Tdp-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的認(rèn)定方法
【專利摘要】本發(fā)明開(kāi)發(fā)并提供一種TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的認(rèn)定方法以及TDP-43結(jié)合抑制劑制造方法。本發(fā)明通過(guò)對(duì)從檢測(cè)對(duì)象采集的細(xì)胞中的測(cè)定物質(zhì)的存在量、或者測(cè)定物質(zhì)與TDP-43的結(jié)合量等進(jìn)行測(cè)定，認(rèn)定該檢測(cè)對(duì)象是否罹患TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患。另外，通過(guò)添加藥劑候補(bǔ)物質(zhì)，制造能夠顯著降低測(cè)定物質(zhì)與TDP-43的結(jié)合的藥劑。
【專利說(shuō)明】TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的認(rèn)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的認(rèn)定方法、以及降低細(xì)胞內(nèi)特定的 mt-tRNA的存在量的藥劑的制造方法或者抑制TDP-43與核酸或多肽結(jié)合的結(jié)合抑制劑的 制造方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 肌萎縮性側(cè)索硬化癥（AmyotrophicLateralSclerosis:以下有時(shí)簡(jiǎn)稱為"ALS"） 是由于腦干、脊髄、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的病變導(dǎo)致的上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元障礙、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元障礙進(jìn)展， 與之伴隨而出現(xiàn)因肌萎縮和肌肉力量下降而導(dǎo)致的上肢功能障礙、歩行障礙、、吞咽障礙、 呼吸障礙等癥狀的難以治療的疾患。雖然已有使用人工呼吸器而生存較長(zhǎng)時(shí)間的例子，但 病勢(shì)的進(jìn)展通常比較迅速，多在平均發(fā)病后3. 5年因呼吸肌的麻痹而死亡。
[0003] ALS中5?10 %伴有家族史，被稱為家族性肌萎縮性側(cè)索硬化癥（家族性ALS)。 已有報(bào)告，家族性ALS的大約2成的去除自由基的酶Cu/Zn超氧化物歧化酶（S0D1 : superoxidedismutase1)的基因發(fā)生突變（ALS1)(非專利文獻(xiàn)1)，而S0D1基因被認(rèn) 為是ALS的致病基因之一。另外，作為其他的ALS的致病基因，已報(bào)告有血管生成素 (angiogenin)(非專利文獻(xiàn) 2)、小泡膜結(jié)合蛋白（VAMP:vesicle_associatedmembrane protein) / 小突角蟲(chóng)泡結(jié)合蛋白B(VAPB:synaptobrevin_associatedmembraneproteinB) (非專利文獻(xiàn) 3)、TARDNA結(jié)合蛋白 43(TDP-43:TARDNA-bindingprotein)(非專利文獻(xiàn) 4)以及fusedinsarcoma/translatedinliposarcoma(FUS/TLS)(非專利文獻(xiàn) 5)等的基 因。然而，為何這些基因的異常使ALS發(fā)病、病情如何進(jìn)展，其具體的機(jī)理仍不明確。
[0004] Maruyama等（非專利文獻(xiàn)6)公開(kāi)了在6例家族性ALS患者的3例中，涉及抑制 參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的NFkB的視神經(jīng)蛋白（optineurin)的基因具有突變。突變型視神 經(jīng)蛋白喪失了NFkB的抑制活性，因此暗示了NFkB抑制劑具有ALS的治療效果的可能性。 然而，ALS的90?95%是單發(fā)性的，而多數(shù)ALS患者中，相比視神經(jīng)蛋白基因，更多是在 TDP-43基因發(fā)現(xiàn)有突變。因此，即使NFkB抑制劑具有ALS治療效果，也僅能在一小部分的 ALS患者身上期待治療效果。
[0005] Rothstein等（非專利文獻(xiàn)7)確認(rèn)了在具有突變型S0D1基因的ALS患者的脊髓 液中，與具有野生型S0D1基因的健康個(gè)體相比，谷氨酸（以下有時(shí)簡(jiǎn)稱為"Glu"）的濃度 增加近3倍，以及在集體研宄中單發(fā)性ALS患者的大約40%的脊髓液中Glu的增加，因此 暗示伴隨Glu的增加，Glu毒性在ALS的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮重要的作用。ALS患者中的這樣的 Glu的增加被認(rèn)為是由于星形細(xì)胞喪失吸收Glu的能力所致，因此，單發(fā)性ALS是由于Glu 毒性，特別是通過(guò)谷氨酸受體的亞型a-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（AMPA)受 體的Glu增加所致的Glu毒性，引發(fā)神經(jīng)障礙的結(jié)果導(dǎo)致發(fā)病的假說(shuō)最為有利。還有關(guān)于 人ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的AMPA受體的亞單元的GluR2Q/R部位的RNA編輯率低，在單發(fā)性ALS 的病情中發(fā)揮重要作用的報(bào)告，（非專利文獻(xiàn)8?12)，支持該假說(shuō)。
[0006] Lacomblez等（非專利文獻(xiàn)13)公開(kāi)了利魯挫（Riluzole)對(duì)于ALS患者的生存時(shí) 間雖然延長(zhǎng)少但能夠明顯地延長(zhǎng)這一臨床試驗(yàn)結(jié)果。利魯唑是基于上述假說(shuō)開(kāi)發(fā)的谷氨酸 的拮抗劑。目前，僅有該利魯唑作為ALS的治療藥被歐美以及日本認(rèn)可（商品名：RILUTEK)。 然而，利魯唑不是抑制ALS的原因的Glu增加，只不過(guò)是減輕Glu增加導(dǎo)致的Glu毒效的對(duì) 癥療法，對(duì)于ALS的主癥狀的肌肉力量下降或別的臨床癥狀沒(méi)有有效性。
[0007] 專利文獻(xiàn)1中公開(kāi)了通過(guò)甲基鈷胺素（Methylcobalamin)的大量投藥，能夠?qū)LS 的臨床癥狀具有一定的改善效果，現(xiàn)在，正在進(jìn)行甲基鈷胺素的雙盲比較試驗(yàn)。然而，本藥 劑也主要是基于對(duì)谷氨酸導(dǎo)致的細(xì)胞死亡的抑制效果（非專利文獻(xiàn)14)，無(wú)法期待使利魯 唑的效果發(fā)生很大改善。同時(shí)，關(guān)于甲基鈷胺素對(duì)于ALS的效果，除了抑制Glu毒性的效 果以外，還會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地阻礙高濃度的甲基鈷胺素由S-腺苷甲硫氨酸的DNA的甲基化，維持 基因的高轉(zhuǎn)錄（非專利文獻(xiàn)15)，因此促進(jìn)神經(jīng)再生所必要的各種蛋白質(zhì)的合成，作為其結(jié) 果，有可以保護(hù)脊髄或大腦的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞的推測(cè)。然而，因?yàn)闆](méi)有與ALS的病情、發(fā)病機(jī) 理顯示關(guān)聯(lián)性的證據(jù)，所以單純停留在一般性的推論。
[0008] 另外，直到現(xiàn)在為止，ALS的診斷還沒(méi)有能夠確診的特異性的臨床檢查方法，現(xiàn)行 是通過(guò)病歷或神經(jīng)表現(xiàn)進(jìn)行綜合判定，而發(fā)病前的預(yù)計(jì)、發(fā)病早期的診斷或發(fā)病后的準(zhǔn)確 的診斷是困難的。
[0009] 如上所述，至今還沒(méi)有確立對(duì)于ALS的高精度的診斷方法、根治療法、以及發(fā)展抑 制或者發(fā)展延遲療法，所以其開(kāi)發(fā)受到急切期望。
[0010] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0011] 專利文獻(xiàn)
[0012] 專利文獻(xiàn)1 :日本特願(yuàn)平9-41604號(hào)公報(bào)
[0013] 非專利文獻(xiàn)
[0014]非專利文獻(xiàn) 1:RosenD.R.，etal. 1993,Nature, 362 (6415) :59-62.
[0015] 非專利文獻(xiàn) 2:GreenwayM.J.，etal. 2004,Neurology, 63 (10) : 1936-8.
[0016] 非專利文獻(xiàn) 3:RatnaparkhiA.，etal. 2008,PLoSOne, 3 (6) :e2334.
[0017] 非專利文獻(xiàn) 4:AraiT.，etal. 2006,Biochem.Biophys.Res.Commun. , 351 (3)： 602-11.
[0018]非專利文獻(xiàn) 5:KwiatkowskiT.J.Jr, 2009,Science, 323(5918) : 1205-8
[0019] 非專利文獻(xiàn) 6:MaruyamaH.，etal.，2010,Nature, 465 :223_226
[0020] 非專利文獻(xiàn) 7:RothsteinJ.D.，etal.，1990,Ann,Neurol.，28 :18-25.
[0021] 非專利文獻(xiàn) 8:TrottiD.，etal.，1999,Nat.Neurosci.，1999, 2 :427_433.
[0022] 非專利文獻(xiàn) 9:RothsteinJ.D.，1996,Neuron, 16 :675-686.
[0023]非專利文獻(xiàn) 10:BruijnL.I.，etal. 1997,Neuron, 18 :327-338.
[0024]非專利文獻(xiàn) 11:HowlandD.S.，etal.2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, ;99 : 1604-1609.
[0025]非專利文獻(xiàn) 12 :Rothstein,J.D.，2009,Ann.Neurol.，65 (suppl) :S3_S9.
[0026]非專利文獻(xiàn) 13:LacomblezL.，1996,Lancet, 347 :1425-1431.
[0027]非專利文獻(xiàn) 14:AkaikeA.，etal.，1993,Eur.J.Pharmacol.，241 :1-6.
[0028]非專利文獻(xiàn) 15 :Pfohl_LeszkowiczA,etal.，1991，Biochemistry, 30 : 8045-8051.


【發(fā)明內(nèi)容】

[0029] 發(fā)明所要解決的課題
[0030] 本發(fā)明的目的是開(kāi)發(fā)、提供一種對(duì)于ALS或額顳葉變性癥（frontotemporallobar degeneration:以下有時(shí)簡(jiǎn)稱為"FTLD"。包括含有皮克小體的皮克氏病。）等與TARDNA 結(jié)合蛋白質(zhì)_43(1八1?0嫩-13；[11(1;[1^?1'(^6；[11431^^:在本說(shuō)明書(shū)中，以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為 "TDP-43"）的細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的認(rèn)定方法，以及TDP-43結(jié)合抑制劑的制造方法。
[0031] 用于解決課題的方法
[0032] 為了解決上述課題，本發(fā)明的發(fā)明人等對(duì)于ALS患者之中突變頻率高 的TDP-43基因進(jìn)行研宄。發(fā)現(xiàn)TDP-43基因在家族性ALS以及單發(fā)性ALS中都有 突變，因此暗示ALS是主要的致病基因（]^^161-1'〇11代11116，（1，311(1(]16￥61311(1，0. W. , 2009,Cell, 136 ；1001tol004 ；Arai,etal. , 2006,Biochem.Biophys.Res. Commun. , 351:602-611 ；Neumann,etal.,2006,Science, 314, 130-133 ；Chen-Plotkin,et al. , 2010,Nat.Rev.Neurol. , 6:211-220 ；Lagier-Tourenne,etal.,2010,Hum.Mol. Genet. 19:R46-R64 ；Kabashi,etal.,2008,Nat.Genet. 40:572-574 ；Sreedharan,et al. , 2008,Science, 319:1668-1672；andPesiridis,G.S. ,etal. , 2009,Hum.Mol. Genet.，18:R156-R162)。另外，已知ALS患者的病灶部的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中蓄積有含有 TDP-43 的沉積物（AraiT，etal.，BiochemBiophysResCommun. ,2006, 351:602-611)。然 而，TDP-43的在細(xì)胞內(nèi)的功能或TDP-43基因的突變與ALS的發(fā)病有怎樣的關(guān)聯(lián)，其機(jī)理至 今是完全不清楚的。雖然對(duì)多個(gè)在TDP-43有突變的單發(fā)性ALS的病例，通過(guò)調(diào)查全組基因 探索TDP-43的作用基因的研宄仍在進(jìn)行，但至今尚未獲得能夠用于開(kāi)發(fā)新治療法以及其 篩選法的結(jié)果（SephtonC.F.，etal.，2011，J.Biol.Chem. 286:1204-1215.;Polymenidou M,etal. , 2011,Nat.Neurosci.,14(4) :459~68.；andTollerveyJ.R. ,etal.,2011,Nat. Neurosci. , 14(4):452-458)〇
[0033] 本發(fā)明的發(fā)明人等著眼于TDP-43的氨基酸序列中存在作為RNA結(jié)合序列的 RRM(RNARecognitionMotif)結(jié)構(gòu)域，經(jīng)過(guò)深入研宄，結(jié)果明確了TDP-43涉及4種的線 粒體tRNA(以下簡(jiǎn)稱 "mt-tRNA"），g卩，mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPr。 的生物合成或者代謝和谷氨酸/谷氨酰胺以及天冬氨酸/天冬酰胺的氨基酸代謝，是在該 mt-tRNA或氨基酸的生物合成或者代謝時(shí)作為的支架的支架蛋白質(zhì)，而且控制該mt-tRNA 或氨基酸在細(xì)胞內(nèi)的存在量。另外，還明確了TDP-43涉及能量代謝的控制，TDP-43在細(xì)胞 內(nèi)的存在量和ATP或者活性氧的細(xì)胞內(nèi)量具有相關(guān)關(guān)系。而且發(fā)現(xiàn)，因細(xì)胞內(nèi)的TDP-43的 表達(dá)水平的增加而引發(fā)的細(xì)胞死亡和TDP-43與一部分的mt-tRNA的結(jié)合量的增加相關(guān)，將 該結(jié)合降低至正常值后不再發(fā)生細(xì)胞死亡。本發(fā)明就是基于該認(rèn)識(shí)而完成的發(fā)明，具體而 言，提供以下的發(fā)明。
[0034] (1) -種與TDP-43的細(xì)胞內(nèi)存在量相關(guān)聯(lián)的疾患的認(rèn)定方法，其特征在于，包括：
[0035] 測(cè)定工序，測(cè)定來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞內(nèi)的以下（a)?（e)中的至少一項(xiàng)、以及
[0036] 認(rèn)定工序，將由所述測(cè)定工序獲得的測(cè)定值與來(lái)自健康個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)的對(duì)應(yīng)的測(cè) 定值相比較，在兩者的值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異的情況下，將該檢測(cè)對(duì)象認(rèn)定為罹患了 所述疾患，
[0037] (a)選自mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPr。中的至少一種mt-tRNA 的存在量、
[0038] (b)谷氨酸和/或天冬氨酸的存在量、
[0039] (c)ATP或者活性氧的存在量、
[0040] (d)選自Aralar1、Aralar2、GDH以及Musashi2 中的至少一種多肽與TDP-43 的結(jié)合量、或者
[0041] (e)選自mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPr。中的至少一種mt-tRNA 與TDP-43的結(jié)合量。
[0042] (2)如（1)所述的認(rèn)定方法，其中，所述疾患是將來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞內(nèi)的TDP-43 的存在量與來(lái)自健康個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)的該存在量相比較，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著增加的疾患。
[0043] (3)如⑴或⑵所述的認(rèn)定方法，其中，所述TDP-43是在序列號(hào)1所示氨基酸序 列中，以起始蛋氨酸為1位時(shí)，具有90位的丙氨酸被纈氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"A90V"）、 169位的天冬氨酸被甘氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"D169G"）、267位的天冬酰胺被絲氨酸（以 下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"N267S"）、287位的甘氨酸被絲氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"G287S"）、290位 的甘氨酸被丙氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"G290A"）、292位的絲氨酸被天冬酰胺（以下，有時(shí) 簡(jiǎn)稱為"S292N"）、294位的甘氨酸被丙氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"G294A"）、294位的甘氨 酸被纈氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"G294V"）、295位的甘氨酸被精氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為 "G295R"）、295位的甘氨酸被絲氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"G295S"）、298位的甘氨酸被絲氨 酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"G298S"）、311位的蛋氨酸被纈氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"M311V"）、 315位的丙氨酸被蘇氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"A315T"）、315位的丙氨酸被谷氨酸（以下， 有時(shí)簡(jiǎn)稱為"A315E"）、331位的谷氨酰胺被賴氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"Q331K"）、332位 的絲氨酸被天冬酰胺（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"S332N"）、335位的甘氨酸被天冬氨酸（以下，有 時(shí)簡(jiǎn)稱為"G33? "）、337位的蛋氨酸被纈氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"M337V"）、343位的谷 氨酰胺被精氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"Q343R"）、345位的天冬酰胺被賴氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn) 稱為"N345K"）、348位的甘氨酸被半胱氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"G348C"）、352位的天冬酰 胺被絲氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"N352S"）、352位的天冬酰胺被蘇氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為 "N352T"）、357位的甘氨酸被絲氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"G357S"）、361位的精氨酸被絲氨 酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"R361S"）、363位的脯氨酸被丙氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"P363A"）、 378位的天冬酰胺被天冬氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"N378D"）、379位的絲氨酸被半胱氨酸 (以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"S379C"）、379位的絲氨酸被脯氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"S379P"）、382 位的丙氨酸被脯氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"A382P"）、382位的丙氨酸被蘇氨酸（以下，有時(shí) 簡(jiǎn)稱為"A382T"）、383位的異亮氨酸被纈氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"I383V"）、384位的甘氨 酸被精氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"G384R"）、390位的天冬酰胺被天冬氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱 為"N390D"）、390位的天冬酰胺被絲氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"N390S"）、或393位的絲氨 酸被亮氨酸（以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"S393L"）取代的突變，或者，374位的酪氨酸以后缺失的突 變。
[0044] (4)如（3)所述的認(rèn)定方法，其中，所述突變是D169G、G298S或者R361S。
[0045] (5)如⑴?⑷中任一項(xiàng)所述的認(rèn)定方法，其中，所述疾患是神經(jīng)系統(tǒng)疾患。
[0046] (6)如（5)所述的認(rèn)定方法，其中，所述疾患選自肌萎縮側(cè)索硬化癥、阿爾茨海默 病、帕金森病以及額顳葉變性癥。
[0047] (7) -種降低細(xì)胞內(nèi)天冬氨酸、谷氨酸、ATP或者活性氧的存在量的藥劑的制造方 法，其特征在于，包括：
[0048] 導(dǎo)入工序，將藥劑候補(bǔ)物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)；
[0049] 測(cè)定工序，測(cè)定含有所述藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的細(xì)胞和不含所述藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的細(xì)胞中 的所述天冬氨酸、谷氨酸、ATP或者活性氧的存在量；
[0050] 選擇工序，比較所述測(cè)定工序中獲得的兩種細(xì)胞的測(cè)定值，在含有所述藥劑候補(bǔ) 物質(zhì)的細(xì)胞的測(cè)定值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著低的情況下，選擇該藥劑候補(bǔ)物質(zhì)作為目的藥劑。
