號通路在細(xì)胞的生長、增殖和分化等生理過程中發(fā)揮重要的作用(HanleySC, Assouline-Thomas B, Makhlin J, et al.J Endocrinol,2011,211 (3):231_239)。研究表明，EGFR與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)，在許多實(shí)體腫瘤中存在EGFR的高表達(dá)或異常表達(dá)，因此可將EGFR作為腫瘤治療的靶點(diǎn)(Kim H，Kim SH, Kim MJ, et al.J Immunother, 2011, 34 (4):372-381 ；0h M, Lee JY, Shin DH, etal.Cancer Sci，2011，102 (3):597_604)。
[0003]單克隆抗體的生物學(xué)活性測定是重組生物制品質(zhì)量控制的重要評價(jià)參數(shù)，關(guān)系到單克隆抗體的治療效果。一般將體外細(xì)胞增殖抑制方法測得的生物學(xué)活性稱為單抗的效價(jià)。
[0004]早在1963年，Slater就發(fā)現(xiàn)了線粒體中的脫氫酶(如琥珀酸脫氫酶、心肌黃酶)可將四甲基偶氮唑鹽(MTT)的唑環(huán)打開，生成藍(lán)色的產(chǎn)物甲濯(formazan)。根據(jù)這個(gè)原理，Mosmann (Mosmann T.J Tmmunol Methods, 1983, 65:55)于 1983 年創(chuàng)立了 MTT 檢測法，此法在測定細(xì)胞的存活和增殖方面非常有效，因?yàn)檫@種顏色的變化僅僅發(fā)生在活的細(xì)胞中，并且甲I!的形成量與活細(xì)胞數(shù)和功能狀態(tài)是成比例的。目前，MTT測定法已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于多種生長因子如表皮生長因子、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-2等的檢測工作中。
[0005]目前通用的重組抗人EGFR抗體生物學(xué)活性的測定方法，是采用DiFi細(xì)胞或者M(jìn)DA-MB-468細(xì)胞的增殖/WST比色法，均采用改進(jìn)的MTT染色的方法。該法依據(jù)抗EFGR抗體對這些細(xì)胞的生長具有抑制作用，DiFi細(xì)胞或者M(jìn)DA-MB-468細(xì)胞株的生長狀況因重組抗EGFR抗體的生物學(xué)活性的不同而異，以此檢測抗EGFR抗體的生物學(xué)活性。其測定法分別為:
[0006](I)DiFi細(xì)胞增殖比色法:DiFi細(xì)胞株用完全培養(yǎng)液于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)，1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，胎盤藍(lán)染色，鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至2 X IO5個(gè)/ml，100 μ I/孔，振蕩器混勻5分鐘后，將96孔板置37°C、5%C02孵箱孵育90-102小時(shí)，孵育結(jié)束前將CellTiter96Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay MTS 試劑盒中的 PMS和MTS融化并平衡至室溫后，取IOOul PMS加入2mlMTS中，混勻，加入細(xì)胞培養(yǎng)板，20ul/孔，37°C、5%C02孵育2小時(shí)。孵育結(jié)束后，加入10%SDS15ul/孔終止顯色，490nm波長測定吸光度，結(jié)果使用SoftmaX5.0軟件分析(張峰等，DiFi細(xì)胞增殖抑制法測定抗表皮生長因子受體單克隆抗體的生物學(xué)活性，第五次全國免疫診斷暨疫苗學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C]，2011年)。[0007](2 ) MDA-MB-468細(xì)胞增殖/WST比色法:MDA_MB_468細(xì)胞用稀釋液(含0.1g/LPF-68的F12/DMEM培養(yǎng)基)將細(xì)胞濃度調(diào)整至(5~8) X IO4個(gè)/ mL,加入96孔板，每孔100 μ L，空白對照加入100 μ L稀釋液。用樣品稀釋液(含0.2%FBS的F12 / DMEM培養(yǎng)基)將樣品和參考品預(yù)稀釋至50 μ g/mL,再3倍梯度稀釋至0.023 μ g / mL,加入96孔板，每孔50 μ L，補(bǔ)加40μ LF12/DMEM培養(yǎng)基(含5%FBS)，37°C培養(yǎng)5天，加入30 μ L WST-8顯色液，繼續(xù)孵育4h，以630nm為參比波長，于波長450nm處測定吸光度(A)值。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行四參數(shù)擬合，得到反“S”型曲線，以半數(shù)有效濃度(EC5tl)表示生物學(xué)活性。將50yg / mL的樣品與參考品等體積混勻，按相同方式稀釋并加樣，測定回收率，按下式計(jì)算相對生物學(xué)活性和回收率(陶磊等，人源化抗表皮生長因子受體單克隆抗體質(zhì)控方法的建立，中國生物制品學(xué)雜志，2013年01月第26卷第I期)。