[0051] (8) -種TDP-43結(jié)合抑制劑的制造方法，其特征在于，包括：
[0052] 混合工序，將下述（a)和/或（b)和TDP-43與藥劑候補(bǔ)物質(zhì)一起混合，
[0053] (a)選自mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPr。的至少一種mt-tRNA，
[0054] (b)選自Aralarl、Aralar2、GDH以及Musashi2 的至少一種蛋白質(zhì)；
[0055] 檢測(cè)工序，檢測(cè)所述mt-tRNA和/或所述蛋白質(zhì)與所述TDP-43的結(jié)合量；
[0056] 選擇工序，在所述結(jié)合未被檢測(cè)的情況下，或者被檢測(cè)的結(jié)合量與不存在所述藥 劑候補(bǔ)物質(zhì)時(shí)所對(duì)應(yīng)的mt-tRNA和/或蛋白質(zhì)與TDP-43的結(jié)合量相比較，兩者的值在統(tǒng)計(jì) 學(xué)上具有顯著差異的情況下，選擇該藥劑候補(bǔ)物質(zhì)作為T(mén)DP-43結(jié)合抑制劑。
[0057] (9)如⑶所述的制造方法，其中，所述藥劑候補(bǔ)物質(zhì)是在所述（a)所示的 mt-tRNA或者所述（b)所示的蛋白質(zhì)之間，與IDP-43競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的物質(zhì)。
[0058] (10)如（8)所述的制造方法，其中，所述藥劑候補(bǔ)物質(zhì)是降低細(xì)胞內(nèi)的活性狀態(tài) 的所述（a)所示的mt-tRNA或者所述（b)所示的蛋白質(zhì)的存在量的物質(zhì)。
[0059] (11)如（9)或（10)所述的制造方法，其中，所述藥劑候補(bǔ)物質(zhì)是核酸分子、肽或者 低分子化合物。
[0060] (12)如（11)所述的制造方法，其中，所述藥劑候補(bǔ)物質(zhì)是下述（a)、(b)、（c)或者 (d)：
[0061] (a)含有由序列號(hào)2、4或5所示的氨基酸序列組成的多肽的100個(gè)氨基酸以下的 多肽、
[0062] (b)含有在序列號(hào)2、4或5所示的氨基酸序列中包含1?3個(gè)氨基酸的添加、缺失 或取代的多肽的130個(gè)氨基酸以下的多肽、
[0063] (c)由與序列號(hào)2、4或5所示的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列 組成的多肽、
[0064] (d)由序列號(hào)2、4或5所示的氨基酸序列組成的多肽的一部分。
[0065] (13)如（11)所述的制造方法，其中，所述藥劑候補(bǔ)物質(zhì)是與含有由TGG或UGG以 及/或者GTT或GUU組成的堿基序列的5?50個(gè)堿基的核酸分子結(jié)合的、由下述（a)、（b) 或（c)構(gòu)成的由9?20個(gè)氨基酸組成的肽，
[0066] (a)由序列號(hào)2所示的氨基酸序列組成的肽的一部分、
[0067] (b)由序列號(hào)2所示的氨基酸序列中含有1?3個(gè)氨基酸的添加、缺失或取代的肽 的一部分、
[0068](c)由與序列號(hào)2所示的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列組成的 肽的一部分。
[0069] (14)如（7)?（11)中任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，所述TDP-43是在序列號(hào)1所 示氨基酸序列中，以起始蛋氨酸為1位時(shí)，具有A90V、D169G、N267S、G287S、G290A、S292N、 G294A、G294V、G295R、G295S、G298S、M311V、A315T、A315E、Q331K、S332N、G335D、M337V、 Q343R、N345K、G348C、N352S、N352T、G357S、R361S、P363A、N378D、S379C、S379P、A382P、 A382T、I383V、G384R、N390D、N390S或S393L的突變，或者具有374位的酪氨酸以后缺失的 突變。
[0070] (15)如（14)所述的制造方法，其中，所述突變是D169G、G298S或者R361S。
[0071] (16)如（7)?（15)中任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，（7)所述的降低氨基酸、ATP 或者活性氧的細(xì)胞內(nèi)存在量的藥劑或者（8)?（15)中任一項(xiàng)所述的TDP-43結(jié)合抑制劑是 與TDP-43的細(xì)胞內(nèi)存在量相關(guān)聯(lián)的疾患治療劑的有效成分。
[0072] (17)如（16)所述的制造方法，其中，所述與TDP-43的細(xì)胞內(nèi)存在量相關(guān)聯(lián)的疾患 是，將來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞內(nèi)的TDP-43的存在量與來(lái)自健康個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)的該存在量相 比較，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著增加的疾患。
[0073] (18)如（16)或（17)所述的制造方法，其中，所述疾患是神經(jīng)系統(tǒng)疾患。
[0074] (19)如（18)所述的制造方法，其中，所述疾患選自肌萎縮側(cè)索硬化癥、阿爾茨海 默病、帕金森病以及額顳葉變性癥。
[0075] (20) -種TDP-43結(jié)合抑制劑，其含有兩個(gè)以上由TG或UG和/或GT或⑶組成的 堿基序列，抑制mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu或者mt-tRNAPl:°與TDP-43 的結(jié)合，由 5 ? 50個(gè)堿基的核酸分子組成。
[0076] (21)如（20)所述的TDP-43結(jié)合抑制劑，其含有兩個(gè)以上由TGG或UGG以及/或 者GTT或GUU組成的堿基序列，由6?50個(gè)堿基的核酸分子組成。
[0077] (22)如（20)或（21)所述的TDP-43結(jié)合抑制劑，其中，所述堿基序列含有連續(xù)的 重復(fù)序列。
[0078] (23)如（22)所述的TDP-43結(jié)合抑制劑，其中，所述重復(fù)次數(shù)為3?15次。
[0079] (24)如（23)所述的TDP-43結(jié)合抑制劑，其含有序列號(hào)43、45或者46所示的堿基 序列。
[0080] 本說(shuō)明書(shū)包含作為本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的《日本國(guó)特許出愿2012-042256號(hào)》的 說(shuō)明書(shū)和/或附圖所述的內(nèi)容。
[0081] 發(fā)明的效果
[0082] 根據(jù)本發(fā)明的認(rèn)定方法，能夠以高精度認(rèn)定檢測(cè)對(duì)象是否罹患以ALS以及FTLD為 首的，與TDP-43在細(xì)胞內(nèi)的存在量相相關(guān)聯(lián)的疾患。
[0083] 根據(jù)本發(fā)明的制造法，能夠高效地選擇可能成為對(duì)于以ALS以及FTLD為首的，與 TDP-43的細(xì)胞內(nèi)存在量相關(guān)聯(lián)的疾患治療的有效成分的物質(zhì)。
[0084] 根據(jù)本發(fā)明的TDP-43結(jié)合抑制劑，可能提供與TDP-43的細(xì)胞內(nèi)存在量相關(guān)聯(lián)的 疾患治療的有效成分。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0085] 圖1表示通過(guò)拉下DAP-TDP-43而免疫共沉淀的RNA的尿素變性PAGE的結(jié)果。框 內(nèi)的帶1?3顯示的是與DAP-TDP-43特異性結(jié)合的RNA。右圖是使左圖的右側(cè)兩列過(guò)度曝 光的圖。
[0086] 圖2是納米LS-MS/MS的結(jié)果。
[0087] 圖3的A表示將通過(guò)拉下DAP-TDP-43而免疫共沉淀的RNA經(jīng)尿素變性PAGE后 使用SYBR金染色的結(jié)果。B表示以DAP-TDP-43免疫共沉淀的mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、 mt-tRNAPM以及mt-tRNAGlu的RNA印跡法的結(jié)果。
[0088] 圖4的A表示轉(zhuǎn)染了TDP-43-siRNA或者對(duì)照（非特異性siRNA)的HeLa細(xì)胞中的 TDP-43蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡法的檢測(cè)結(jié)果。B表示轉(zhuǎn)染了TDP-43-siRNA或者對(duì)照的HeLa 細(xì)胞的細(xì)胞增殖率。
[0089] 圖5表示由TDP-43-siRNA處理引起的各種RNA在HeLa細(xì)胞內(nèi)的存在量的變動(dòng)。 5. 8S表示 5. 8SrRNA，U1 表示UlsnRNA，Asn表示mt-tRNAAsn，Gin表示mt-tRNAGln，Leu表示 mt-tRNALeu(UUK)。該結(jié)果基于至少三次的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0090] 圖6的A表示當(dāng)DAP-IDP-43過(guò)量表達(dá)時(shí)，對(duì)DAP-IDP-43和內(nèi)源性IDP-43進(jìn)行蛋 白質(zhì)印跡法解析的結(jié)果。B表示當(dāng)DAP-TDP-43過(guò)量表達(dá)時(shí)，對(duì)mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln、 以及5. 8SrRNA進(jìn)行RNA印跡法解析的結(jié)果。
[0091] 圖7的A表示mt-tRNAAsn或者mt-tRNAGln的經(jīng)時(shí)分解的圖。B表示與DAP-TDP-43 的經(jīng)時(shí)免疫共沉淀的結(jié)果。
[0092] 圖8的A表示野生型TDP-43以及各結(jié)構(gòu)域缺失型TDP-43的構(gòu)造的示意圖。黒棒 以及白棒表示TPD-43中的結(jié)構(gòu)域。棒下方的數(shù)值表示在IDP-43的氨基酸序列中，以起始 蛋氨酸為1位時(shí)的位置。B表示野生型TDP-43以及各結(jié)構(gòu)域缺失型TDP-43表達(dá)株中由強(qiáng) 力霉素誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)的各蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果。C表示與野生型TDP-43以及 各結(jié)構(gòu)域缺失型IDP-43結(jié)合的mt-tRNAAsn以及mt-tRNA?的RNA印跡法的結(jié)果。
[0093] 圖9是表示由結(jié)構(gòu)域缺失型TDP-43誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的圖。該結(jié)果基于至少三次 的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0094] 圖10的A表示實(shí)驗(yàn)中使用的野生型TDP-43以及各突變型TDP-43的示意圖。圖 中，星標(biāo)表示各突變型TDP-43中的突變（點(diǎn)突變）的位置。D169G是TDP-43的氨基酸序 列169位的D被G取代的突變、G298S是TDP-43的氨基酸序列298位的G被S取代的突變、 R361S是TDP-43的氨基酸序列361位的R被S取代的突變。B是表示野生型以及各突變型 TDP-43表達(dá)株的生存率的圖。
[0095] 圖11是表示通過(guò)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)野生型以及各突變型TDP-43表達(dá)時(shí)各mt-tRNA在 細(xì)胞內(nèi)的存在量的圖。所示各值為將未添加強(qiáng)力霉素時(shí)（_dox)規(guī)定為1時(shí)的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí) (+dox)的相對(duì)值。
[0096] 圖12表示通過(guò)拉下DAP-TDP-43而免疫共沉淀的新型TDP-43結(jié)合蛋白質(zhì)的蛋白 質(zhì)印跡法的結(jié)果。
[0097] 圖13的A表示aralar1以及aralar2的互換免疫沉降的結(jié)果。B表示與aralar 1或者aralar2免疫共沉淀的mt-tRNAAsn的結(jié)果。
[0098] 圖14表示通過(guò)拉下Musashi2而免疫共沉淀的mt-tRNA間的RNA印跡法的結(jié)果。
[0099] 圖15是表示aralar1或者aralar2與結(jié)構(gòu)域缺失型TDP-43的結(jié)合的圖。
[0100] 圖16的A是表示通過(guò)TDP-43-siRNA抑制IDP-43表達(dá)時(shí)每個(gè)細(xì)胞的ATP存在量 的圖。B表示通過(guò)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)使DAP-TDP-43過(guò)量表達(dá)時(shí)每個(gè)細(xì)胞的ATP存在量的圖。
[0101] 圖17-1是表示各結(jié)構(gòu)域缺失型IDP-43表達(dá)時(shí)的mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln以及 tRNA^的細(xì)胞內(nèi)存在量的圖。所示各值為將未添加強(qiáng)力霉素時(shí)（-dox)規(guī)定為1時(shí)的誘導(dǎo) 表達(dá)時(shí)（+dox)的相對(duì)值。
[0102] 圖17-2表示各結(jié)構(gòu)域缺失型TDP-43表達(dá)時(shí)的ATP的測(cè)定結(jié)果。
[0103] 圖18表示具有ALS樣突變型IDP-43(D169G、G298S、R361S)的誘導(dǎo)表達(dá)型細(xì)胞系 中，上述突變型TDP-43誘導(dǎo)后的ATP的細(xì)胞內(nèi)存在量的圖。
[0104] 圖19表示將與TDP-43結(jié)合的4種mt-tRNA的序列比對(duì)的圖。圖中的星號(hào)表示在 全部4種mt-tRNA中皆被保留的堿基。另外，將相當(dāng)于各mt-tRNA形成高級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)的D環(huán)、 反密碼子環(huán)、可變區(qū)域、T環(huán)以及接受臂的堿基示于序列下部。
[0105] 圖20是表示與TDP-43結(jié)合的mt-tRNAAsn的二級(jí)結(jié)構(gòu)。圖中的附有星號(hào)的堿基是圖 19中所示的與IDP-43結(jié)合的全部4種mt-tRNA中皆被保留的堿基。圖中的箭頭表示與實(shí) 施例13(2)的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)試中使用的TDP-43結(jié)合抑制劑候補(bǔ)寡核苷酸（D-loop、Anticodon、 T-l〇〇p)所對(duì)應(yīng)的mt-tRNA的分割部位。需要說(shuō)明的是，由于該圖中將mt-tRNA以DNA表 示，因此U被T取代。
[0106] 圖21是表示通過(guò)TDP-43結(jié)合抑制劑候補(bǔ)寡核苷酸抑制TDP-43與mt-tRNA結(jié)合的 圖。A表示通過(guò)Flag-IP而與DAP-TDP-43免疫共沉淀的核酸的尿素變性PAGE的結(jié)果。圖 中所示的mt-tRNA表示與TDP-43結(jié)合的4種mt-tRNA。B表示在競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)中與DAP-TDP-43 免疫共沉淀的mt-tRNAAsn的RNA印跡法的結(jié)果。
[0107] 圖22是表示通過(guò)具有重復(fù)序列的各種IDP-43結(jié)合抑制劑候補(bǔ)寡核苷酸抑制 TDP-43與mt-tRNA結(jié)合的圖。A表示通過(guò)Flag-IP而與DAP-TDP-43發(fā)生免疫共沉淀的寡 核苷酸的尿素變性PAGE的結(jié)果。圖中的mt-tRNA表示與TDP-43結(jié)合的4種mt-tRNA。B 表示在競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)中與DAP-TDP-43免疫共沉淀的mt-tRNAAsn的RNA印跡法的結(jié)果。
[0108] 圖23是表示加入各濃度的（TG) 12時(shí)抑制TDP-43與mt-tRNA結(jié)合的圖。A表示通 過(guò)Flag-IP而與DAP-TDP-43免疫共沉淀的mt-tRNA的尿素變性PAGE的結(jié)果。B表示在競(jìng) 爭(zhēng)反應(yīng)中與DAP-TDP-43免疫共沉淀的mt-tRNAAsn的RNA印跡法的結(jié)果。C為將B的結(jié)果圖 表化的圖。
[0109] 圖24是表示細(xì)胞內(nèi)的IDP-43與活性氧量的經(jīng)時(shí)關(guān)系的圖。

【具體實(shí)施方式】
[0110] 1.TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的認(rèn)定方法
[0111] 1-1?概要
[0112] 本發(fā)明的第1方式是IDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的認(rèn)定方法。本方式的方法的 特征在于，通過(guò)測(cè)定從檢測(cè)對(duì)象采集的細(xì)胞中的測(cè)定物質(zhì)的存在量或者測(cè)定物質(zhì)與TDP-43 的結(jié)合量等，認(rèn)定該檢測(cè)對(duì)象是否罹患TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患。
[0113] 1-2.對(duì)象疾患
[0114] 本發(fā)明的對(duì)象疾患是"TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患"。在這里，"TARDNA 結(jié)合蛋白質(zhì)-43 (TDP-43:TARDNA-bindingProtein43kDa) " 是，不均一核糖核蛋白 (heterogeneousnuclearribonucleoprotein:hnRNP)的一種。TDP-43 在分子內(nèi)具有兩 個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，是能夠在細(xì)胞內(nèi)的核質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)間往來(lái)的蛋白質(zhì)。本說(shuō)明書(shū)中，TDP-43 除了由序列號(hào)1所示氨基酸序列組成的人野生型TDP-43以外，還包含由序列號(hào)1所示氨基 酸序列中含有1個(gè)或者數(shù)個(gè)氨基酸的缺失、取代和/或添加的氨基酸序列組成的人突變型 TDP-43、以及與序列號(hào)1所示氨基酸序列具有85%以上，優(yōu)選90%以上，更優(yōu)選95%以上同 一性的氨基酸序列組成的、且與人野生型TDP-43具有同等功能的人突變型TDP-43或其他 物種的TDP-43同源體。需要說(shuō)明的是，本說(shuō)明書(shū)中，"數(shù)個(gè)"意為2?10的整數(shù)，例如意為 2?7、2?5、2?4、2?3的整數(shù)。另外，本說(shuō)明書(shū)中的"同一性"意為，在兩個(gè)氨基酸序列 間，以使氨基酸的一致數(shù)為最大的方式，根據(jù)需要在一方或者雙方導(dǎo)入間隙（gap)而進(jìn)行 比對(duì)時(shí)，相對(duì)于一方的氨基酸序列（在此為序列號(hào)1所示氨基酸序列）的全部氨基酸數(shù)，另 一方的氨基酸序列中與上述一致的氨基酸數(shù)的比例（％ )。
[0115] 作為由在上述序列號(hào)1所示氨基酸序列中含有1個(gè)或者數(shù)個(gè)氨基酸的取代、或者 缺失的氨基酸序列組成的人突變型IDP-43的具體例，能夠列舉例如，在序列號(hào)1所示氨 基酸序列中以起始蛋氨酸為1位時(shí)（以下，在本說(shuō)明書(shū)中相同），90位的丙氨酸被纈氨酸 (A90V)、169位的天冬氨酸被甘氨酸（D169G)、267位的天冬酰胺被絲氨酸（N267S)、287位 的甘氨酸被絲氨酸（G287S)、290位的甘氨酸被丙氨酸（G290A)、292位的絲氨酸被天冬酰 胺（S292N)、294位的甘氨酸被丙氨酸（G294A)、294位的甘氨酸被纈氨酸（G294V)、295位 的甘氨酸被精氨酸（G295R)、295位的甘氨酸被絲氨酸（G295S)、298位的甘氨酸被絲氨酸 (G298S)、311位的蛋氨酸被纈氨酸（M311V)、315位的丙氨酸被蘇氨酸（A315T)、315位的丙 氨酸被谷氨酸（A315E)、331位的谷氨酰胺被賴氨酸（Q331K)、332位的絲氨酸被天冬酰胺 (S332N)、335位的甘氨酸被天冬氨酸（G33OT)、337位的蛋氨酸被纈氨酸（M337V)、343位的 谷氨酰胺被精氨酸（Q343R)、345位的天冬酰胺被賴氨酸（N345K)、348位的甘氨酸被半胱氨 酸（G348C)、352位的天冬酰胺被絲氨酸（N352S)、352位的天冬酰胺被蘇氨酸（N352T)、357 位的甘氨酸被絲氨酸（G357S)、361位的精氨酸被絲氨酸（R361S)、363位的脯氨酸被丙氨酸 (P363A)、378位的天冬酰胺被天冬氨酸（N378D)、379位的絲氨酸被半胱氨酸（S379C)、379 位的絲氨酸被脯氨酸（S379P)、382位的丙氨酸被脯氨酸（A382P)、382位的丙氨酸被蘇氨 酸（A382T)、383位的異亮氨酸被纈氨酸（I383V)、384位的甘氨酸被精氨酸（G384R)、390位 的天冬酰胺被天冬氨酸（N390D)、390位的天冬酰胺被絲氨酸（N390S)、或393位的絲氨酸 被亮氨酸（S393L)分別取代的突變，或者具有374位的酪氨酸以后缺失的突變的人突變型 TDP-43。優(yōu)選具有D169G、G298S、或者R361S的突變的人突變型IDP-43。
[0116] 本說(shuō)明書(shū)中，"TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患"意為已知將單位個(gè)數(shù)細(xì)胞內(nèi) 的TDP-43存在量與健康個(gè)體的該量相比，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著增加或者減少的疾患。 TDP-43在健康個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)，每個(gè)細(xì)胞中的存在量受到極為嚴(yán)格的控制（Ayala，Y. M.，et al.，2011，EMBO J. 30 (2): 277-288.)。因此，當(dāng)其細(xì)胞內(nèi)存在量脫離正常范圍變動(dòng)時(shí)，表示 該個(gè)體在身體上出現(xiàn)某種異常。IDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患只要是TDP-43的細(xì)胞內(nèi)存 在量脫離正常范圍的疾患，就不論疾患種類。另外，也可以是TDP-43在細(xì)胞內(nèi)的存在量的 變動(dòng)和疾患的關(guān)聯(lián)性尚未查明的疾患。優(yōu)選已知將單位個(gè)數(shù)細(xì)胞的上述TDP-43的存在量 與健康個(gè)體的該量相比較，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著增加的疾患。
[0117] 本說(shuō)明書(shū)中的"健康個(gè)體"意為至少?zèng)]有罹患TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的動(dòng) 物個(gè)體，優(yōu)選沒(méi)有罹患任何疾患的健康的動(dòng)物個(gè)體。健康個(gè)體原則上是與后述的檢測(cè)對(duì)象 同種的，優(yōu)選與檢測(cè)對(duì)象的機(jī)體條件接近的個(gè)體，例如，亞種（包含人種、品種）、性別、年齡 (包含月齡、周齡）、體重、體質(zhì)（過(guò)敏等）、既往病史相同或者接近條件的個(gè)體。
[0118] 本說(shuō)明書(shū)中"在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著"意為，將來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞以及與其同等個(gè)數(shù)的 來(lái)自健康個(gè)體的細(xì)胞中存在的TDP-43的量的差異通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理時(shí)，在兩者間具有顯著 差異的情況。具體而言，能夠列舉例如，危險(xiǎn)率（顯著性水平）小于5%、1%或者0.1%的 情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)的處理的檢驗(yàn)方法可以適當(dāng)使用能夠判斷有無(wú)顯著性的公知的檢驗(yàn)方法，不 做特別限定。例如能夠使用t檢驗(yàn)法（Student's t test)、多重比較檢驗(yàn)法。
[0119] 作為T(mén)DP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的具體例，已知的TDP-43的存在量與健康個(gè) 體的該量相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著增加的疾患大多是神經(jīng)系統(tǒng)疾患。因此，神經(jīng)系統(tǒng)疾患適 合作為本發(fā)明的對(duì)象疾患。作為這樣的神經(jīng)疾患，能夠列舉例如ALS、FTLD、阿爾茨海默病 (AD:Alzheimer disease)或者帕金森病（PD:Parkinson disease)。ALS 或者 FTLD 優(yōu)選為 本發(fā)明的對(duì)象疾患。
[0120] 1-3.認(rèn)定方法
[0121] 本發(fā)明的TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的認(rèn)定方法包括測(cè)定工序以及認(rèn)定工 序。以下，對(duì)于各工序進(jìn)行具體說(shuō)明。
[0122] (1)測(cè)定工序
[0123] 本方式中，"測(cè)定工序"是測(cè)定來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞內(nèi)的測(cè)定物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)存在量 或者與IDP-43的結(jié)合量的工序。
[0124] 本說(shuō)明書(shū)中，"檢測(cè)對(duì)象"意為供檢查的個(gè)體，即指后述的提供細(xì)胞的動(dòng)物個(gè)體。此 處所說(shuō)動(dòng)物意為脊椎動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人類。
[0125] 本說(shuō)明書(shū)中，"來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞"意為從檢測(cè)對(duì)象采集的細(xì)胞。不限定是來(lái)自 何種器官或者組織的細(xì)胞。本發(fā)明中能夠適當(dāng)使用腦神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、腦脊液細(xì)胞或者血液 細(xì)胞等?；蛘撸景l(fā)明中也能夠適當(dāng)使用從基于由檢測(cè)對(duì)象采集的皮膚等的細(xì)胞制作的誘 導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell ;iPS細(xì)胞）誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞（運(yùn)動(dòng) 神經(jīng)元）等。這些細(xì)胞通過(guò)公知的采集方法采集即可?；蛘咭部梢允菍?lái)自檢測(cè)對(duì)象的細(xì) 胞通過(guò)培養(yǎng)而增殖的細(xì)胞。例如，在采集血液細(xì)胞的情況下，能夠通過(guò)向末梢部的靜脈等進(jìn) 行注射而采集末梢血獲得。另外，如果是腦脊液細(xì)胞，則能夠通過(guò)公知的腰椎穿刺采集腦脊 液獲得。上述細(xì)胞可以在從檢測(cè)對(duì)象采集后立即使用，也可以經(jīng)冷凍或者冷藏保存一定時(shí) 間后，根據(jù)需要進(jìn)行解凍等處理后使用。本工序中所使用的細(xì)胞的量若為至少2X10 6個(gè)， 優(yōu)選至少1 X 106個(gè)，更優(yōu)選至少5X 10 5個(gè)，則能夠?qū)⒑笫龅臏y(cè)定物質(zhì)充分檢測(cè)。
[0126] 本方式中，"測(cè)定物質(zhì)"意為在本工序中需要測(cè)定的物質(zhì)，具體而言，有下述物質(zhì)：
[0127]⑴ 4 種 mt-tRNA，即 mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及 mt-tRNA Pr。，
[0128] (ii)谷氨酸（Glu)以及天冬氨酸（Asp)，
[0129] (iii) ATP或者活性氧，或者
[0130] (iv) Aralar 1、Aralar 2、GDH 以及 Musashi 2〇
[0131] 本測(cè)定工序中，需要測(cè)定的值為：
[0132] (a)選自上述（i)所示mt-tRNA組中的至少一種mt-tRNA在細(xì)胞內(nèi)的存在量，
[0133] (b)上述（ii)所示任意一方或者雙方的氨基酸在細(xì)胞內(nèi)的存在量，優(yōu)選氨基酸濃 度，
[0134] (c)上述（iii)所示ATP或者活性氧的細(xì)胞內(nèi)存在量，優(yōu)選ATP濃度或者活性氧濃 度，
[0135] (d)選自上述（iv)所示的多肽中的至少一種多肽與TDP-43的結(jié)合量，或者
[0136] (e)選自上述（i)所示的mt-tRNA組中的至少一種mt-tRNA與TDP-43的結(jié)合量。
[0137] 本說(shuō)明書(shū)中，"（細(xì)胞內(nèi)）存在量"意為在細(xì)胞中所含的測(cè)定物質(zhì)的分量。存在量 可以是濃度、熒光強(qiáng)度、離子強(qiáng)度或者放射線強(qiáng)度等相對(duì)量，也可以是容量等規(guī)定單位細(xì)胞 個(gè)數(shù)的測(cè)定物質(zhì)的絕對(duì)量。
[0138] 本說(shuō)明書(shū)中，"TDP-43的結(jié)合量"意為與規(guī)定量的TDP-43直接或者間接結(jié)合的測(cè) 定物質(zhì)的相對(duì)量或者絕對(duì)量。所以，"測(cè)定所測(cè)定物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)存在量或者與TDP-43的結(jié) 合量"意為，將測(cè)定物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)存在量或者與TDP-43的結(jié)合量定量。
[0139] 上述（d)所示的測(cè)定物質(zhì)的結(jié)合量中，關(guān)于Aralar 1以及Aralar 2,更具體而言， 是與TDP-43中的GR結(jié)構(gòu)域和/或315結(jié)構(gòu)域的結(jié)合量。另外，上述（e)所示的測(cè)定物質(zhì) 的結(jié)合量，更具體而言，是從上述（i)所示mt-tRNA組中選取的至少一種mt-tRNA與TDP-43 中的RRM1 (RNA Recognition Motif-1)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合量。上述（a)?（e)測(cè)定其中任意一 個(gè)量即足夠，但也可以測(cè)定兩個(gè)以上的量。通過(guò)測(cè)定二個(gè)以上，能夠消除測(cè)定誤差等導(dǎo)致的 誤認(rèn)定，確保較高的認(rèn)定精度。
[0140] 需要說(shuō)明的是，健康個(gè)體中，一個(gè)細(xì)胞中的上述（a)?（e)所示測(cè)定物質(zhì)的存在量 或者結(jié)合量被極為嚴(yán)格地控制在不超過(guò)規(guī)定量的10%的范圍。本發(fā)明的發(fā)明人明確了上 述（a)?（e)所示的測(cè)定物質(zhì)的存在量或者結(jié)合量的變動(dòng)與TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾 患具有密切的關(guān)聯(lián)性。所以，通過(guò)測(cè)定（a)?（e)所示的存在量或者結(jié)合量，能夠認(rèn)定是否 罹患TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患。
[0141] 本工序中的具體的的測(cè)定方法因測(cè)定上述（a)?（e)所示的何種測(cè)定物質(zhì)而異。
[0142] 測(cè)定（a)所示的mt-tRNA在細(xì)胞內(nèi)的存在量的方法只要是測(cè)定RNA領(lǐng)域所公知 的方法，便不做特別限制。例如能夠利用使用具有與目標(biāo)mt-tRNA的全部或者一部分的 堿基序列互補(bǔ)的堿基序列且能夠特異性檢測(cè)目標(biāo)mt-tRNA的核酸探針的檢測(cè)方法、或者定 量RT-PCR法等。使用核酸探針的檢測(cè)方法中，能夠列舉例如RNA印跡法、表面等離子體 共振（SPR :Surface Plasmon Resonance)法或者石英晶體微天平（QCM :Quarts Crystal Microbalance)法。上述方法都是該領(lǐng)域公知技術(shù)，在本發(fā)明中也遵循公知的方法進(jìn)行即 可。具體而言，例如，參照 Sambrook，J.et. al.，（2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual Third Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork 或，森泉豐榮、中本高道，（1997)《傳感器工學(xué)》，昭晃堂；稻田利文、鹽見(jiàn)春彥，2008,羊土社， 《RNA實(shí)驗(yàn)筆記》所述的方法即可。為了獲得較準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果，可以將上述二種以上的方 法組合使用。
[0143] 另外，測(cè)定（b)所示的氨基酸的存在量，以及（c)所示的ATP或者活性氧的存在量 的方法，能夠利用例如質(zhì)譜法、NMR法或者熒光素酶顯色法。質(zhì)譜法包含高效液相色譜-質(zhì) 譜法（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry 法；以下簡(jiǎn)稱 "LC-MS"）、高效液相色 譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（以下簡(jiǎn)稱LC-MS/MS)、氣相色譜-質(zhì)譜法（Gas Chromatography-Mass Spectrometir)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS)、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜法（CE-MS)以及 ICP質(zhì)譜法（ICP-MS)。上述方法都是該領(lǐng)域公知技術(shù)，遵循這些方法進(jìn)行即可。例如，參照 Iijima et al. , The Plant Journal(2008)54, 949-962, Hirai et al. Proc Natl Acad Sci USA(2004)101(27)10205-10210, Sato et al.，The Plant Journal(2004)40(1)151-163， 或者 Shimizu et al.，Proteomics (2005) 5, 3919-3931 即可。優(yōu)選測(cè)定方法為 LC-MS 或者 LC-MS/MS〇
[0144] 進(jìn)而，測(cè)定（d)所示的多肽與TDP-43的結(jié)合量的方法只要是檢測(cè)蛋白質(zhì)間相互作 用的該領(lǐng)域公知的方法，便不做特別限制。能夠列舉例如特異性識(shí)別各個(gè)多肽的抗體，BP， 抗Aralar 1抗體、抗Aralar 2抗體、抗⑶H抗體或者抗Musashi 2抗體，以及使用抗TDP-43 抗體的免疫學(xué)測(cè)定法。本說(shuō)明書(shū)中的特異性識(shí)別各個(gè)多肽的抗體可以是多克隆抗體、單克 隆抗體、重組抗體中的任意一種。重組抗體包含嵌和抗體以及合成抗體。另外，此處的"合成 抗體"意為使用化學(xué)方法或者DNA重組法合成的抗體。能夠列舉例如單鏈Fv (scFv :single chain Fragment of variable region)、雙鏈抗體（diabody)、三鏈抗體（triabody)或者四 鏈抗體（tetrabody)等。免疫學(xué)的測(cè)定法包含例如免疫共沉淀法、Far-western blotting 法、ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法、酶抗體法、放射免疫測(cè)定法。這些 方法都是該領(lǐng)域公知的方法，在本發(fā)明中，原則上遵循公知的方法進(jìn)行即可。具體而言， 例如參照 Sambrook，J.et. al.，（2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual Third Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 所述方法艮P 可。
[0145] 而后，測(cè)定（e)所示的mt-tRNA與TDP-43的結(jié)合量的方法只要是檢測(cè)RNA與蛋白 質(zhì)間的相互作用的該領(lǐng)域公知的方法，便不做特別限制。能夠列舉例如使用具有與各目標(biāo) mt-tRNA的全部或者一部分的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列且能夠特異性檢測(cè)各目標(biāo)mt-tRNA 的核酸探針以及抗TDP-43抗體的免疫學(xué)核酸測(cè)定法。具體而言，例如包含免疫共沉淀法、 Far-western blotting 法、RNA 印跡法、ELISA 法、RT-PCR 法。
[0146] (2)認(rèn)定工序
[0147] 本方式中，"認(rèn)定工序"意為將由上述測(cè)定工序獲得的測(cè)定值與來(lái)自健康個(gè)體的細(xì) 胞內(nèi)的對(duì)應(yīng)的測(cè)定值相比較，若兩者的值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異，則認(rèn)定該檢測(cè)對(duì)象罹 患上述疾患的認(rèn)定工序。
[0148]"來(lái)自健康個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)的對(duì)應(yīng)的測(cè)定值"意為，與上述測(cè)定工序獲得的來(lái)自檢測(cè) 對(duì)象的細(xì)胞內(nèi)的上述（a)?（e)的測(cè)定值相對(duì)應(yīng)的來(lái)自健康個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)的上述（a)? (e)的測(cè)定值。例如，在上述測(cè)定工序中測(cè)定來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞內(nèi)的規(guī)定的mt-tRNA的存 在量的情況下，來(lái)自健康個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)的該規(guī)定的mt-tRNA的存在量的測(cè)定值為來(lái)自健康 個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)的對(duì)應(yīng)的測(cè)定值。
[0149] 上述來(lái)自健康個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)的對(duì)應(yīng)的測(cè)定值是與來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞內(nèi)的測(cè)定 物質(zhì)的測(cè)定在相同方法以及相同條件下測(cè)定的值。所以，上述測(cè)定工序中，也可以與測(cè)定來(lái) 自檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞內(nèi)的測(cè)定物質(zhì)一起，在相同方法以及相同條件下測(cè)定來(lái)自健康個(gè)體的細(xì) 胞內(nèi)的對(duì)應(yīng)的測(cè)定物質(zhì)。另外，也能夠預(yù)先測(cè)定各種生理?xiàng)l件下的健康個(gè)體的（a)?（e)的 測(cè)定值并建立數(shù)據(jù)庫(kù)，在測(cè)定來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞內(nèi)的測(cè)定物質(zhì)時(shí)，調(diào)出該數(shù)據(jù)庫(kù)中與檢 測(cè)對(duì)象的生理?xiàng)l件最接近的健康個(gè)體的數(shù)據(jù)，以該數(shù)據(jù)上的測(cè)定物質(zhì)的測(cè)定方法以及測(cè)定 條件對(duì)來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞內(nèi)的測(cè)定物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。這種情況下，即使在沒(méi)有作為比較對(duì) 象的來(lái)自健康個(gè)體的樣品的情況下，也能夠認(rèn)定是否罹患TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患， 因此是便利的。
[0150] 上述統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異既可以是細(xì)胞內(nèi)的來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的測(cè)定物質(zhì)的存在量 或者結(jié)合量多于來(lái)自健康個(gè)體的對(duì)應(yīng)的該量，也可以是少于來(lái)自健康個(gè)體的對(duì)應(yīng)的該量。 由于上述測(cè)定物質(zhì)通常被調(diào)控在規(guī)定的范圍內(nèi)，因此超出該范圍時(shí)，不論多少，都可能和 TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患有關(guān)。
[0151] 所以，例如，對(duì)于（a)所示的mt-tRNA的存在量而言，在來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞中的 量明顯多于或者少于來(lái)自健康個(gè)體的細(xì)胞的情況下，認(rèn)定該檢測(cè)對(duì)象罹患TDP-43細(xì)胞內(nèi) 存在量關(guān)聯(lián)疾患的可能性高。同樣，對(duì)于（b)所示的氨基酸的存在量或者（c)所示的ATP 或活性氧的存在量而言，在來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞中的量明顯地多于或者少于來(lái)自健康個(gè)體 的細(xì)胞的量的情況下，認(rèn)定該檢測(cè)對(duì)象有罹患TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的可能性。而 且，對(duì)于（d)所示的多肽與TDP-43的結(jié)合量或者（e)所示的mt-tRNA與TDP-43的結(jié)合量 而言，在來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞中的量明顯地多于或者少于來(lái)自健康個(gè)體的細(xì)胞的量的情況 下，認(rèn)定該檢測(cè)對(duì)象罹患TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的可能性高。更具體而言，例如，在 來(lái)自有與ALS類似的癥狀或者征兆的檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞中，（a)所示的mt-tRNA的存在量明 顯地多于來(lái)自健康個(gè)體的細(xì)胞的情況、（b)所示的氨基酸的存在量或者（c)所示的ATP或 活性氧的存在量明顯地多于來(lái)自健康個(gè)體的細(xì)胞的情況、或者（d)所示的多肽與TDP-43的 結(jié)合量或者（e)所示的mt-tRNA與TDP-43的結(jié)合量明顯地多于來(lái)自健康個(gè)體的細(xì)胞的情 況下，認(rèn)定該檢測(cè)對(duì)象罹患有ALS的可能性高。通過(guò)將檢測(cè)對(duì)象與健康個(gè)體中的兩種以上 的測(cè)定物質(zhì)的測(cè)定值進(jìn)行比較，相對(duì)于測(cè)定單一的測(cè)定物質(zhì)時(shí)的假陽(yáng)性比例以及偽陰性比 例低，能夠以較高精度進(jìn)行認(rèn)定。
[0152] 在比較檢測(cè)對(duì)象與健康個(gè)體的分別對(duì)應(yīng)的測(cè)定值的情況下，為了將供測(cè)定的兩者 的細(xì)胞量進(jìn)行比較補(bǔ)正，可以將被認(rèn)為在細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有量的差異的公知的蛋白質(zhì)或核酸作 為內(nèi)部對(duì)照使用。作為這樣的內(nèi)部對(duì)照用的蛋白質(zhì)，能夠列舉例如甘油醛3-磷酸脫氫酶 (GAPDH :glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)、0 -肌動(dòng)蛋白、白蛋白，另外，作為 內(nèi)部對(duì)照用的核酸能夠列舉例如5S rRNA、5. 8S rRNA、UlsnRNA等。由于通過(guò)使用這樣的內(nèi) 部對(duì)照能夠?qū)z測(cè)對(duì)象和健康個(gè)體的定量結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)正，因此能夠獲得準(zhǔn)確的測(cè)定值。
[0153] 1-4?效果
[0154] 根據(jù)本發(fā)明的認(rèn)定IW-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的認(rèn)定方法，能夠?qū)⒛壳袄щy 的以ALS為代表的TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患在發(fā)病前或者發(fā)病早期準(zhǔn)確地認(rèn)定。
[0155] 另外，通過(guò)經(jīng)時(shí)地對(duì)于同一患有TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的患者進(jìn)行本發(fā) 明的TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的認(rèn)定方法，能夠?qū)υ摶颊叩脑摷不嫉母纳苹驉夯?變化進(jìn)行監(jiān)控。
[0156] 2.藥劑制造方法
[0157] 2-1?概要
[0158] 本發(fā)明的第2方式是降低細(xì)胞內(nèi)的測(cè)定物質(zhì)的存在量的藥劑的制造方法。通過(guò)本 制造方法，能夠獲得可能成為T(mén)DP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的治療劑中的有效成分的藥 劑。
[0159] 2-2?制造方法
[0160] 本方式的制造方法包括導(dǎo)入工序、測(cè)定工序、選擇工序。以下，對(duì)于各工序進(jìn)行具 體說(shuō)明。
[0161] (1)導(dǎo)入工序
[0162] 本方式中的"導(dǎo)入工序"意為將藥劑候補(bǔ)物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)工序。
[0163] 本方式中的"藥劑候補(bǔ)物質(zhì)"意為，在本發(fā)明的制造方法中可能成為降低細(xì)胞內(nèi)的 后述的測(cè)定物質(zhì)的存在量的藥劑的候補(bǔ)物質(zhì)。該物質(zhì)的種類只要是可能成為具有上述降低 效果的藥劑的候補(bǔ)的物質(zhì)，則不做特別限制。能夠列舉例如肽、寡核苷酸或者低分子化合物 等作為藥劑候補(bǔ)物質(zhì)。作為肽的具體例，能夠列舉RNA酶、ATP酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化 物酶、過(guò)氧化氫酶、GDH等酶。