[0008]樣品相對生物學(xué)活性(％)=參考品EC5tl /樣品EC5tlX 100%
[0009]回收率樣品相對生物學(xué)活性(%)=參考品EC5tl /回收率樣品EC5tl X 100%
[0010]
【權(quán)利要求】
1.一種重組抗人表皮生長因子受體單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法，其特征在于，該方法包含如下步驟: (1)制備特定腫瘤細(xì)胞懸液；所述特定腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜過度表達(dá)表皮生長因子受體； (2)制備不同濃度的重組抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體溶液； (3)特定腫瘤細(xì)胞與不同濃度的重組抗人表皮生長因子受體的單抗孵育68-72小時(shí)，加入細(xì)胞計(jì)數(shù)染色試劑CCK-8震蕩混勻，37°C溫育2-4小時(shí)； (4)在酶標(biāo)儀上以630nm為參比波長，于波長450nm處測定吸光度，通過數(shù)據(jù)處理計(jì)算抗EGFR樣品相對于抗EGFR標(biāo)準(zhǔn)品的生物學(xué)活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組抗人表皮生長因子受體單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法，其特征在于，所述步驟(I)中特定腫瘤細(xì)胞為人肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞H292，所述特定腫瘤細(xì)胞懸液的密度為6 X IO4-1O X IO4個(gè)/mL，優(yōu)選密度為8 X IO4個(gè)/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組抗人表皮生長因子受體單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法，其特征在于，所述步驟(2)中的重組抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體為尼妥珠單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗或Zalutumumab的任意一種,所述的重組抗人表皮生長因子受體的單抗溶液樣品或標(biāo)準(zhǔn)品濃度稀釋至300-1000 μ g/mL，優(yōu)選濃度為300 μ g/mL，然后向下5倍或4倍倍比稀釋7個(gè)稀釋度。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組抗人表皮生長因子受體單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法，其特征在于，所述重組抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體為尼妥珠單抗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組抗人表皮生長因子受體單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法，其特征在于，所述步驟(4)的數(shù)據(jù)處理為使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)回歸分析，根據(jù)不同對數(shù)濃度下的抑制率計(jì)算參考品和樣品的S形曲線間的F值，計(jì)算參考品和樣品的半效量濃度IC5tte和IC5Qs。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組抗人表皮生長因子受體單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法，其特征在于，所述步驟(4)的數(shù)據(jù)處理為利用GraphPad Prism軟件的四參數(shù)回歸進(jìn)行處理，當(dāng)參考品和樣品的擬合曲線平行性假設(shè)得到確認(rèn)(P值>0.05)后，且曲線擬合系數(shù)R2>0.9025(即R>0.95)，使用constrained的曲線最大值、最小值、斜率，計(jì)算參考品和樣品的半效量濃度IC5tlr和IC50s。
7.權(quán)利要求1-5所述的重組抗人表皮生長因子受體單克隆抗體生物學(xué)活性測定方法在重組抗人表皮生長因子受體單克隆抗體的質(zhì)控中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N21/31GK103792200SQ201410064974
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月25日
【發(fā)明者】何偉, 劉永清, 喻志愛, 白先宏 申請人:百泰生物藥業(yè)有限公司