[0164] 本方式中的"測(cè)定物質(zhì)"是上述第1方式中測(cè)定物質(zhì)的一部分，即，
[0165] ⑴兩種氨基酸，即，谷氨酸（Glu)以及天冬氨酸（Asp)，
[0166] (ii)ATP或者活性氧
[0167] 或者，
[0168] (iii)4 種mt-tRNA，即，mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPr。。
[0169] 本方式中使用的"細(xì)胞"是來(lái)自動(dòng)物的細(xì)胞，優(yōu)選來(lái)自脊椎動(dòng)物，更優(yōu)選來(lái)自哺乳 動(dòng)物，進(jìn)一步優(yōu)選來(lái)自人的細(xì)胞，特別是來(lái)自作為治療對(duì)象的罹患TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān) 聯(lián)疾患的患者的細(xì)胞。不論細(xì)胞來(lái)自何種器官或者組織。由于本發(fā)明的制造方法所制造的 藥劑可能成為上述的TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的治療劑的有效成分，所以本方式所 使用的細(xì)胞優(yōu)選來(lái)自作為目標(biāo)的TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的發(fā)病部位的器官或者組 織的細(xì)胞（包含iPS細(xì)胞），或者使TDP-43過(guò)量表達(dá)的培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞宜是培養(yǎng)細(xì)胞?？?以是原代培養(yǎng)細(xì)胞、繼代培養(yǎng)細(xì)胞、或者株化細(xì)胞中的任意種類。
[0170] 導(dǎo)入細(xì)胞的藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的分量可以按所使用的藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的種類適當(dāng)決定。 需要說(shuō)明的是，本方式中藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的效果只要能使測(cè)定物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的存在量降低便 足夠，沒(méi)有完全去除的必要。這是因?yàn)椋绾笏?，由于本方式的任意一種測(cè)定物質(zhì)都是個(gè) 體生存所必須的物質(zhì)，所以從細(xì)胞內(nèi)將其完全去除則有可能對(duì)于細(xì)胞乃至對(duì)于個(gè)體產(chǎn)生嚴(yán) 重的副作用。
[0171] 將藥劑候補(bǔ)物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法可以使用該領(lǐng)域公知的方法。在將核酸分子 或肽導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，能夠使用例如電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、DEAE右旋糖酐法、顯微注 射、病毒感染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、使用細(xì)胞膜透過(guò)性肽的方法等周知的方法。另外，也可以使 用Lipofectamin2000(Invitrogen社）等市場(chǎng)銷售的核酸導(dǎo)入劑。在將低分子化合物導(dǎo)入 細(xì)胞內(nèi)時(shí)，則通常向培養(yǎng)基中添加即可。
[0172] (2)測(cè)定工序
[0173] 本方式中的"測(cè)定工序"與上述第1方式中的測(cè)定工序不同，是指測(cè)定含有以及不 含上述藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)的各種測(cè)定物質(zhì)的存在量的工序。測(cè)定方法可以與上述第1 方式所述的方法同樣地進(jìn)行。
[0174] "含有以及不含藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的細(xì)胞"希望是除了藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的含有與否這一 條件以外，其他條件都相同，即，所來(lái)自的個(gè)體、所來(lái)自的組織、培養(yǎng)條件（包含培養(yǎng)基的組 成（除了有無(wú)藥劑候補(bǔ)物質(zhì)）、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度等）相同。
[0175] (3)選擇工序
[0176] 本方式中的"選擇工序"意為，比較含有以及不含藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的細(xì)胞的經(jīng)上述測(cè) 定工序獲得的測(cè)定值，即，測(cè)定物質(zhì)的存在量，在含有上述藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的細(xì)胞的測(cè)定值在 統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著低于不含藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的細(xì)胞的測(cè)定值的情況下，將該藥劑候補(bǔ)物質(zhì)作為目 的藥劑選擇的工序。測(cè)定值的差只要具有差異性即可，不論其大小。這是因?yàn)楂@得的藥劑 的藥效的差異通過(guò)制藥時(shí)適當(dāng)增減每一份制劑所含有的該藥劑的量即可。
[0177] 2-3.效果
[0178] 根據(jù)本發(fā)明的降低細(xì)胞內(nèi)的測(cè)定物質(zhì)的存在量的藥劑的制造方法，能夠獲得至今 為止未知的可能成為T(mén)DP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的治療劑中的有效成分的藥劑。
[0179] 3. TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43結(jié)合抑制劑的制造方法
[0180] 3_1?概要
[0181] 本發(fā)明的第3方式是提供TDP-43結(jié)合抑制劑的制造方法。本方式的制造方法的 特征在于，通過(guò)添加藥劑候補(bǔ)物質(zhì)，制造能夠顯著降低測(cè)定物質(zhì)與TDP-43的結(jié)合的藥劑。
[0182] 3-2?制造方法
[0183] 本方式的制造方法包括混合工序、檢測(cè)工序、選擇工序。以下，對(duì)于各工序進(jìn)行具 體說(shuō)明。
[0184] (1)混合工序
[0185] 本方式中的"混合工序"意為將測(cè)定物質(zhì)和IDP-43與藥劑候補(bǔ)物質(zhì)共同混合的工 序。
[0186] 本方式中的"測(cè)定物質(zhì)"與上述第1方式中的測(cè)定物質(zhì)不同，是以下的至少一種物 質(zhì)。
[0187]⑴ 4 種 mt-tRNA，即 mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及 mt-tRNA Pr。
[0188] (ii) 4 種蛋白質(zhì)，即 Aralarl、Aralar2、GDH、以及 Musashi 2 (A)藥劑候補(bǔ)物質(zhì)
[0189] 本方式的"藥劑候補(bǔ)物質(zhì)"意為能夠顯著降低上述測(cè)定物質(zhì)與IDP-43的結(jié)合的藥 劑，g卩，TDP-43結(jié)合抑制劑的候補(bǔ)物質(zhì)。
[0190] 作為上述藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的例子，能夠列舉核酸分子、肽或者低分子化合物。
[0191] (A-1)核酸分子
[0192] 作為藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的核酸分子，為突變型mt-tRNA、結(jié)合區(qū)域核酸片段、RNAi功能 核酸、核酸適體（aptamer)、核酶、反義核酸、U1適配蛋白（Uladaptor)。
[0193]本方式中的"突變型 mt-tRNA" 意為選自 mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及 mt-tRNA PM中的野生型mt-tRNA的突變型，保持了與TDP-43的結(jié)合活性但由于突變喪失了 本來(lái)的功能的mt_tRNA(loss of function mt-tRNA)。上述突變包含從上述野生型mt-tRNA 中缺失、取代和/或添加一個(gè)或者數(shù)個(gè)核苷酸。
[0194] 本方式中的"結(jié)合區(qū)域核酸片段"意為上述測(cè)定物質(zhì)的mt-tRNA中堿基序列的一 部分，且包含與TDP-43直接結(jié)合的活性區(qū)域的mt-tRNA的部分片段。也包含上述突變型 mt-tRNA的部分片段。作為與上述TDP-43直接結(jié)合的mt-tRNA的部分片段，能夠列舉例如 與 TDP-43 的 RRM1 結(jié)合的 4 種 mt-tRNA (mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及 mt-tRNA Pr。） 的共通區(qū)域。具體而言，是D莖&環(huán)內(nèi)的GUU以及T莖&環(huán)內(nèi)的UGG的共有序列。所以， 由于含有GTT或GUU以及/或者TGG或UGG組成的堿基序列的mt-tRNA的部分片段或者該 DNA片段可以在TDP-43與RRM1的結(jié)合中與上述4種mt-tRNA發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，所以可能成為藥劑 候補(bǔ)物質(zhì)。這樣的mt-tRNA的部分片段的堿基長(zhǎng)度為5?50個(gè)堿基、優(yōu)選為5?30個(gè)堿 基即可。
[0195] 本方式中的"RNAi功能核酸"意為能夠在生體內(nèi)誘導(dǎo)RNA干擾（RNAi :RNA inteference)，通過(guò)分解目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從而抑制基因的表達(dá)（沉默）的物質(zhì)。能夠 列舉例如 siRNA(small interfering RNA)、shRNA(short hairpin RNA)或者 miRNA(micro RNA)。需要說(shuō)明的是，關(guān)于RNAi，希望參照例如Bass B. L.，2000, Cell, 101，235-238 ; Sharp P. A. , 2001, Genes Dev. , 15, 485-490 ；Zamore P.D.,2002, Science, 296, 1265-1269 ； Dernburg, A. F. &Karpen G.H., 2002, Cell, 111, 159-162)。本方式中，作為編碼可能成為 RNAi功能核酸的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的基因，能夠列舉例如mt-tRNAAsn、mt-tRNA Gln、mt-tRNAGlu、 mt-tRNAPM、Aralarl、Aralar2、GDH以及Musashi 2的各個(gè)基因。對(duì)于這些目標(biāo)RNAi功能核 酸的設(shè)計(jì)使用該領(lǐng)域公知的技術(shù)進(jìn)行即可。列舉一個(gè)具體例子，若在設(shè)計(jì)siRNA的情況下， 例如，首先，從Aralarl基因的堿基序列中選擇與該Aralarl基因具有特異性的、堿基個(gè)數(shù) 為15個(gè)堿基以上35個(gè)堿基以下、優(yōu)選15個(gè)堿基以上30個(gè)個(gè)堿基以下、更優(yōu)選18個(gè)堿基 以上25個(gè)堿基以下的連續(xù)的堿基序列區(qū)域作為siRNA的正義鏈的堿基序列。接下來(lái)，反義 鏈的堿基序列是與所選擇的上述RNA正義鏈的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。另外，制備siRNA 時(shí)，將正義鏈、反義鏈的選擇區(qū)域內(nèi)的T(胸腺嘧啶）堿基都變換成U(尿嘧啶）堿基。而 且，選擇的RNA正義鏈區(qū)域內(nèi)的GC (鳥(niǎo)嘌呤-胞嘧啶）的含量?jī)?yōu)選20?80%，更優(yōu)選30? 70%，進(jìn)一步優(yōu)選40?60%。需要說(shuō)明的是，優(yōu)選在選擇的區(qū)域的RNA正義鏈以及RNA反 義鏈的3'末端側(cè)附加TT (胸腺嘧啶-胸腺嘧啶）或者UU (尿嘧啶-尿嘧啶），其中優(yōu)選附 加IT。
[0196] 本方式中的"核酸適體"意為具有能夠通過(guò)自身的立體結(jié)構(gòu)與目標(biāo)物質(zhì)（在此為 測(cè)定物質(zhì)或者TDP-43)進(jìn)行特異性結(jié)合的能力的配位核酸。核酸適體根據(jù)其種類已知有 DNA適體、RNA適體以及其混合適體，本方式中可以是任何的適體。關(guān)于適體，希望參照例如 Janasena，Clin. Chem.，1999, 45:1628-1650。
[0197] 本方式中的"核酶"意為又稱為核糖酶的具有催化活性的RNA分子。與既是底物 又是目標(biāo)物質(zhì)（測(cè)定物質(zhì)）的本方式的上述（i)所示4種mt-tRNA分子中任意分子特異性 結(jié)合，具有催化將該目標(biāo)RNA分子切斷或者連結(jié)、氧化或還原等化學(xué)反應(yīng)的功能。
[0198] 本方式中的"反義核酸"意為，在測(cè)定物質(zhì)是蛋白質(zhì)的情況下，以該蛋白質(zhì)基因的 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為目標(biāo)的反義核酸。此處所說(shuō)核酸不僅是DNA或者RNA，還含有例如PNA或LNA等 核酸類似物。
[0199] 本方式中的"U1適配蛋白"意為由大約25個(gè)堿基組成的二功能性的寡核苷酸， 含有與目標(biāo)基因的mRNA前體中的3'末端外顯子互補(bǔ)的5'側(cè)的"目標(biāo)結(jié)構(gòu)域"和具有與 UlsnRNA 的 5' 區(qū)域互補(bǔ)的序列的 3' 側(cè)的 "U1 結(jié)構(gòu)域"（Goraczniak R.，et al.，2009, Nat Biotechnol.，Vol 27，p257-263)。將U1適配蛋白導(dǎo)入后，含有UlsnRNA的U1核內(nèi)低分子 核糖核蛋白（UlsnRNP)與目標(biāo)基因的mRNA前體的多聚腺苷酸信號(hào)（poly (A) signal)周邊 結(jié)合，特異性阻礙該mRNA的聚腺苷酸化。其結(jié)果是使目標(biāo)基因的mRNA前體不穩(wěn)定化，之后， 通過(guò)在核內(nèi)被分解而產(chǎn)生基因的沉默。所以，將選自Aralarl、Aralar2、⑶H以及Musashi2 中的至少一種以上的該蛋白質(zhì)的基因作為目標(biāo)設(shè)計(jì)U1適配蛋白即可。
[0200] (A-2)肽
[0201] 在作為藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的肽中，有突變型蛋白質(zhì)、結(jié)合區(qū)域的肽片段、抗體、肽適體、 酶等。肽可以是寡肽或多肽的任意種肽。肽的大小只要可能作為T(mén)DP-43結(jié)合抑制劑發(fā)揮 功能，則不特別限定。通常是20個(gè)氨基酸以下，優(yōu)選15個(gè)氨基酸以下，更優(yōu)選10個(gè)氨基酸 以下。另外，肽可以被修飾。肽的修飾包括功能上的修飾或者標(biāo)記上的修飾。功能上的修 飾能夠列舉例如糖基化、乙?；?、甲?；Ⅴ０坊?、磷酸化、甲基化、環(huán)化或者PEG化。標(biāo)記上 的修飾能夠列舉使用熒光色素（熒光素、FITC、羅丹明、德克薩斯紅、Cy3、Cy5)、熒光蛋白質(zhì) (例如PE、APC、GFP)、酶（例如辣根過(guò)氧化酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶）、放射性同位素 (例如 3H、14C、35S)或者生物素或（鏈霉菌）抗生物素蛋白進(jìn)行的標(biāo)記。
[0202] 本方式中的"突變型蛋白質(zhì)"意為選自Aralarl、Aralar2、⑶H、Musashi 2以 及TDP-43的野生型蛋白質(zhì)的突變型，對(duì)于Aralarl、Aralar2、⑶H或者M(jìn)usashi 2而言， 是指保持了與TDP-43的結(jié)合活性，另外，對(duì)于TDP-43而言，是指保持了與選自Aralarl、 Aralar2、⑶H，Musashi 2中的一種蛋白質(zhì)、或者與選自 mt-tRNAPM中的mt-tRNA的結(jié)合活性，但由于突變而喪失本來(lái)的功能的蛋白質(zhì)（失去功能型 蛋白質(zhì)），或者由于突變而使本來(lái)的功能亢進(jìn)或者獲得新功能的蛋白質(zhì)（獲得功能型蛋白 質(zhì)）。上述突變包含上述野生型蛋白質(zhì)中的一個(gè)或者數(shù)個(gè)的氨基酸的缺失、取代和/或添 加。
[0203] 本方式中的"結(jié)合區(qū)域肽片段"意為IDP-43或者本方式的上述（ii)所示的測(cè)定 物質(zhì)的蛋白質(zhì)中的氨基酸序列的一部分，含有與TDP-43或者本方式的上述（ii)所示的測(cè) 定物質(zhì)的蛋白質(zhì)直接結(jié)合的活性區(qū)域的該蛋白質(zhì)的部分片段。上述突變型蛋白質(zhì)的部分片 段也被包含其中。例如，在結(jié)合區(qū)域肽片段是TDP-43的結(jié)合區(qū)域肽片段的情況下，為以下 的（a)?⑷所述的肽。
[0204] (a)含有由序列號(hào)2、4或5所示的氨基酸序列組成的多肽的100個(gè)氨基酸以下、優(yōu) 選80個(gè)氨基酸以下的多肽，
[0205] (b)含有在序列號(hào)2、4或5所示的氨基酸序列中包含1?3個(gè)氨基酸的添加、缺失 或取代的多肽的130個(gè)氨基酸以下、優(yōu)選100個(gè)氨基酸以下、更優(yōu)選80個(gè)氨基酸以下的多 肽，
[0206] (c)由與序列號(hào)2、4或5所示的氨基酸序列具有90%以上的同一性的、優(yōu)選95% 以上的同一性的、更優(yōu)選97%以上的同一性的氨基酸序列，
[0207] (d)由序列號(hào)2、4或5所示的氨基酸序列組成的多肽的一部分。
[0208] 這里，序列號(hào)2是在序列號(hào)1所示的人TDP-43中，相當(dāng)于位于105位?169位的位 置的RRM1結(jié)構(gòu)域。另外，序列號(hào)4是在序列號(hào)1所示的人TDP-43中，相當(dāng)于位于274位? 314位的位置的GR結(jié)構(gòu)域。而序列號(hào)5是在序列號(hào)1所示的人TDP-43中，相當(dāng)于位于315 位?414位的位置的315結(jié)構(gòu)域。此外，序列號(hào)3是在序列號(hào)1所示的人IDP-43中，相當(dāng) 于位于193位?257位的位置的RRM2(RNA Recognition Motif-2)結(jié)構(gòu)域。
[0209] 由本發(fā)明的發(fā)明人的研宄結(jié)果已明確，TDP-43的RRM1是與上述測(cè)定物質(zhì) mt-tRNA Asn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及 mt-tRNA Pl:°結(jié)合的區(qū)域，GR 結(jié)構(gòu)域和 315 結(jié)構(gòu)域是 與Aralarl以及Aralar2結(jié)合的區(qū)域。所以，含有TDP-43的RRM1結(jié)構(gòu)域的肽的片段或者 與該片段的氨基酸序列具有90%以上、優(yōu)選95%以上、更優(yōu)選98%以上的同一性的肽能夠 在與上述4種mt-tRNA的結(jié)合時(shí)與IDP-43發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，因此可能成為藥劑候補(bǔ)物質(zhì)。這樣的 肽片段具有5?60個(gè)氨基酸，優(yōu)選具有9?20個(gè)氨基酸即可。
[0210] 本方式中的"抗體"是作為中和抗體發(fā)揮功能的物質(zhì)，包含例如單克隆抗體、多克 隆抗體、重組抗體、抗體片段。
[0211] 抗體是多克隆抗體或者單克隆抗體的情況下，免疫球蛋白分子可以是任意的類別 (例如，IgG、IgE、IgM、IgA、IgD 以及 IgY)或者任意的亞類（例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgAl、IgA2)〇
[0212] "重組抗體"意為嵌和抗體、人源化抗體、合成抗體或者多重特異性抗體。
[0213] "嵌和抗體"意為將來(lái)自不同動(dòng)物的抗體的氨基酸序列組合制作的抗體，將某抗體 的恒定區(qū)（C區(qū)）用其他的抗體的C區(qū)取代的抗體。例如，將小鼠單克隆抗體的C區(qū)使用人 抗體的C區(qū)域取代的抗體。由此能夠減輕人體內(nèi)對(duì)于該抗體的免疫反應(yīng)。
[0214] "人源化抗體"意為將人以外的哺乳動(dòng)物，例如，小鼠抗體的V區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū) (CDR)用人抗體的CDR取代的嵌合基因。
[0215]"合成抗體"意為使用化學(xué)方法或者DNA重組法合成的抗體。能夠列舉例如使 用DNA重組法新合成的抗體。具體而言，能夠列舉例如單鏈抗體（scFv:single chain Fragment of variable region)，雙鏈抗體（diabody)，三鏈抗體（triabody)或者四鏈抗體 (tetrabody)等。
[0216]"多重特異性抗體"意為多價(jià)抗體，即在一分子內(nèi)具有多個(gè)抗原結(jié)合部位，各個(gè)抗 原結(jié)合部位與不同的表位結(jié)合的抗體。能夠列舉例如在IgG這樣的具有兩個(gè)抗原結(jié)合部位 的抗體中，各個(gè)抗原結(jié)合部位與不同的表位結(jié)合的二重特異性抗體（Bispecific抗體）。
[0217]"抗體片段"意為例如Fab、F(ab'）2、Fv等。
[0218] 上述抗體都可以使用該領(lǐng)域公知的方法制造。
[0219] 本方式中的"肽適體"意為與上述核酸適體同樣具有通過(guò)自身的立體構(gòu)造與目標(biāo) 物質(zhì)（在此為測(cè)定物質(zhì)或者TDP-43)特異性結(jié)合的能力的肽。
[0220] 本方式中的"酶"是RNA酶以及蛋白酶，RNA酶優(yōu)選能夠分別特異性識(shí)別 mt-tRNA Asn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNA PI°并將其分解的RNA酶，蛋白酶優(yōu)選能夠分 別特異性識(shí)別Aralarl、Aralar2、⑶H以及Musashi 2并將其分解的蛋白酶。
[0221] (A-3)低分子化合物
[0222] 本說(shuō)明書(shū)中的"低分子化合物"意為分子量5000以下、優(yōu)選2000以下、更優(yōu)選1000 以下的化合物，為上述核酸以及肽以外的物質(zhì)。能夠列舉例如激素（例如類固醇激素）、神 經(jīng)遞質(zhì)（例如腎上腺素（adrenaline)、腎上腺素（epinephrine)、去甲腎上腺素、多巴胺）、 組蛋白去乙?；敢种苿┮约懊庖咭种苿┑雀鞣N醫(yī)藥化合物。另外，也包含與特定的低分 子化合物具有同等藥理活性的低分子化合物的衍生物或其鹽。
[0223] ⑶藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的具體例
[0224] 藥劑候補(bǔ)物質(zhì)中，例如，能夠列舉競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)或者間接的結(jié)合抑制物質(zhì)。
[0225] (B-1)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)
[0226] 本方式中的"競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)"意為，通過(guò)與IDP-43結(jié)合時(shí)和測(cè)定物質(zhì)形成競(jìng)爭(zhēng)，或者通 過(guò)與測(cè)定物質(zhì)結(jié)合時(shí)和TDP-43形成競(jìng)爭(zhēng)，從而阻礙測(cè)定物質(zhì)與IDP-43結(jié)合的物質(zhì)。本方 式中，作為該競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)，例如包含在TDP-43將mt-tRNA等測(cè)定物質(zhì)吸收、凝集化，從而使其 在細(xì)胞內(nèi)的本來(lái)應(yīng)發(fā)揮功能的場(chǎng)所相隔離的的場(chǎng)所沉積的情況下等時(shí)，可以將該凝集解離 的物質(zhì)。
[0227] 作為與測(cè)定物質(zhì)形成競(jìng)爭(zhēng)的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)，能夠優(yōu)選使用突變型mt-tRNA、結(jié)合區(qū)域 核酸片段、核酸適體、突變型蛋白質(zhì)、結(jié)合區(qū)域肽片段或者低分子化合物作為藥劑候補(bǔ)物 質(zhì)。另外，作為與TDP-43形成競(jìng)爭(zhēng)的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)，能夠優(yōu)選使用突變型蛋白質(zhì)、結(jié)合區(qū)域肽片 段、或者低分子化合物。另外，如上所述，能夠優(yōu)選利用含有與TDP-43的RRM1結(jié)合的4種 mt-tRNA的共通區(qū)域，具體而言，含有D莖&環(huán)內(nèi)的GUU以及T莖&環(huán)內(nèi)的UGG的共有序列 或者含有其中一部分的核酸分子、或者含有與4種mt-tRNA結(jié)合的TDP-43上的RRM1的肽、 或者含有與Aralarl以及Aralar2結(jié)合的GR結(jié)構(gòu)域和315結(jié)構(gòu)域的肽。
[0228] (B-2)間接的結(jié)合抑制物質(zhì)
[0229] 本方式中的"間接的結(jié)合抑制物質(zhì)"意為，通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)的測(cè)定物質(zhì)的絕對(duì)存在 量或者活化測(cè)定物質(zhì)的存在量，從而二次抑制測(cè)定物質(zhì)與TDP-43結(jié)合的物質(zhì)。
[0230] 作為降低細(xì)胞內(nèi)的測(cè)定物質(zhì)的絕對(duì)存在量的間接的結(jié)合抑制物質(zhì)，能夠優(yōu)選使用 RNAi功能核酸、核酶、反義核酸、U1適配蛋白、酶或者低分子化合物。另外，作為降低細(xì)胞內(nèi) 的活化測(cè)定物質(zhì)的存在量的間接的結(jié)合抑制物質(zhì)，能夠優(yōu)選使用突變型mt-tRNA、結(jié)合區(qū)域 核酸片段、核酸適體、突變型蛋白質(zhì)、結(jié)合區(qū)域肽片段、抗體或者肽適體。
[0231] (C)方法
[0232] 混合工序可以采用使用培養(yǎng)細(xì)胞等體內(nèi)（invivo)或者體外（invitro)的任意 方式進(jìn)行。
[0233] 在體內(nèi)進(jìn)行本工序的情況下，本方式中使用的"細(xì)胞"是來(lái)自動(dòng)物、優(yōu)選來(lái)自脊椎 動(dòng)物、更優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物、進(jìn)一步優(yōu)選來(lái)自人的細(xì)胞，特別是來(lái)自作為治療對(duì)象的患有 TDP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的患者的細(xì)胞。細(xì)胞宜是培養(yǎng)細(xì)胞。更優(yōu)選TDP-43過(guò)量表 達(dá)的培養(yǎng)細(xì)胞（包含iPS細(xì)胞）?？梢允窃囵B(yǎng)細(xì)胞，繼代培養(yǎng)細(xì)胞，或者株化細(xì)胞中任 意種類。
[0234] 導(dǎo)入細(xì)胞的藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的分量以及將藥劑候補(bǔ)物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法按照上 述第2方式進(jìn)行即可。
[0235] TDP-43或測(cè)定物質(zhì)可以使用內(nèi)源性的，也可以將外來(lái)的TDP-43或測(cè)定物質(zhì)同時(shí) 或者分別地導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)作為藥劑候補(bǔ)物質(zhì)。TDP-43以及測(cè)定物質(zhì)可以將該物質(zhì)直接導(dǎo)入細(xì) 胞，也可以向細(xì)胞導(dǎo)入編碼該物質(zhì)的核酸，使其在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。導(dǎo)入后的細(xì)胞在適當(dāng) 的時(shí)間、適當(dāng)?shù)臏囟纫约癌?2濃度的條件下培養(yǎng)數(shù)日。細(xì)胞的培養(yǎng)方法可以使用該領(lǐng)域公 知的方法。
[0236] 需要說(shuō)明的是，在體內(nèi)進(jìn)行本工序的情況下，需要在檢測(cè)工序前將導(dǎo)入了藥劑候 補(bǔ)物質(zhì)等的細(xì)胞溶解，制備含有上述TDP-43與上述mt-tRNA和/或蛋白質(zhì)結(jié)合而形成的復(fù) 合物的細(xì)胞提取液。細(xì)胞提取液的制備方法是通過(guò)使用溶解緩沖劑等公知的細(xì)胞提取液的 制備方法即可。
[0237] 在體外進(jìn)行本工序情況下，將TDP-43、測(cè)定物質(zhì)、藥劑候補(bǔ)物質(zhì)分別基于該領(lǐng)域 公知的、能夠發(fā)生蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或者蛋白質(zhì)-核酸相互作用的方法混合即可。 參照例如 Sambrook，J.et.al.，（2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual Third Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 所述的方法 即可。另外，也可以將TDP-43、測(cè)定物質(zhì)、藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的任意物質(zhì)固定在固體載體上。由 此，使下面的檢測(cè)工序中的復(fù)合物的檢測(cè)變得容易，因此是便利的。作為固體載體，能夠使 用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龍、聚丙烯酸甲酯、 乳膠、明膠、瓊脂糖（agarose)、纖維素、瓊脂糖（sepharose)、玻璃、金屬、陶瓷或者磁性體 等的材質(zhì)構(gòu)成的珠、微孔板、試管、棒或者試驗(yàn)片等形狀的不溶性載體。固定化是在固體載 體上將TDP-43、測(cè)定物質(zhì)、藥劑候補(bǔ)物質(zhì)中的任意物質(zhì)通過(guò)物理吸附法、化學(xué)結(jié)合法或者這 些方法的并用等公知的方法直接結(jié)合，或者，也有將抗TDP-43抗體等抗體事先固定在固體 載體上，將作為抗原的IDP-43通過(guò)抗原抗體反應(yīng)間接地與固體載體結(jié)合的方法。
[0238] ⑵檢測(cè)工序
[0239] 本方式中的"檢測(cè)工序"意為檢測(cè)上述TDP-43與上述mt-tRNA和/或蛋白質(zhì)的結(jié) 合的工序。本工序中，在檢測(cè)上述結(jié)合的情況下，宜將該結(jié)合量定量。
[0240] 檢測(cè)工序基本上能夠通過(guò)使用與上述第1方式所述的測(cè)定工序相同的技術(shù)達(dá)到。 在檢測(cè)TDP-43與上述mt-tRNA結(jié)合的情況下，使用檢測(cè)蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物的該領(lǐng)域公知 的方法即可。例如，通過(guò)使用抗TDP-43抗體的免疫沉降法，回收含有復(fù)合物的TDP-43后， 從復(fù)合物中將TDP-43通過(guò)苯酚等變性劑或者蛋白酶去除，對(duì)殘存核酸分子使用能夠特異 性檢測(cè)目標(biāo)mt-tRNA的核酸探針，通過(guò)RNA印跡法檢測(cè)，或者通過(guò)定量RT-PCR法檢測(cè)即可。 另外，在檢測(cè)TDP-43與上述蛋白質(zhì)的結(jié)合的情況下，使用檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物 的該領(lǐng)域公知的方法即可。例如，通過(guò)使用抗TDP-43抗體的免疫共沉淀法，回收含有復(fù)合 物的TDP-43后，使用對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)特異性的抗體，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)即可。列舉具體 例說(shuō)明，例如，制備來(lái)自細(xì)胞的總RNA、mt-tRNA Asn或者mt-tRNA &，將其與使用大腸桿菌等合 成并提純的標(biāo)簽融合IDP-43在體外（in vitro)混合，將與標(biāo)簽（例如，DAP標(biāo)簽、FLAG標(biāo) 簽、組氨酸標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、GFP標(biāo)簽，以下相同）對(duì)應(yīng)的抗體或者結(jié)合物質(zhì)通過(guò)固體載體回 收后，將與標(biāo)簽融合TDP-43結(jié)合的mt-tRNA Asn以及mt-tRNA Gln通過(guò)尿素變性丙烯酰胺凝膠 分離，使用SYBR金等染色來(lái)檢測(cè)、定量。在需要用高靈敏度的測(cè)定法的情況下，使用RNA印 跡法檢測(cè)、定量。另外，在使用提純的mt-tRNA Asn或者mt-tRNAuq^情況下，將其以熒光試劑 或其他顯色試劑、酶或者生物素等標(biāo)記，能夠通過(guò)熒光或者顯色強(qiáng)度等定量與固定化標(biāo)簽 融合TDP-43結(jié)合的這些分子。相反，將提純的mt-tRNA Asn或者mt-tRNA Gln固定化，能夠通 過(guò)測(cè)定熒光或者顯色強(qiáng)度定量其與融合了熒光試劑或其他顯色試劑或者酶的TDP-43的結(jié) 合。這種情況下，作為替代mt-tRNA Asn、mt-tRNAGln或者TDP-43的全部長(zhǎng)度的分子，可以使 用各分子的含有結(jié)合序列的RNA片段或者肽片段。作為更具體的檢測(cè)相互作用的一例，能 夠列舉通過(guò)大腸桿菌合成trigger factor (TG)-GST融合TDP-43,使用谷胱甘肽固定化載 體進(jìn)行親和層析法提純后，將其與從細(xì)胞提取的總RNA混合，通過(guò)RNA印跡法檢測(cè)的方法。
[0241] 之后，制備表達(dá)標(biāo)簽融合TDP-43的細(xì)胞株，將表達(dá)的標(biāo)簽融合TDP-43通過(guò)固定有 與標(biāo)簽相對(duì)的抗體（例如抗FLAG抗體等）或者結(jié)合物質(zhì)（例如，鏈霉親和素、親和素等） 的固體載體回收，將與標(biāo)簽融合IDP-43結(jié)合的mt-tRNA Asn和/或mt-tRNA Gln提取后，經(jīng)尿 素變性丙烯酰胺凝膠分離后的SYBR金染色或者通過(guò)RNA印跡法檢測(cè)，從而能夠定量。通過(guò) 在回收標(biāo)簽融合TDP-43時(shí)，使肽、核酸、化合物共存，能夠檢測(cè)、定量細(xì)胞中的與標(biāo)簽融合 TDP-43結(jié)合的mt-tRNA Asn和/或mt-tRNA Gln的量的變化。
[0242] 或者，將TDP-43預(yù)先固定在固體載體上，使測(cè)定物質(zhì)流過(guò)，事先形成TDP-43與測(cè) 定物質(zhì)的復(fù)合物，再將含有藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的溶液流過(guò)，使測(cè)定物質(zhì)與藥劑候補(bǔ)物質(zhì)之間發(fā) 生競(jìng)爭(zhēng)，通過(guò)表面等離子體共振或ELISA法算出解離的復(fù)合物的量，由此也能夠?qū)⒔Y(jié)合量 定量。
[0243] (3)選擇工序
[0244] 本方式中的"選擇工序"意為，與第2方式中的"選擇工序"不同，是在檢測(cè)工序中 TDP-43與作為測(cè)定物質(zhì)的mt-tRNA和/或蛋白質(zhì)的結(jié)合沒(méi)有被檢測(cè)的情況下，或者被檢測(cè) 的結(jié)合量和沒(méi)有藥劑候補(bǔ)物質(zhì)存在下的TARDNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43與mt-tRNA和/或蛋白質(zhì) 的結(jié)合量相比較，兩者的值之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異的情況下，將該藥劑候補(bǔ)物質(zhì)選擇 作為T(mén)ARDNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43結(jié)合抑制劑的工序。
[0245] 上述檢測(cè)工序中的"TDP-43與作為測(cè)定物質(zhì)的mt-tRNA和/或蛋白質(zhì)的結(jié)合沒(méi) 有被檢測(cè)的情況"意為，藥劑候補(bǔ)物質(zhì)完全地抑制了TDP-43與作為測(cè)定物質(zhì)的mt-tRNA和 /或蛋白質(zhì)的結(jié)合的情況。該情況下，該藥劑候補(bǔ)物質(zhì)由于可能成為強(qiáng)力的TDP-43結(jié)合抑 制劑，所以選擇作為目的的TDP-43結(jié)合抑制劑。但是，這樣的TDP-43結(jié)合抑制劑由于具 有同時(shí)也抑制個(gè)體的生存所必須的TDP-43與測(cè)定物質(zhì)的相互作用的可能性，所以具有對(duì) 于細(xì)胞，乃至對(duì)于個(gè)體發(fā)生嚴(yán)重副作用的可能。因此，在使用時(shí)，應(yīng)是一過(guò)性效果的藥劑，且 有必要將劑量預(yù)先優(yōu)化至僅享受有效藥效的分量。但是，特異地完全抑制功能獲得型突變 TDP-43與測(cè)定物質(zhì)結(jié)合的藥劑候補(bǔ)物質(zhì)是作為T(mén)DP-43結(jié)合抑制劑的最優(yōu)選物質(zhì)。
[0246] 另外，上述檢測(cè)工序中的"被檢測(cè)的結(jié)合量和沒(méi)有藥劑候補(bǔ)物質(zhì)存在下的所對(duì)應(yīng) 的mt-tRNA和/或蛋白質(zhì)與TDP-43的結(jié)合量相比較，在兩者的值之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差 異的情況"意為，使用相同的TDP-43和測(cè)定物質(zhì)，僅在有無(wú)添加藥劑候補(bǔ)物質(zhì)這一條件不同 的情況下，將各自的TDP-43與測(cè)定物質(zhì)的結(jié)合量相比較時(shí)，若在兩者的值之間具有統(tǒng)計(jì)上 顯著差異，這意味著藥劑候補(bǔ)物質(zhì)部分地抑制了TDP-43與測(cè)定物質(zhì)的結(jié)合。這樣的部分地 進(jìn)行抑制的藥劑候補(bǔ)物質(zhì)，由于是作為T(mén)DP-43結(jié)合抑制劑的優(yōu)選物質(zhì)，所以選擇作為目的 的TDP-43結(jié)合抑制劑。
[0247] 需要說(shuō)明的是，在沒(méi)有藥劑候補(bǔ)物質(zhì)存在下的mt-tRNA和/或蛋白質(zhì)與TDP-43的 結(jié)合是除了藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的有無(wú)以外，全部以在有藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的存在下的mt-tRNA和/ 或蛋白質(zhì)與TDP-43的結(jié)合檢測(cè)的相同方法以及相同條件下進(jìn)行。所以，在上述檢測(cè)工序 中，也可以和在藥劑候補(bǔ)物質(zhì)存在下的mt-tRNA和/或蛋白質(zhì)與TDP-43的結(jié)合檢測(cè)同時(shí)進(jìn) 行。另外，也可以將在沒(méi)有藥劑候補(bǔ)物質(zhì)存在下的mt-tRNA和/或蛋白質(zhì)與TDP-43的結(jié)合 量預(yù)先定量后形成數(shù)據(jù)庫(kù)，在與其相同方法以及相同條件下，僅定量新添加了藥劑候補(bǔ)物 質(zhì)時(shí)的結(jié)合量。
[0248] 通過(guò)本方式的制造方法獲得的TDP-43結(jié)合抑制劑能夠成為T(mén)DP-43細(xì)胞內(nèi)存在量 關(guān)聯(lián)疾患的治療劑的有效成分。
[0249] 需要說(shuō)明的是，對(duì)于上述第2方式的降低測(cè)定物質(zhì)的存在量的藥劑或者本方式的 TDP-43結(jié)合抑制劑所獲得的對(duì)于TDP-43的過(guò)量表達(dá)產(chǎn)生的細(xì)胞毒性的抑制效果而言，確 認(rèn)經(jīng)這些藥劑處理的細(xì)胞增殖率的變化即可。和藥劑未處理的細(xì)胞相比較，細(xì)胞增殖率在 統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著增加的情況下，能夠判斷該藥劑具有對(duì)于細(xì)胞毒性的抑制效果。需要說(shuō)明 的是，細(xì)胞增殖率能夠使用在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)而算出或測(cè)定溴尿核苷量等該領(lǐng)域 公知的各種方法。另外，也可以測(cè)定ATP量或者活性氧量替代細(xì)胞增殖率。該情況下，以由 于TDP-43表達(dá)水平的增加而增加的細(xì)胞內(nèi)的ATP量或者活性氧量作為指標(biāo)，經(jīng)藥劑處理 的細(xì)胞內(nèi)的ATP量或者活性氧量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有明顯地減少的情況時(shí)，能夠判斷該藥劑具有 對(duì)于細(xì)胞毒性的抑制效果。而且，在通過(guò)上述藥劑處理能夠減少細(xì)胞內(nèi)的mt-tRNAAsn以及 mt-tRNAan量的增加的情況下，能夠判斷該藥劑具有細(xì)胞毒性的抑制效果。
[0250] 4. TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43結(jié)合抑制劑
[0251] 4-1?概要
[0252] 本發(fā)明的第4的方式是TDP-43結(jié)合抑制劑。本發(fā)明的TDP-43結(jié)合抑制劑能夠成 為T(mén)DP-43細(xì)胞內(nèi)存在量關(guān)聯(lián)疾患的治療劑的有效成分。
[0253] 4-2.組成
[0254] 本方式的TDP-43結(jié)合抑制劑含有抑制TDP-43與4種mt-tRNA(mt-tRNAAsn、 mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPI°)結(jié)合的核酸分子的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)。
[0255] 本說(shuō)明書(shū)中的"核酸分子"原則上是指以核苷酸作為構(gòu)成單位，通過(guò)磷酸二酯鍵連 結(jié)的生物高分子。所以，通常情況下是例如將含有腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶以及胸腺嘧啶中 的任意堿基的脫氧核糖核苷酸相連結(jié)的DNA和/或?qū)⒑邢汆堰?、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶以及尿嘧 啶中的任意堿基的核糖核苷酸連結(jié)的RNA這樣的將自然界存在的天然核苷酸連結(jié)而成的 天然型核酸。另外，本發(fā)明的核酸分子也能夠包含非天然型核苷酸或者非天然型核酸。
[0256] 本說(shuō)明書(shū)中的"非天然型核苷酸"意為在自然界不存在的核苷酸。例如，人工構(gòu)建 或者被化學(xué)修飾的、具有與上述天然型核苷酸類似的性質(zhì)和/或構(gòu)造的核苷。
[0257] 本說(shuō)明書(shū)中的"非天然型核酸"意為具有與天然型核酸類似的構(gòu)造和/或性質(zhì)的 人工構(gòu)建的核酸類似物。能夠列舉例如肽核酸（PNA:Peptide Nucleic Acid)、具有磷酸 醋基的肽核酸（PHONA)、交聯(lián)化核酸（BNA/LNA:Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid)、嗎啉基核酸等。能夠列舉甲基磷酸酯型DNA/RNA、硫代磷酸型DNA/RNA、氨基磷酸酯 型DNA/RNA、2' -0-甲基型DNA/RNA等化學(xué)修飾核酸或核酸類似物。
[0258]抑制 TDP-43 與 4 種 mt-tRNA (mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及 mt-tRNA Pr。） 結(jié)合的核酸分子含有與TDP-43的結(jié)合區(qū)域相當(dāng)?shù)纳鲜?種的共有序列的一部分。具體而 言，是含有TG或UG以及/或者GT或GU組成的堿基序列，例如，是TGG或UGG以及/或者 GTT或GUU組成的堿基序列。本發(fā)明的核酸分子含有兩個(gè)以上的這樣的堿基序列。優(yōu)選含 有三個(gè)以上，更優(yōu)選含有五個(gè)以上，更加優(yōu)選六個(gè)以上、七個(gè)以上、八個(gè)以上、九個(gè)以上、十 個(gè)以上。在一個(gè)核酸分子內(nèi)可以含有相同的上述堿基序列（例如，僅含有TG、僅含有GT)，也 可以含有上述堿基序列的組合（例如，TG和GT)。各自的堿基序列可以是不連續(xù)的，也可以 連續(xù)的重復(fù)序列。在重復(fù)序列的情況下，重復(fù)次數(shù)是例如3?20次，優(yōu)選4?18次，更優(yōu) 選5?15次。核酸分子的堿基長(zhǎng)度是5?50個(gè)堿基，優(yōu)選10?40個(gè)堿基，更優(yōu)選15? 30個(gè)堿基。作為上述核酸分子的具體例，能夠列舉相當(dāng)于T莖&環(huán)所含的共有序列UUG的 一部分的UG的12次重復(fù)序列的、序列號(hào)43所示DNA寡核苷酸（TG)12,T莖&環(huán)所含的共有 序列UGG的8次重復(fù)序列組成的、序列號(hào)45所示DNA寡核苷酸（TGG) 8以及D莖&環(huán)所含 的共有序列TTG的7次重復(fù)序列組成的、序列號(hào)46所示DNA寡核苷酸TT(GTT) 7G。
[0259] 實(shí)施例
[0260]〈實(shí)施例1 :與TDP-43結(jié)合的RNA的確認(rèn)〉
[0261](目的）
[0262] 確認(rèn)與TDP-43結(jié)合的RNA。
[0263](方法）
[0264] (1)帶有DAP標(biāo)簽的TDP-43表達(dá)載體的制備
[0265] DAP(doublyaffinity-purification)標(biāo)簽是將6XHis標(biāo)簽、生物素化標(biāo)簽 以及Flag標(biāo)簽從氨基末端側(cè)按照該順序串聯(lián)連結(jié)的標(biāo)簽。為了構(gòu)建帶有DAP標(biāo)簽的 Res Commun, 2006, 351:602-611)作為模板，使用 KOD-Plus DNA 聚合酶（T0Y0B0)，通過(guò) PCR制備了 Flag標(biāo)簽融合TDP-43的基因片段。引物使用序列號(hào)6以及7所示堿基序列 的寡核苷酸。將 PCR 產(chǎn)物插入 pcDNA5/FRT/T0(lifetechnologies)載體內(nèi)的 KpnI/XhoI 部位后進(jìn)行克隆。編碼6XHis和生物素化序列的cDNA是基于Hayano等（Interaction Analysis. J. Proteome Res.，2008, 7:4183-4190)的方法，以 pcDNA3. 1 (+)-bio 作為模板通 過(guò)PCR擴(kuò)增制備。引物使用序列號(hào)8以及9所示堿基序列的寡核苷酸。獲得的載體定為 DAP-TDP-43pcDNA5/FRT/T0〇
[0266] (2)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)型細(xì)胞系的構(gòu)建
[0267] 為了制備通過(guò)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)而使DAP-TDP-43表達(dá)的細(xì)胞系，使用了 Flp-In-T-REx Expression System(lifetechnologies)〇 將 Flp-In_T-REx293 細(xì)胞 (293TRex細(xì)胞）在24孔板上，使用添加了 10%的去補(bǔ)體的牛血清（Biowest LLC)、0. lmg/ mL 的鏈霉素（Wako Pure Chemicals)以及 100U/mL 的青霉素 G(Wako Pure Chemicals) 的DMEM培養(yǎng)基（Sigma-Aldrich)，在37°C、5%C02下培養(yǎng)。在大約80%的融合時(shí)，向細(xì) 胞將 0? 25 y g 的 pOG44(lifetechnologies)和 0? 25 y g 的 DAP-TDP-43pcDNA5/FRT/T0 通 過(guò)2 y L的Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后，將細(xì)胞在含有200 y g/mL的潮霉素 B(lifetechnologies)的培養(yǎng)基中，選擇TDP-43的單克隆被插入到共通的基因組部位的株 (DAP-roP-^ 表達(dá)株）。
[0268] 為了誘導(dǎo)DAP-TDP-43的表達(dá)，加入100ng/mL的強(qiáng)力霉素，培養(yǎng)24小時(shí)。
[0269] (3)細(xì)胞提取液的制備
[0270]細(xì)胞提取液的制備遵循 Izumikawa 等的（Biochem J.，2008, 413(3) : 505-516)方 法。即，將細(xì)胞使用PBS漂洗后，使用含有2mM核糖核苷-氧釩復(fù)合物、ImM PMSF、2yg/ mL抑肽酶、2 y g/mL抑肽素A以及2 y g/mL亮肽素的細(xì)胞團(tuán)5倍量的溶解用緩沖液（50mM Tris/HCl (pH7. 4)，150mM NaCl，0. 5% (w/v) Ig印alCA-630)在冰中懸浮 30 分鐘。在 20000g 下，4°C進(jìn)行30分鐘離心，將上清液作為細(xì)胞提取液回收。細(xì)胞提取液中的蛋白質(zhì)濃度通過(guò) Protein Assay (Bio-Rad)測(cè)定。
[0271] (4)免疫沉降和RNA回收
[0272] 為了使含有Flag標(biāo)簽的DAP-TDP-43免疫沉降，從2X 107個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞提取液 中制備了 6mg的蛋白質(zhì)組分，加入15 y L的ANTI-Flag-M2親和凝膠（Sigma-Aldrich)， 在4°C恒溫保存2小時(shí)。將結(jié)合了 DAP-TDP-43的上述親和凝膠使用lmL的上述溶解緩沖 液洗滌5次，使用150 y L的蛋白質(zhì)-RNA提取緩沖液（7M尿素，350mM NaCl，1 % SDS，10mM Tris-HCl(pH8. 0)，10mM EDTA，2% 2-巰基乙醇），在4°C溶出5分鐘。通過(guò)將與溶出的蛋白 質(zhì)發(fā)生免疫共沉淀的RNA在1000g下，4°C進(jìn)行5分鐘離心而從凝膠中分離，之后，進(jìn)行苯 酚-氯仿提取，分離蛋白質(zhì)和RNA。蛋白質(zhì)通過(guò)向苯酚-氯仿提取后的有機(jī)層混合3倍量的 異丙醇，在20000g下，4°C進(jìn)行10分鐘離心使之沉淀，立即使用75%乙醇洗滌一次，并使之 干燥。RNA從水層通過(guò)異丙醇沉淀回收。
[0273] (5)尿素變性PAGE
[0274] 從細(xì)胞提取液回收的RNA的分離基本上遵循Sambrook, J.等（Molecular Cloning ：A Laboratory Manual Third Ed.,2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)的方法進(jìn)行。將通過(guò)抗Flag抗體固定化珠經(jīng)拉 下法獲得的RNA溶解于甲酰胺，在65°C進(jìn)行10分鐘熱處理使之變性后，在冰上急冷。電 泳前調(diào)整1?隱使最終濃度為80%的甲酰胺、101111的￡0了4化118.0)、1/16量的10\1^(11叩 buffer (TaKaRa)后，使用含有8M尿素和0. 5 X TBE緩沖液的8 %聚丙烯酰胺凝膠將RNA分 離。電泳結(jié)束后，將凝膠使用SYBR金（lifetechnologies)染色5分鐘，切取與TDP-43特 異性結(jié)合的條帶。
[0275] (6)膠內(nèi)消化
[0276]RNA 的膠內(nèi)消化基本上遵循 Taoka 等（Anal. Chem.，2010, 82 (18) :7795-7803)的 方法進(jìn)行。將切取的凝膠片段切斷成小片，在真空下干燥。之后，使用15yL的2yg/yL 的RNase T1或者RNaseA，在37°C處理1小時(shí)。將核酸片段溶解于100 y L的不含RN酶的 水后，經(jīng)具有聚偏氟乙稀濾膜的離心過(guò)濾管（Ultrafree-MC，Millipore)過(guò)濾，從凝膠中提 取后，加入5yL的2M乙酸三乙基銨（pH7. 0)。
[0277] (7)納米 LC-MS/MS 分析
[0278]LC-MS/MS 分析基本上使用了 Natsume 等（2002, Anal. Chem.，74, 4725-4733)所公 開(kāi)的含有納米流泵的LC系統(tǒng)（LC Assist，Japan)。色譜柱使用熔融石英毛細(xì)管柱（150 ym i.d. X 375 ym o.d.)，通過(guò)激光牽引機(jī)（Sutter Instruments Co.，CA)制備，將反相衆(zhòng)料 (Develosil C30-UG-3,粒徑 3 ym，Nomura Chemical，Japan)充填 50mm 長(zhǎng)。
[0279] (A)液相色譜法（LC)條件
[0280] ?使用機(jī)器：RENCON_P(LC Assist)
[0281] ?洗脫液A :10mM三乙基胺乙酸鹽（Glen Research)
[0282] ?洗脫液B:甲醇（和光純藥）
[0283] ?色譜柱：Develosil C30-UG-3,150 ymX50mmL，粒徑 3 ym(野村化學(xué)）
[0284] ?捕集柱 Monocap for Trap，200 y mX 45 y m(GL Sciences)
[0285] ?色譜柱溫度：25°C
[0286] ?流速：100nL/min
[0287] ?時(shí)序濃度梯度（Time schedule gradient)0分鐘：10%B ?40分鐘：40%B
[0288] (B)MS條件
[0289] ?使用機(jī)器：LTQ Orb i tap XL (Thermo Scientific)
[0290] ? Mass range :500_1950Da
[0291] ?掃描模式：FT normal
[0292] ?離子化方法：ESI_negative
[0293] ?掃描速度：normal
[0294] ?解析軟件：Excalibur Qual Browser
[0295] (C)MSMS 條件
[0296] ?使用機(jī)器：同上
[0297] ? Mass range ：normal
[0298] ?掃描模式：normal
[0299] ?掃描速度：Enhanced
[0300] ?解析軟件：Excalibur Qual Browser
[0301] 將從膠內(nèi)消化得到的RNA獲得的譜圖作為查詢內(nèi)容，在包含線粒體基因組 的人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)，使用搜索引擎Ariadne進(jìn)行解析〇^〇1^，6七31.，2010,4仙1. Chem. 82(18):7795-7803 ;Nakayama，et al.，2009,Nucleic Acids Res. 37:e47)〇
[0302](結(jié)果）
[0303] 如圖1以及2所示。圖1是PAGE的結(jié)果。黑框內(nèi)的大約70個(gè)核苷酸的3個(gè)帶 (箭頭所示的帶1?3)是對(duì)于DAP-IDP-43有特異性的RNA。圖2是帶1的納米LC-MS/MS 色譜圖。在 collision-induced dissociation-MS/MS analysis 中顯不了從膠內(nèi)酶解的 RNA片段生成的一連串的產(chǎn)物離子。產(chǎn)物離子含有大量的c/y和a/w的離子和微量的派生 物（hydrated or dehydrated ions以及這些核苷酸失去堿基的離子）。
[0304] 根據(jù)Ariadne解析的結(jié)果，將各個(gè)帶鑒別為以下的結(jié)果。
[0305] 帶1:與mt-tRNAAsn基因、mt-tRNAGlnS因以及mt-tRNAAsn基因完全相同的染色體1 上的序列。
[0306]帶 2 :mt-tRNAGlu以及 mt-tRNAPr?；颉?br> [0307]帶 3:mt-tRNAPr?；颉?br> [0308]所以，可以確認(rèn)對(duì)于 TDP-43,有 4 種 mt-tRNA (mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu& 及 mt-tRNAPl:°)結(jié)合。
[0309]〈實(shí)施例2 :通過(guò)RNA印跡法確認(rèn)與TDP-43結(jié)合的mt-tRNA>
[0310](目的）
[0311] 將實(shí)施例1的結(jié)果通過(guò)RNA印跡法進(jìn)行確認(rèn)。
[0312](方法）
[0313] 將在實(shí)施例1的"（4)免疫沉降和回收"中獲得的RNA通過(guò)含有8M尿素和 0. 5XTBE緩沖液的8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，使用Trans-blot SD Cell (Bio-Rad)， 在5V、60分鐘的條件下轉(zhuǎn)錄至尼龍膜（Hybond-N+ :Bi〇-Rad)。將RNA與膜通過(guò)UV交聯(lián) 后，使用生物素化探針在預(yù)雜交液（0.6M NaCl，120mM Tris-HCl(pH8.0)，4.8mM EDTA， 0.1% SDS，lXDenhardt's Solution)中在42°C下雜交一晚。將膜使用洗滌溶液（90mM Tris-HCl (pH8. 0)，0. 45M NaCl，3. 6mM EDTA，0. 1 % SDS)在 25°C 進(jìn)行三次 30 分鐘的洗滌，使 用Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module kit(Thermo Fisher Scientific) 并遵循附帶的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)RNA。用于檢測(cè)的各個(gè)寡核苷酸探針具有對(duì)各mt-tRNA等的特 異性的堿基序列互補(bǔ)的以下序列。即、mt-tRNA Asn探針具有與mt-tRNAAsn基因的堿基序列 的7?34位互補(bǔ)的序列（序列號(hào)10)、mt-tRNA Gln探針具有與mt-tRNA ^基因的堿基序列 36?65位的序列（序列號(hào)11)、mt-tRNAPl:°探針具有mt-tRNA PM基因的堿基序列28?57 位的序列（序列號(hào)12) mt-tRNA^探針具有mt-tRNA Glu基因的堿基序列33?62位的序列 (序列號(hào)13)，以下，作為對(duì)照的mt-tRNAleuftra)探針具有mt-tRNA leu(UUK)基因的堿基序列1? 30位的序列（序列號(hào)14)、tRNAMet探針具有與tRNA Met基因的堿基序列46?72位的序列 (序列號(hào) 15)。各探針在其 3' 末端使用 Biotin3'End DNA Labeling kit (Thermo Fisher Scientific)進(jìn)行了標(biāo)記。各RNA帶的信號(hào)強(qiáng)度使用LAS4000圖像分析儀和MultiGauge software (Fujifilm)進(jìn)行定量。各值是至少三次的獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的平均值（±1SD)。（結(jié)果）
[0314] 結(jié)果示于圖3。mt-tRNAAsn以及mt-tRNA Gln能夠從實(shí)施例1的"（4)免疫沉降和回 收"獲得的與DAP-TDP-43發(fā)生免疫共沉淀的RNA中，以單一帶檢測(cè)出（A，B)。與此相對(duì)，作 為對(duì)照的其他的mt-tRNA，即mt-tRNA leu_或細(xì)胞質(zhì)-tRNA的tRNAMet不能被檢測(cè)出（A)。另 夕卜，對(duì)于mt-tRNA PM以及mt-tRNAGlu，也能夠從與DAP-TDP-43發(fā)生免疫共沉淀的RNA中檢測(cè) 出（B)。由以上結(jié)果能夠證明 mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAPM以及 mt-tRNA Glu與 TDP-43 結(jié)合。
[0315]〈實(shí)施例3 :TDP-43與mt-tRNA的結(jié)合的生理學(xué)功能〉
[0316](目的）
[0317] 明確TDP-43與mt-tRNA的結(jié)合的生理學(xué)功能。
[0318] (a)通過(guò)IDP-43siRNA抑制IDP-43的細(xì)胞存在量
[0319](方法）
[0320]驗(yàn)證了對(duì)于 TDP-43 使用 small interference RNA(TDP-43siRNA)來(lái)抑制 TDP-43 的表達(dá)時(shí)的上述mt-tRNA的存在量。
[0321] 作為T(mén)DP-43siRNA，構(gòu)建了由序列號(hào)16和序列號(hào)17所示寡核苷酸組成的siRNA。 另外，作為T(mén)DP-43siRNA的陰性對(duì)照，構(gòu)建了由序列號(hào)18和序列號(hào)19所示寡核苷酸組成的 siRNA(以下，在本實(shí)施例中簡(jiǎn)稱為"Cont"）（stealth RNA:lifetechnologies)。接下來(lái)將 HeLa細(xì)胞在35mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，在大約70%的融合時(shí)，將以TDP-43為目標(biāo)的50pmol的 siRNA使用2. 5 y L的Lipofectamine 2000,遵循附帶的說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
[0322] 轉(zhuǎn)染后回收0、24、48、72以及96小時(shí)后的培養(yǎng)液的一部分，進(jìn)行細(xì)胞增殖測(cè)定。細(xì) 胞增殖測(cè)定使用Burker-Turk chamber(Hirschmann ;Laborgerate Hilgenberg)，通過(guò)視覺(jué) 上對(duì)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)而算出。
[0323] 另外，在上述24、48、72以及96小時(shí)后，通過(guò)與上述實(shí)施例1的"（3)細(xì)胞提取液 的制備"所述的方法同樣的方法制備了細(xì)胞提取液。為了確認(rèn)由siRNA對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá) 抑制，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)了在上述細(xì)胞提取液中的TDP-43的蛋白質(zhì)量。作為內(nèi)部對(duì)照 使用了甘油酸 _3_ 憐酸脫氛酶（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase:以下簡(jiǎn)稱 "GAPDH")。為了確認(rèn)TDP-43的表達(dá)抑制，使用了抗-TDP-43抗體，另外，檢測(cè)GAPDH使用了 抗-GAPDH 抗體（ambion)。
[0324] 而且，作為獲得TDP-43表達(dá)抑制時(shí)的細(xì)胞中的總RNA的方法，將經(jīng)PBS洗滌的細(xì) 胞使用RNAgent Denaturing Solution (Promega)溶解，通過(guò)酸性苯酷氯仿提取法將含有 RNA的水層分離，通過(guò)異丙醇沉淀回收RNA，然后使用75%乙醇進(jìn)行了洗滌。將此作為細(xì)胞 的總RNA，通過(guò)與上述實(shí)施例1的"（5)尿素變性PAGE"所述方法同樣的方法進(jìn)行免疫共沉 淀-RNA印跡法解析。
[0325] 用于檢測(cè)的各寡核苷酸探針，除了上述實(shí)施例2所述的探針外，還使用了 UlsnRNA 探針（UlsnRNA基因的堿基序列1?24位的序列（序列號(hào)20))以及5. 8S rRNA探針（5. 8S rRNA基因的堿基序列123?146位的序列（序列號(hào)21))。
[0326](結(jié)果）
[0327] 結(jié)果示于圖4以及圖5。圖4A是TDP-43-siRNA或者Cont轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中的 TDP-43的蛋白質(zhì)量的檢測(cè)結(jié)果。將TDP-43-siRNA轉(zhuǎn)染的情況下，與Cont比較，在轉(zhuǎn)染24 小時(shí)后之后，TDP-43蛋白質(zhì)的表達(dá)水平減少了 90%左右。從該結(jié)果能夠確認(rèn)TDP-43-siRNA 對(duì)于TDP-43的表達(dá)抑制的效果。另外，圖4B是將TDP-43-siRNA或者Cont轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì) 胞的細(xì)胞增殖率。該圖中所示數(shù)字為以轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞數(shù)量作為1時(shí)的相對(duì)值。根據(jù)該圖， 經(jīng)TDP-43-siRNA處理的HeLa細(xì)胞中，與Cont相比增殖明顯被抑制。從該結(jié)果能夠證明， TDP-43-siRNA表達(dá)的抑制能夠抑制細(xì)胞增殖。
[0328] 圖5是顯示經(jīng)TDP-43-siRNA處理后的各種RNA在HeLa細(xì)胞內(nèi)的存在量的變動(dòng) 的圖。圖中，5. 8S、Ul、Asn、Gln、Leu 分別表示 5. 8SrRNA、UlsnRNA、mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、 mt-tRNA Leu(_。將TDP-43-siRNA轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞與將Cont轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞相比較， mt-tRNA Asn、mt-tRNAGln的存在量明顯（分別為p〈0. 01，p〈0. 05)地減少。另一方面，對(duì)于 5. 8S RNA、UlsnRNA以及mt-tRNA^1沒(méi)能檢測(cè)出同樣的減少效果。
[0329] (b)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的DAP-TDP-43的過(guò)量表達(dá)
[0330](方法）
[0331] 向?qū)嵤├?的"（2)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)型細(xì)胞系的構(gòu)建"中制備的DAP-TDP-43表達(dá)株 中添加100ng/mL的強(qiáng)力霉素，使DAP-TDP-43在細(xì)胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)?；厥仗砑訌?qiáng)力霉素后0、 8、24、48小時(shí)后的培養(yǎng)液的一部分，通過(guò)與上述實(shí)施例1的"（3)細(xì)胞提取液的制備"所述的 方法同樣的方法制備了細(xì)胞提取液后，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法解析。另外，通過(guò)與上述實(shí)施例1 的"（4)免疫沉降和RNA回收"以及"（5)尿素變性PAGE"所述方法同樣的方法提取總RNA， 進(jìn)行RNA印跡法解析。用于檢測(cè)的寡核苷酸探針利用了上述探針。作為內(nèi)部對(duì)照，在蛋白 質(zhì)印跡法解析中使用GADPH，另外，在RNA印跡法解析中使用5. 8SrRNA。
[0332](結(jié)果）
[0333] 結(jié)果示于圖6。A所示是對(duì)于將DAP-TDP-43過(guò)量表達(dá)時(shí)的DAP-TDP-43和內(nèi)源 性TDP-43進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法解析的結(jié)果。另外，B所示是對(duì)于已經(jīng)明確與TDP-43結(jié)合的 mt-tRNA Asn以及mt-tRNA?的mRNA進(jìn)行RNA印跡法解析的結(jié)果。
[0334] 將DAP-TDP-43過(guò)量表達(dá)的情況下，與該表達(dá)水平成比例，mt-tRNA Asn以及 mt-tRNAan在細(xì)胞內(nèi)的存在量增加。
[0335] 從上述（a)以及（b)的結(jié)果能夠證明TDP-43至少與mt-tRNAAsn以及mt-tRNA?的 生物合成或者代謝有關(guān)。
[0336]〈實(shí)施例4 :TDP-43對(duì)mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln的細(xì)胞內(nèi)存在量的控制〉
[0337] (目的）
[0338] 確認(rèn)mt-tRNAAsn以及mt-tRNA Gln的細(xì)胞內(nèi)存在量受TDP-43控制。
[0339](方法）
[0340] (A)使用DAP-TDP-43表達(dá)株測(cè)定DAP-TDP-43過(guò)量表達(dá)時(shí)的mt-tRNA Asn或者 mt-tRNAGln的經(jīng)時(shí)分解。將強(qiáng)力霉素添加至DAP-TDP-43表達(dá)株的培養(yǎng)液后培養(yǎng)24小時(shí)， 在DAP-TDP-43過(guò)量表達(dá)后，添加溴化乙啶（EtBr)抑制mt-tRNA的合成，以EtBr添加時(shí)為 0時(shí)，在6、12、24小時(shí)后回收培養(yǎng)液的一部分，通過(guò)與上述實(shí)施例3所述方法同樣的方法制 備細(xì)胞總RNA后，通過(guò)與上述實(shí)施例2所述的RNA印跡法同樣的方法檢測(cè)mt-tRNA。作為內(nèi) 部對(duì)照，使用經(jīng)SYBR金染色的5S rRNA。
[0341] ⑶觀察了伴隨TDP-43的表達(dá)量的增加，mt-tRNAAsn、mt-tRNA Gln的結(jié)合量的變化。 研宄了 DAP-TDP-43 過(guò)量表達(dá)后，Etfo未添加時(shí)的 DAP-TDP-43 與 mt-tRNAAsn或者 mt-tRNAGln 的經(jīng)時(shí)的結(jié)合量。將強(qiáng)力霉素添加至DAP-TDP-43表達(dá)株的培養(yǎng)液，在4、8、24小時(shí)后回收 培養(yǎng)液的一部分，通過(guò)與上述實(shí)施例1的"（4)免疫沉降和RNA回收"以及"（5)尿素變性 PAGE"所述方法同樣的方法，通過(guò)免疫共沉淀-RNA印跡法解析進(jìn)行確認(rèn)。
[0342](結(jié)果）
[0343] 結(jié)果示于圖7。A是mt-tRNAAsn或者mt-tRNA Gln的經(jīng)時(shí)分解的結(jié)果，另外，B是與 DAP-TDP-43的免疫共沉淀的結(jié)果。
[0344] (A)可以明確，通過(guò)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)TDP-43的株（+dox)與未誘導(dǎo)的株（_dox)比較， mt-tRNA Gln的分解速度緩慢減少，另外mt-tRNAAsn的分解速度被顯著地延緩了。該結(jié)果顯示， TDP-43與mt-tRNA Asn以及mt-tRNA?的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性有關(guān)。
[0345] (B)判明了與過(guò)量表達(dá)的TDP-43結(jié)合的mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln增加，與之相 關(guān)地，這些mt-tRNA在細(xì)胞內(nèi)的存在量也增加。有報(bào)告稱在ALS中的突變型TDP-43與野 生型TDP-43相比較，其在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性增加（Ling,etal.，2010,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.2107:13318-13323)。因此，TDP-43在細(xì)胞內(nèi)的存在量的增加暗示著mt-tRNAAsn以及 mt-tRNAan在細(xì)胞內(nèi)的存在量的增加。
[0346] 從上述（A)、⑶的結(jié)果能夠證明，TDP-43作為支架蛋白質(zhì)，通過(guò)與mt-tRNAAsn或 者mt-tRNA^結(jié)合而控制其在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定化。
[0347]〈實(shí)施例5 :TDP_43中的mt-tRNA結(jié)合部位的鑒定〉
[0348] (目的）
[0349] 鑒定mt-tRNA與TDP-43的哪個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
[0350] (方法）
[0351] (1)帶有DAP標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)域缺失型TDP-43表達(dá)載體的制備
[0352] 制備了缺失了 RRM1結(jié)構(gòu)域、RRM2結(jié)構(gòu)域、GR結(jié)構(gòu)域或者315結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域缺失 型IDP-43 (分別稱為dRRMl、dRRM2、dGR以及d315。參照?qǐng)D8A)的表達(dá)載體。
[0353] 各結(jié)構(gòu)域缺失突變的TDP-43片段從實(shí)施例1構(gòu)建的DAP-TDP-43pcDNA5/FRT/T0， 使用KOD plus DNA聚合酶，通過(guò)PCR擴(kuò)增而制備。關(guān)于所使用的引物對(duì)，用于dRRMl的是 具有序列號(hào)22和23所不喊基序列的DNA，用于dRRM2的是具有序列號(hào)24和25所不喊基 序列的DNA，用于dGR的是具有序列號(hào)26和27所不喊基序列的DNA，用于d315的是具有 序列號(hào)28和29所示堿基序列的DNA。dRRMl、dRRM2以及dGR是將擴(kuò)增的DNA片段使用 Clal切斷后自身連接，經(jīng)堿基測(cè)序確認(rèn)發(fā)生突變后，使用Hindlll/Xhol切斷，插入pcDNA5/ FRT/T0的Hindlll/Xhol部位。d315是將擴(kuò)增的DNA片段使用BamHI/XhoI切斷，插入從 DAP-TDP-43pcDNA5/FRT/T0在BamHI/XhoI部位去除了 TDP-43部位而制成的載體部位。由此 獲得DAP-dRRMl、DAP-dRRM2、DAP-dGR 以及 DAP-d315 的各表達(dá)載體。（2)為了檢測(cè)與 TDP-43 結(jié)合的mt-tRNAA'mt-tRNA^，遵循實(shí)施例1所述的"（2)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)型細(xì)胞系的構(gòu)建" 構(gòu)建細(xì)胞系后，使用強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)表達(dá)后，回收24小時(shí)后的細(xì)胞，依照"（3)細(xì)胞提取液的 制備"、"（4)免疫沉降和RNA回收"以及"（5)尿素變性PAGE"所述方法檢測(cè)的mt-tRNA Asn、 mt-tRNAGln〇
[0354](結(jié)果）
[0355] 結(jié)果示于圖8。A所示是野生型TDP-43 (WT)以及各結(jié)構(gòu)域缺失型TDP-43的構(gòu)造 的示意圖。B所示是野生型TDP-43以及各結(jié)構(gòu)域缺失型TDP-43表達(dá)株中的通過(guò)強(qiáng)力霉素 誘導(dǎo)而表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)的各蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果。另外，C所示是與野生型TDP-43 以及各結(jié)構(gòu)域缺失型TDP-43結(jié)合的mt-tRNAAsn以及mt-tRNA?的RNA印跡法的結(jié)果。
[0356] 由C可知，在dRRM2、dGR以及d315中，mt-tRNAAsn以及mt-tRNA Gl1^結(jié)合能夠被維 持，但dRRMl中，沒(méi)有能夠確認(rèn)mt-tRNAAsn以及mt-tRNA Gln的結(jié)合。該結(jié)果能夠證明，這些 mt-tRNA是與TDP-43的RRM1結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
[0357]〈實(shí)施例6 :細(xì)胞毒性〉
[0358](目的）
[0359] 驗(yàn)證通過(guò)結(jié)構(gòu)域缺失型TDP-43誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。
[0360](方法）
[0361] 使用野生型以及上述實(shí)施例5制備的結(jié)構(gòu)域缺失型TDP-43的過(guò)量表達(dá)系，研 宄對(duì)于人細(xì)胞的細(xì)胞毒性能。向DAP-TDP43 (WT)、DAP-dRRMl、DAP-dRRM2、DAP-dGR以 及DAP-d315的各細(xì)胞培養(yǎng)液中添加強(qiáng)力霉素，對(duì)48小時(shí)后的細(xì)胞數(shù)使用Burker-Turk chamber(Hirschmann;LaborgerateHilgenberg)通過(guò)視覺(jué)上對(duì)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)而算出。
[0362](結(jié)果）
[0363] 結(jié)果示于圖9。該圖中，除了未添加強(qiáng)力霉素以外，將細(xì)胞增殖率以同樣條件下培 養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)為1時(shí)的相對(duì)值表示。圖中，*表示P〈〇. 05,另外，**表示P〈0. 01。
[0364]DAP-dGR以及DAP-d315通過(guò)過(guò)量表達(dá)（+dox)，觀察到與野生型的DAP-TDP43同程 度的細(xì)胞毒性。另外，DAP-dRRM2能夠觀察到大于野生型的DAP-TDP43的細(xì)胞毒性。另一 方面，在缺失了 mt-tRNAAsn以及mt-tRNA?的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RRM1的DAP-dRRMl的情況，過(guò)量 表達(dá)后也幾乎不顯示細(xì)胞毒性。該結(jié)果暗示，mt-tRNA Asn以及社-丨1?隱(：111與1?冊(cè)1的結(jié)合與 TDP-43的細(xì)胞毒性有關(guān)。也就是說(shuō)，通過(guò)抑制TDP-43與mt-tRNA的結(jié)合，能夠抑制細(xì)胞毒 性。
[0365]〈實(shí)施例7 :突變型TDP-43的細(xì)胞毒性與mt-tRNAAsn、mt-tRNAG1%^結(jié)合的相關(guān)性 >
[0366](目的）
[0367] 驗(yàn)證ALS中的TDP-43與mt-tRNA的相關(guān)性。
[0368](方法）
[0369] 制作了將ALS中確認(rèn)的突變導(dǎo)入的突變型TDP-43 (D169G、G298S、R361S;參照?qǐng)D 10A)的誘導(dǎo)表達(dá)型細(xì)胞系（DAP-D169G、DAP-G298S、DAP-R361S)。D169G、G298S 以及 R361S 的構(gòu)建基本上依照實(shí)施例5所述的方法。所使用的引物對(duì)，用于D169G的是具有序列號(hào)30 和31所不喊基序列的DNA，用于G298S的是具有序列號(hào)32和33所不喊基序列的DNA，用于 R361S的是具有序列號(hào)34和35所示堿基序列的DNA。需要說(shuō)明的是，將為了去除模板DNA 而擴(kuò)增得到的DNA片段使用Dpnl切斷后，轉(zhuǎn)染大腸桿菌，由此獲得含有目的序列的載體。通 過(guò)堿基測(cè)序確認(rèn)突變后，使用Hindlll/Xhol切斷，插入pcDNA5/FRT/TO的Hindlll/Xhol部 位。測(cè)定經(jīng)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)48小時(shí)后的突變株的生存率。
[0370] 另外，對(duì)于這些突變型TDP-43表達(dá)株的突變型TDP-43與mt-tRNAAsn、mt-tRNAG119 結(jié)合能進(jìn)行了確認(rèn)。檢測(cè)方法依照實(shí)施例2所述方法。
[0371](結(jié)果）
[0372] 結(jié)果示于圖10以及圖11。
[0373]圖10A顯示是用于實(shí)驗(yàn)的野生型TDP-43以及各突變型TDP-43的示意圖。圖10B 顯示是野生型以及各突變型TDP-43表達(dá)株的生存率的圖。+dox以及-dox分別表示向培養(yǎng) 基添加了強(qiáng)力霉素的細(xì)胞以及未添加強(qiáng)力霉素的細(xì)胞。從圖10B可以明確，表達(dá)具有ALS 樣突變的突變型TDP-43的細(xì)胞和表達(dá)野生型TDP-43的細(xì)胞相比較，任何細(xì)胞的生存率都 較低，具有強(qiáng)的細(xì)胞毒性。
[0374] 圖11顯示是過(guò)量表達(dá)野生型以及各突變型TDP-43時(shí)的細(xì)胞內(nèi)的各mt-tRNA的存 在量的圖。該圖中，以將未添加強(qiáng)力霉素的情況設(shè)定為1時(shí)的添加時(shí)的檢測(cè)帶的相對(duì)強(qiáng)度 表示。從該圖可知，突變型TDP-43與野生型TDP-43同樣，通過(guò)過(guò)量表達(dá)使得mt-tRNA Asn以 及社41?嫩(：111在細(xì)胞內(nèi)的存在量增加。從在ALS中觀察到的突變型TDP-43是通過(guò)穩(wěn)定化 使得細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平增加的報(bào)告可知，以上的結(jié)果顯示由于ALS樣突變型TDP-43在細(xì)胞 內(nèi)的存在量增加，因而使mt-tRNA Asn以及mt-tRNA ^也穩(wěn)定化，使它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的存在量增 加。作為其結(jié)果，也誘導(dǎo)發(fā)生如后述實(shí)施例1〇、11所示的效果，從而導(dǎo)致該細(xì)胞的細(xì)胞毒性 增加，誘發(fā)細(xì)胞死亡。
[0375]〈實(shí)施例8:新型TDP-43結(jié)合蛋白質(zhì)〉
[0376] (目的）
[0377] 作為T(mén)DP-43結(jié)合蛋白質(zhì)，現(xiàn)行報(bào)告有FUS/TLS以及ataxin2 (Kwiatkowski, et al.,2009,Science, 323:1205-1208 ；Vance, et al.,2009, Science 323,1208-1211 ； Elden, et al. , 2010, Nature. 466:1069-1075)。在此，對(duì)于與 TDP-43 結(jié)合的其他的蛋白質(zhì) 進(jìn)行解析。
[0378] (1)TDP-43結(jié)合蛋白質(zhì)的分離以及鑒定
[0379](方法）
[0380]使用具有二種不同的標(biāo)簽的DAP-TDP-43，通過(guò)使用該不同的標(biāo)簽進(jìn)行兩次 拉下法的二階段提純法，回收上述與DAP-TDP-43結(jié)合的蛋白質(zhì)，通過(guò)SDS-PAGE分 離后，經(jīng)蛋白酶進(jìn)行膠內(nèi)消化。這些方法依照Fujiyama-Nakamura等（Mol Cell Proteomics, 2009, 8, 1552-1565)、Hayano 等（J. Proteome Res. 7:4183-4190)所述的方法 進(jìn)行。之后，進(jìn)行LC-MS/MS分析和Mascot search engine進(jìn)行鳥(niǎo)槍法解析。需要說(shuō)明的 是，LC-MS/MS在以下的條件進(jìn)行。
[0381] (A)液相色譜法（LC)條件
[0382] ?使用機(jī)器：RENC0N(LCAssist)
[0383] ?洗脫液A:0? 1 %甲酸的水溶液（MilliQ水）
[0384] ?洗脫液B:0? 1 %甲酸的乙腈溶液（和光純藥）
[0385] ?色譜柱：：45mmX0. 150mm i. d?粒徑 3 ym(Kanto Chemical)
[0386] ?色譜柱溫度：25°C
[0387] ?流速：100nL/min
[0388] ?時(shí)序濃度梯度（Time schedule gradient)0% B0 分鐘：0%?60 分鐘：35% B
[0389] ?捕集柱Monocap for Trap 200 ymX 45 ym(GL SCIENCES)
[0390] (B)MS條件
[0391] ?使用機(jī)器：LTQ-〇rbi trap XL (Thermo Fisher Scientific)
[0392] ? Mass range :450_1500Da
[0393] ?掃描模式：FT normal
[0394] ?離子化方法：ESI_Positive
[0395] ?掃描速度：normal
[0396] ?解析軟件：ExcaliburQualBrowser
[0397] (C)MSMS 條件
[0398] ?使用機(jī)器：同上
[0399] ?Massrange：normal
[0400] ?掃描模式：Ion-trapnormal
[0401] ?掃描速度：normal
[0402] ?解析軟件：ExcaliburQualBroswer
[0403](結(jié)果）
[0404] 作為T(mén)DP-43結(jié)合蛋白質(zhì)的候補(bǔ)，分離了與已有報(bào)告的（1；[叩6七31.，2010，？1'0(3. Natl. Acad. Sci.U. S.A. 2107:13318-13323)hnRNP、白細(xì)胞介素、增強(qiáng)子結(jié)合因子、胰島素 樣成長(zhǎng)因子2mRNA結(jié)合蛋白質(zhì)、Matrin-3以及DHX9 -起，還有，作為新型TDP-43結(jié)合 蛋白質(zhì)的 aralar 1 (SLC25A12)、aralar 2 (SLC25A13 ;citrin)、Musashi 2 以及⑶H (未 顯示數(shù)據(jù)）。aralar 1以及aralar 2是線粒體的天冬氨酸-谷氨酸輸送體蛋白質(zhì)，經(jīng) 由線粒體內(nèi)膜參與天冬氨酸和谷氨酸的交換（Gellerich FN，et al.，2009，PL0S One.9; 4(12):e8181)。Musashi 2具有RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，被認(rèn)為是與骨髓性白血病細(xì)胞的增殖 (Jaenisch&Daley, Nat Med. 201016(8) :903-908.)、神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞的維持和增殖所必 要的蛋白質(zhì)（Seigel GM，et al.，Mol Vis.2007Jun 8;13:823-832.)。⑶H是將谷氨酸轉(zhuǎn)化 成三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物a酮戊二酸（氧代戊二酸）的酶，已知是與能量代謝和氨的解毒 有關(guān)（http://www. uniprot. org/uniprot/P00367) 0
[0405] (2)通過(guò)TDP-43的過(guò)量表達(dá)的新型TDP-43結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合效果（方法）
[0406] 向DAP-TDP-43細(xì)胞株的培養(yǎng)基添加強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)DAP-TDP-43表達(dá)后，在4、8以 及24小時(shí)回收細(xì)胞，使用DAP-TDP-43進(jìn)行免疫沉降。所使用方法依照上述實(shí)施例1以及2。 aralar l、aralar 2、Musashi2 以及 GDH 的檢測(cè)分別使用了抗 aralar 1 抗體（Santacruz)、 抗aralar 2抗體（abeam)、抗Musashi 2抗體（abeam)以及抗⑶H抗體（abeam)。另外，作 為內(nèi)部對(duì)照使用0 -肌動(dòng)蛋白。對(duì)于0 -肌動(dòng)蛋白，使用抗0 -肌動(dòng)蛋白抗體（Santacruz)。
[0407](結(jié)果）
[0408] 結(jié)果示于圖12。DAP-TDP-43在細(xì)胞內(nèi)的存在量伴隨誘導(dǎo)表達(dá)后的時(shí)間增加而增 加。與此相伴的，與DAP-TDP-43發(fā)生免疫共沉淀的aralar 1、aralar 2、Musashi 2以及 ⑶H的量也增加。所以能夠顯示TDP-43不僅與mt-tRNAAsn等mt-tRNA發(fā)生結(jié)合，還與aralar l、aralar2、Musashi 2以及⑶H的蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合。
[0409]⑶ aralar I、2 以及 mt-tRNA 的結(jié)合性
[0410](方法）
[0411] 為了確認(rèn)aralar 1以及aralar 2的結(jié)合，互換免疫沉降蛋白質(zhì)后再次進(jìn)行了 免疫共沉淀。另外，為了確認(rèn)aralar 1或者aralar 2與mt-tRNA之間發(fā)生結(jié)合，在通過(guò) 上述抗體進(jìn)行拉下后，使用mt-tRNAAsn探針進(jìn)行了檢測(cè)。免疫共沉淀的方法基本上遵循 Sambrook, J?等（Molecular Cloning:A Laboratory Manual Third Ed. , 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)的方法，以及上述實(shí)施例 1 以 及2所述的方法。
[0412](結(jié)果）
[0413] 結(jié)果示于圖13。圖13A所示是aralar 1以及aralar 2的互換免疫沉降的結(jié)果。 另外，圖13B所示是與aralar 1或者aralar 2發(fā)生免疫共沉淀的mt-tRNAAsn的結(jié)果。從 圖13B中能夠證明，aralar 1和aralar 2不僅與TDP-43結(jié)合，在體內(nèi)還可以相互結(jié)合。 另一方面，因?yàn)閙t-tRNAAsn與aralar 1和aralar 2都不發(fā)生免疫共沉淀，所以能夠證明它 雖然與TDP-43結(jié)合，但與aralar 1和aralar 2不結(jié)合。這些結(jié)果顯示，含有mt-tRNA的 TDP-43復(fù)合物與含有aralar 1以及aralar 2的TDP-43復(fù)合物是不同的復(fù)合物。
[0414] (4)Musashi2 以及 mt-tRNA 的結(jié)合性
[0415](方法）
[0416] 為了確認(rèn)Musashi2與mt-tRNA間的結(jié)合，構(gòu)建了 DAP_Musashi2 (圖14中以 DAP-Msi2表述）誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞系。基本上依照實(shí)施例5所述的方法進(jìn)行。使用DAP-Musashi2 拉下后，對(duì)于與DAP-Musashi2結(jié)合的mt-tRNA Asn以及mt-tRNAGln，使用各探針進(jìn)行檢測(cè)。免 疫共沉淀基本上遵循 Sambrook，J?等（Molecular Cloning:A Laboratory Manual Third Ed. , 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)的方 法，以及上述實(shí)施例1以及2所述的方法。
[0417](結(jié)果）
[0418] 結(jié)果示于圖14。使用DAP-Musashi-2(DAP-Msi2)拉下，能夠確認(rèn)mt-tRNA Asn以及 mt-tRNAGln發(fā)生了免疫共沉淀。
[0419]〈實(shí)施例9 :TDP-43結(jié)合蛋白質(zhì)的TDP-43結(jié)合部位的鑒定〉
[0420](目的）
[0421] 驗(yàn)證在實(shí)施例8中鑒定的與TDP-43結(jié)合的蛋白質(zhì)aralar 1以及aralar 2與 IDP-43的何種結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。
[0422](方法）
[0423] 使用在實(shí)施例5中制作的DAP-dRRMl、DAP-dRRM2、DAP-dGR以及DAP-d315的各表 達(dá)株，免疫共沉淀的方法基本上遵循Sambrook，J?等（Molecular Cloning:A Laboratory Manual Third Ed. , 2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)的方法，以及上述實(shí)施例1以及2所述的方法。野生型以及各結(jié)構(gòu)域缺失 型 TDP-43 的蛋白質(zhì)使用量通過(guò)使用 Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module kit (Thermo Fisher Scientific)檢測(cè)生物素進(jìn)行了確認(rèn)。
[0424](結(jié)果）
[0425] 結(jié)果示于圖15。如該圖所示，aralar 1以及aralar 2在RRM 1以及RRM 2結(jié)構(gòu) 域缺失體中均被檢測(cè)，但在GR結(jié)構(gòu)域缺失體以及315結(jié)構(gòu)域缺失體中，檢測(cè)量低或者未被 檢測(cè)。該結(jié)果能夠證明，aralar 1以及aralar 2與TDP-43的C末端側(cè)的GR以及315結(jié) 構(gòu)域結(jié)合。
[0426]〈實(shí)施例10 : TDP-43與ATP的關(guān)系〉
[0427](目的）
[0428] 驗(yàn)證TDP-43與ATP的關(guān)聯(lián)性。
[0429](方法）
[0430] 對(duì)于使用在實(shí)施例3中制備的TDP-43siRNA抑制了 TDP-43表達(dá)的情況，以及使用 DAP-TDP-43細(xì)胞，使DAP-TDP-43過(guò)量表達(dá)的情況，分別進(jìn)行ATP測(cè)定，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的ATP 量。ATP量的測(cè)定是使用Celltiter-glo(Promega)，依照附帶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行了測(cè)定。作為 細(xì)胞量的對(duì)照，依照上述實(shí)施例6所述的方法對(duì)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行了計(jì)數(shù)。
[0431] DAP-TDP-43的過(guò)量表達(dá)細(xì)胞中的ATP量的測(cè)定是在通過(guò)添加強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)表達(dá) (0時(shí)）后，對(duì)于8、24、48小時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行的。
[0432](結(jié)果）
[0433] 結(jié)果示于圖16。在抑制了 TDP-43的情況下，TDP-43細(xì)胞中的ATP存在量與Cont 細(xì)胞相比較，減少至82% (圖16A)。在將DAP-TDP-43過(guò)量表達(dá)的情況下，單位細(xì)胞量中的 ATP存在量在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)后，48小時(shí)增加至1. 8倍（圖16B)。這些結(jié)果顯示，TDP-43與 氧化磷酸化反應(yīng)的控制有關(guān)。
[0434]〈實(shí)施例11:結(jié)構(gòu)域缺失型TDP-43中的mt-tRNA以及ATP的細(xì)胞存在量〉
[0435](目的）
[0436] 驗(yàn)證結(jié)構(gòu)域缺失型TDP-43中的mt-tRNA(mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln)或者ATP的 細(xì)胞存在量。
[0437](方法）
[0438] 各結(jié)構(gòu)域缺失型IDP-43表達(dá)株使用在實(shí)施例5中制備的DAP-dRRMl、DAP-dRRM2、 DAP-dGR以及DAP-d315的各誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞株。誘導(dǎo)表達(dá)是通過(guò)向培養(yǎng)基添加強(qiáng)力霉素 (+dox)進(jìn)行，從添加后48小時(shí)的細(xì)胞中提取總RNA，使用各自的RNA的上述探針，檢測(cè)、定 量細(xì)胞內(nèi)存在量。作為誘導(dǎo)表達(dá)的對(duì)照是在未添加強(qiáng)力霉素（-dox)的培養(yǎng)基中，其他條件 相同的情況下培養(yǎng)的同系的細(xì)胞株。另外，通過(guò)與上述實(shí)施例10同樣的方法，將各結(jié)構(gòu)域 缺失型TDP-43誘導(dǎo)后，測(cè)定了細(xì)胞內(nèi)的ATP量。
[0439](結(jié)果）
[0440] 結(jié)果示于圖17-1以及圖17-2。圖17-1是將各結(jié)構(gòu)域缺失型TDP-43中的 mt-tRNA Asn、mt-tRNAan以及mt-tRNA leuftra)的細(xì)胞內(nèi)存在量以檢測(cè)出的帶的相對(duì)強(qiáng)度（規(guī)定 未添加強(qiáng)力霉素（_dox)為1時(shí)的誘導(dǎo)表達(dá)（+dox)的相對(duì)值）表示的圖。從圖17-1中可 知，DAP-dRRM 2的過(guò)量表達(dá)使mt-tRNAAsn以及mt-tRNAG1%^量顯著增加。
[0441] 圖17-2是各結(jié)構(gòu)域缺失型TDP-43中的ATP的測(cè)定結(jié)果。與圖17-1的結(jié)果同樣， DAP-dRRM2的過(guò)量表達(dá)使細(xì)胞內(nèi)的ATP量顯著增加。另一方面，在dRRMl的過(guò)量表達(dá)的情 況下，細(xì)胞內(nèi)的ATP量未見(jiàn)增加。
[0442] 以上的結(jié)果顯示，結(jié)構(gòu)域缺失型IDP-43與mt-tRNAAsn、mt-tRNA Gln以及ATP在細(xì)胞 內(nèi)的存在量的增加能力成比例，增加細(xì)胞毒性。
[0443]〈實(shí)施例12:突變型TDP-43與ATP在細(xì)胞內(nèi)的存在量的相關(guān)性〉
[0444](目的）
[0445] 驗(yàn)證ALS中TDP-43與ATP細(xì)胞內(nèi)存在量的相關(guān)性。
[0446](方法）
[0447] 使用上述實(shí)施例7中制作的導(dǎo)入了在ALS中確認(rèn)的突變的突變型TDP-43 (D169G， G298S，R361S;參照?qǐng)D 10A)的誘導(dǎo)表達(dá)型細(xì)胞系（DAP-D169G，DAP-G298S，DAP-R361S)，通過(guò) 強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)后，測(cè)定了經(jīng)過(guò)48小時(shí)的ATP細(xì)胞內(nèi)存在量。測(cè)定方法依照實(shí)施例2所述的 方法。
[0448](結(jié)果）
[0449] 結(jié)果示于圖18。任意種結(jié)構(gòu)域缺失型TDP-43都由于過(guò)量表達(dá)而使細(xì)胞內(nèi)的ATP 存在量增大。這表示，在ALS中的突變型TDP-43與mt-tRNA Asn和mt-tRNAGln(實(shí)施例7)同 時(shí)具有使ATP細(xì)胞內(nèi)存在量增加的能力，該增加能力與細(xì)胞毒性一致。
[0450] ALS中的TDP-43突變導(dǎo)致的病情的發(fā)病機(jī)理尚未被充分地解明。然而，從上述實(shí) 施例1?12的結(jié)果，能夠?qū)С鲆韵碌囊环N假說(shuō)。
[0451] S卩，由于突變使細(xì)胞內(nèi)的TDP-43穩(wěn)定化，亦或與mt-tRNA Asn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu 和/或mt-tRNAPlr°、Aralar 1或Aralar 2、⑶H、或者M(jìn)usashi 2的結(jié)合能發(fā)生變化，從而成 為ALS發(fā)病的誘因。由于突變使TDP-43穩(wěn)定化，使突變型TDP-43與上述mt-tRNA結(jié)合的 IDP-43-mt-tRNA復(fù)合物、和/或與上述蛋白質(zhì)結(jié)合的IDP-43-蛋白質(zhì)復(fù)合物增加。由于突 變型 TDP-43 形成與上述 mt-tRNA 結(jié)合的 TDP-43-mt-tRNA 復(fù)合物，mt-tRNAAsn、mt-tRNAG119 存在量增加，促進(jìn)線粒體中蛋白質(zhì)的合成，作為其結(jié)果，線粒體被激活。與此同時(shí)，由于形成 與上述蛋白質(zhì)結(jié)合的TDP-43-蛋白質(zhì)復(fù)合物，促進(jìn)Glu向a -酮戊二酸轉(zhuǎn)化，引發(fā)三羧酸循 環(huán)的亢進(jìn)。由于這些效果，會(huì)使線粒體的氧化磷酸化異?？哼M(jìn)，引起ATP的合成量增加?？?以推測(cè)該異常的氧化磷酸化的亢進(jìn)引起活性氧的增加和伴隨Glu代謝的氨的增加，從而引 發(fā)的尿素代謝異常，進(jìn)而使細(xì)胞受損，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另一方面，細(xì)胞啟動(dòng)反饋該現(xiàn)象的防 御系統(tǒng)。細(xì)胞將由于TDP-43的突變而增加的TDP-43-mt-tRNA復(fù)合物和/或TDP-43-蛋白 質(zhì)復(fù)合物作為凝集物，被捕獲在細(xì)胞質(zhì)的特定位置，并從TDP-43本應(yīng)發(fā)揮原本的功能的細(xì) 胞內(nèi)的場(chǎng)所將IDP-43隔離，此時(shí)，能夠預(yù)測(cè)TDP-43-mt-tRNA復(fù)合物中所含的mt-tRNA Asn、 mt-tRNAG1lP TDP-43-蛋白質(zhì)復(fù)合物也同時(shí)作為凝集物被沉積。由于IDP-43的突變而與 Aralar 1或Aralar 2、⑶H或者M(jìn)usashi 2的結(jié)合能發(fā)生變化的情況下，也可以認(rèn)為會(huì)發(fā) 生與TDP-43穩(wěn)定化的情況下同樣的現(xiàn)象。因此，mt-tRNAAsn、11^41?隱 (：111是在沒(méi)有Asp和 Glu補(bǔ)充的狀態(tài)被捕獲在凝集物內(nèi)，同時(shí)，與將Glu轉(zhuǎn)化成a酮戊二酸相關(guān)的Aralarl， Aralar 2,⑶H和/或與mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln結(jié)合的Musashi 2也被捕獲。作為其結(jié)果， 向mt-tRNAAsn和mt-tRNA Gln的補(bǔ)充和向a酮戊二酸的轉(zhuǎn)化不再發(fā)生，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生Asp和 /或Glu的蓄積。特別是在星形細(xì)胞中，由于Asp被轉(zhuǎn)化為Glu，引起Glu的更加過(guò)量的蓄 積（Pardo et al.，2011，J.Cereb. Blood Flow Metab. 31(1) :9〇-101;Hertz L.，2011，J. Cereb. Blood Flow Metab. 31(1): 384-387)。能夠推測(cè)由于過(guò)量蓄積的Glu毒性，誘導(dǎo)感受 性特別高的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)生細(xì)胞死亡。雖然這只是假說(shuō)，但通過(guò)以上的發(fā)病機(jī)理，能夠解釋 TDP-43在ALS中被觀察到的突變與ALS的病情，特別是Glu濃度的上升是如何發(fā)生的。所 以，對(duì)于與該發(fā)病機(jī)理相關(guān)的全部蛋白質(zhì)和/或RNA產(chǎn)生影響、降低Asp和/或Glu在細(xì)胞 內(nèi)濃度的物質(zhì)被認(rèn)為可能成為ALS治療劑中的有效成分。
[0452]〈實(shí)施例13 :TDP_43結(jié)合抑制劑的制造〉
[0453] 使用本發(fā)明的TDP-43結(jié)合抑制劑制造方法制造，制造通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制TDP-43和與 其結(jié)合的 mt-tRNA (mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及 mt-tRNA PM)結(jié)合的 TDP-43 結(jié)合 抑制劑。
[0454] (1) 4種mt-tRNA中的TDP-43結(jié)合區(qū)域候補(bǔ)的探索
[0455](目的）
[0456] 推測(cè)上述4種mt-tRNA的共通區(qū)域與TDP-43發(fā)生結(jié)合，所以對(duì)上述4種mt-tRNA 中的IDP-43的結(jié)合區(qū)域進(jìn)行探索。
[0457](方法）
[0458] 首先，對(duì)于各個(gè)mt-tRNA的序列通過(guò)lustalW進(jìn)行多序列比對(duì)，用WebLogo將共有 序列用MEME將圖形分別提取，將共有序列在三維結(jié)構(gòu)上重疊進(jìn)行分析。
[0459](結(jié)果）
[0460] 圖19表示4種mt-tRNA的堿基序列的比對(duì)結(jié)果，圖20表示mt-tRNAAsn的二級(jí)結(jié) 構(gòu)，以及4種mt-tRNA的共有序列的位置。
[0461]從比對(duì)的結(jié)果以及二級(jí)結(jié)構(gòu)明確了在D莖&環(huán)內(nèi)的GUU (僅mt-tRNAGl1^ GAU)、反 密碼子環(huán)內(nèi)的UXU、T莖&環(huán)內(nèi)的UGG以及接受臂（氨基酰化臂）的CCA的4區(qū)域存在共有 序列。其中反密碼子環(huán)內(nèi)的共有序列UXU是其他多種mt-tRNA中共通的序列，另外接受臂 的共有序列CCA是全部mt-tRNA中共通的序列，不是上述4種mt-tRNA特異性的序列。所 以，將此2個(gè)共有序列從與IDP-43結(jié)合區(qū)域候補(bǔ)中排除。另一方面，在D莖&環(huán)內(nèi)和T莖& 環(huán)內(nèi)含有GUU和UGG雙方的共有序列分別的mt-tRNA在22種mt-tRNA中僅有mt-tRNA Asn、 mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNA PM的4種，因此明確是這4種mt-tRNA特異性的序列。 所以，將此兩個(gè)共有序列作為T(mén)DP-43結(jié)合區(qū)域候補(bǔ)，進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。
[0462] (2)由TDP-43結(jié)合抑制劑候補(bǔ)寡核苷酸帶來(lái)的mt-tRNA與TDP-43結(jié)合的結(jié)合抑 制
[0463](目的）
[0464] 由上述⑴的結(jié)果明確了與TDP-43結(jié)合的4種mt-tRNA中的四個(gè)共有區(qū)域。因?yàn)?推測(cè)含有這些共有序列的寡核苷酸是與TDP-43的結(jié)合相關(guān)聯(lián)的區(qū)域，因此可能成為抑制4 種mt-tRNA與TDP-43結(jié)合的TDP-43結(jié)合抑制劑候補(bǔ)物質(zhì)。在此，使用這些寡核苷酸進(jìn)行 了與內(nèi)源性mt-tRNA之間對(duì)于TDP-43的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定。
[0465](方法）
[0466] 合成了以下寡核苷酸，S卩，將mt_tRNAAsn的5'末端的堿基作為1位時(shí)，包含D莖 &環(huán)的相當(dāng)于1 ?25位的DNA寡核苷酸（D-loop;5' -TAGAITGAAGCCAGITGATTAGGGT-3' ： 序列號(hào)40)、包含反密碼子環(huán)的相當(dāng)于26?48位（Anticodon;5'GCTTAGCTGTTAACTAAGTG TTT-3' ：序列號(hào)41)、包含T莖&環(huán)的49?73位的DNA寡核苷酸（T-loop; 5' -GTGGGTTTAAGTCCCATTGGTCTAG-3'：序列號(hào)42)、相當(dāng)于包含在T莖&環(huán)的共有序列UUG 的一部分的UG的12次重復(fù)序列的DNA寡核苷酸（TG) 12 (5 '-TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG TG-3'：序列號(hào)43)、作為 〇^)12的對(duì)照用DNA寡核苷酸的（TG) 12(5'-TCTCTCTCTCTCTCTCTCTC TCTC-3':序列號(hào)44)、包含在T莖&環(huán)的共有序列UGG的8次重復(fù)序列組成的DNA寡核苷酸 (TGG)8(5' -TGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGG-3'：序列號(hào)45)、以及包含在D莖&環(huán)的共有序列 UGG的7次重復(fù)序列組成的DNA寡核苷酸IT(GIT)7G(5' -TTGITGTTGITGTTGITGTTGITG-3' ： 序列號(hào)46)(附圖中，為了方便而以（TTG)8表示）。
[0467] 競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定依照實(shí)施例1的方法進(jìn)行。首先，遵循實(shí)施例1的"（3)細(xì)胞提取液的 制備"所述的方法制備細(xì)胞提取液后，添加作為T(mén)DP-43結(jié)合抑制劑候補(bǔ)物質(zhì)的各種DNA寡 核苷酸，使其濃度為200nM。將未添加寡核苷酸的樣品作為陰性對(duì)照使用（-)。接著，遵循實(shí) 施例1的"（4)免疫沉降和RNA回收"以及"（5)尿素變性PAGE"所述的方法處理，通過(guò)電泳 展開(kāi)含有Flag標(biāo)簽的與DAP-TDP-43結(jié)合的核酸。另外，依照實(shí)施例2的RNA印跡法的方 法，檢測(cè)、定量與DAP-TD-43結(jié)合的mt-tRNAAsn。作為用于檢測(cè)的寡核苷酸探針，利用了序列 號(hào)10的寡核苷酸。mt-tRNA Asn的RNA帶的信號(hào)強(qiáng)度通過(guò)LAS4000圖像分析儀和MultiGauge software (Fujifilm)進(jìn)行了定量。
[0468](結(jié)果）
[0469] 結(jié)果示于圖21以及22。
[0470] 從圖21A的結(jié)果，添加了（TG) 12時(shí)與DAP-TD-43結(jié)合的4種mt-tRNA的帶顏色（圖 1參照）最淡，顯示其對(duì)于與DAP-TD-43的結(jié)合發(fā)生了抑制。加入D-loop和T-loop時(shí)，與 陰性對(duì)照（_)相比較略微產(chǎn)生了抑制，但加入Anticodon時(shí)幾乎沒(méi)有抑制效果。從圖21B 的結(jié)果，同樣的結(jié)果由通過(guò)RNA印跡法進(jìn)行的mt-tRNA Asn的檢測(cè)也得以確認(rèn)。
[0471]從圖 22A 的結(jié)果，添加了（TG)12、（TTG)8以及 TT(GTT) 7G 時(shí)，與 DAP-TD-43 結(jié)合 的4種mt-tRNA的帶的顏色（圖1參照）與陰性對(duì)照（-)相比較明顯變淡，顯示其對(duì)與 DAP-TD-43的結(jié)合發(fā)生了抑制。另一方面，作為〇^) 12的對(duì)照用，加入不含共有序列的（TG) 12 時(shí)，DAP-TD-43與mt-tRNA的結(jié)合未被抑制。同樣的結(jié)果由通過(guò)圖22B所示的RNA印跡法 進(jìn)行的mt-tRNA Asn的檢測(cè)也得以確認(rèn)。（TG) 12的結(jié)合抑制效果最強(qiáng)，（TTG) 8以及TT(GTT) 87G 次之。所以能夠證明，含有上述共有序列或者其一部分的（TG)12、（TTG) 8以及TT(TT) 87G可 能成為競(jìng)爭(zhēng)性抑制TDP-43與4種mt-tRNA結(jié)合的TDP-43結(jié)合抑制劑。
[0472] ⑶TDP-43結(jié)合抑制劑（TG) 12的結(jié)合抑制效果的驗(yàn)證
[0473] (目的）
[0474] 驗(yàn)證上述（2)所獲得的TDP-43結(jié)合抑制劑的濃度和TDP-43與4種mt-tRNA的結(jié) 合抑制的效果。
[0475] (方法）
[0476] 作為T(mén)DP-43結(jié)合抑制劑使用上述（2)所獲得的（TG)12?；痉椒ㄗ裱鲜觯?)。 但是添加的郎) 12的濃度為0、2、20、200nM。
[0477](結(jié)果）
[0478] 結(jié)果示于圖23A?C。可以明確，與TDP-43結(jié)合抑制劑（TG) 12的濃度成比例地， TDP-43與4種mt-tRNA結(jié)合的抑制效果得到提高。
[0479] 本說(shuō)明書(shū)所引用的全部刊物、專利以及專利申請(qǐng)直接作為參考收入本說(shuō)明書(shū)中。
[0480]〈實(shí)施例14 :TDP_43與活性氧量的關(guān)系〉
[0481] (目的）
[0482] 實(shí)施例10中證明了 TDP-43與ATP量的關(guān)聯(lián)性。另一方面，ATP增加的情況下，同 時(shí)產(chǎn)生活性氧。活性氧已知作為一種細(xì)胞毒性，所以被認(rèn)為是造成細(xì)胞傷害的直接的原因 物質(zhì)。因此，對(duì)于TDP-43與活性氧量的相關(guān)性也進(jìn)行了驗(yàn)證。
[0483] (方法）
[0484] 使用實(shí)施例1中制備的DAP-TDP-43細(xì)胞。DAP-TDP-43誘導(dǎo)表達(dá)是通過(guò)向培養(yǎng)基 添加強(qiáng)力霉素（+dox)進(jìn)行，對(duì)于添加后8、24、48小時(shí)后的細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧活性。誘 導(dǎo)表達(dá)的對(duì)照是，在未添加強(qiáng)力霉素（_d〇X)的培養(yǎng)基中，其他條件相同情況下培養(yǎng)的同系 的細(xì)胞株（293TRex)。
[0485] 細(xì)胞內(nèi)的羥基，過(guò)氧化基或者其他的活性氧活性的測(cè)定是利用細(xì)胞浸透性熒光探 針 2'，7' -Dichlorodihydrofluorescin diacetate(DCFH-DA)。DCFH-DA 在細(xì)胞內(nèi)分散后， 被細(xì)胞內(nèi)的酯酶脫乙?；?，變化為非熒光型2'，7' -Dichlorodihydrofluorescin(DCFH)。 之后，立即被R0S氧化，變化為強(qiáng)熒光性的2'，7'-Dichlorodihydrof luorescein (DCF)。熒 光強(qiáng)度與細(xì)胞溶質(zhì)中的R0S水平成比例。具體而言，25 y M的DCFH-DA經(jīng)細(xì)胞處理，在37°C 保溫30分鐘后回收?；厥盏募?xì)胞中的DCF的熒光強(qiáng)度通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。（Miura D et al. (2004)Clinical &Experimental Metastasis 21:445-451)
[0486](結(jié)果）
[0487] 結(jié)果示于圖24。能夠明確，在誘導(dǎo)TDP-43表達(dá)的細(xì)胞中，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加， 即，伴隨TDP-43的表達(dá)水平的增加，在細(xì)胞內(nèi)的活性氧活性顯著增加。另一方面，未能確認(rèn) 未誘導(dǎo)TDP-43表達(dá)的細(xì)胞（293TRex)中的細(xì)胞內(nèi)活性氧活性有明顯變化。以上的結(jié)果顯 示，與TDP-43的表達(dá)量的增加成比例地，細(xì)胞內(nèi)的活性氧量增加，這也顯示了由于TDP-43 的表達(dá)水平的增加而使細(xì)胞毒性增加。
【權(quán)利要求】
1. 一種與TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43的細(xì)胞內(nèi)存在量相關(guān)聯(lián)的疾患的認(rèn)定方法，其特征 在于，包括： 測(cè)定工序，測(cè)定來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞內(nèi)的以下（a)?（e)中的至少一項(xiàng)、以及 認(rèn)定工序，將由所述測(cè)定工序獲得的測(cè)定值與來(lái)自健康個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)的對(duì)應(yīng)的測(cè)定值 相比較，在兩者的值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異的情況下，將該檢測(cè)對(duì)象認(rèn)定為罹患了所述 疾患， (a) 選自 mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及 mt-tRNA PM中的至少一種 mt-tRNA 的 存在量、 (b) 谷氨酸和/或天冬氨酸的存在量、 (c) ATP或者活性氧的存在量、 (d) 選自Aralarl、Aralar2、GDH以及Musashi2中的至少一種多肽與TAR DNA結(jié)合蛋 白質(zhì)-43的結(jié)合量、或者 (e) 選自 mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及 mt-tRNA PM中的至少一種 mt-tRNA 與 TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43的結(jié)合量。
2. 如權(quán)利要求1所述的認(rèn)定方法，其特征在于： 所述疾患是將來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞內(nèi)的TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)43的存在量與來(lái)自健康 個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)的該存在量相比較，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著增加的疾患。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的認(rèn)定方法，其特征在于： 所述TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43是在序列號(hào)1所示氨基酸序列中，以起始蛋氨酸為1位 時(shí)，具有 90位的丙氨酸被纈氨酸（A90V)取代的突變、 169位的天冬氨酸被甘氨酸（D169G)取代的突變、 267位的天冬酰胺被絲氨酸（N267S)取代的突變、 287位的甘氨酸被絲氨酸（G287S)取代的突變、 290位的甘氨酸被丙氨酸（G290A)取代的突變、 292位的絲氨酸被天冬酰胺（S292N)取代的突變、 294位的甘氨酸被丙氨酸（G294A)取代的突變、 294位的甘氨酸被纈氨酸（G294V)取代的突變、 295位的甘氨酸被精氨酸（G295R)取代的突變、 295位的甘氨酸被絲氨酸（G295S)取代的突變、 298位的甘氨酸被絲氨酸（G298S)取代的突變、 311位的蛋氨酸被纈氨酸（M311V)取代的突變、 315位的丙氨酸被蘇氨酸（A315T)取代的突變、 315位的丙氨酸被谷氨酸（A315E)取代的突變、 331位的谷氨酰胺被賴氨酸（Q331K)取代的突變、 332位的絲氨酸被天冬酰胺（S332N)取代的突變、 335位的甘氨酸被天冬氨酸（G335D)取代的突變、 337位的蛋氨酸被纈氨酸（M337V)取代的突變、 343位的谷氨酰胺被精氨酸（Q343R)取代的突變、 345位的天冬酰胺被賴氨酸（N345K)取代的突變、 348位的甘氨酸被半胱氨酸（G348C)取代的突變、 352位的天冬酰胺被絲氨酸（N352S)取代的突變、 352位的天冬酰胺被蘇氨酸（N352T)取代的突變、 357位的甘氨酸被絲氨酸（G357S)取代的突變、 361位的精氨酸被絲氨酸（R361S)取代的突變、 363位的脯氨酸被丙氨酸（P363A)取代的突變、 378位的天冬酰胺被天冬氨酸（N378D)取代的突變、 379位的絲氨酸被半胱氨酸（S379C)取代的突變、 379位的絲氨酸被脯氨酸（S379P)取代的突變、 382位的丙氨酸被脯氨酸（A382P)取代的突變、 382位的丙氨酸被蘇氨酸（A382T)取代的突變、 383位的異亮氨酸被纈氨酸（I383V)取代的突變、 384位的甘氨酸被精氨酸（G384R)取代的突變、 390位的天冬酰胺被天冬氨酸（N390D)取代的突變、 390位的天冬酰胺被絲氨酸（N390S)取代的突變、 或393位的絲氨酸被亮氨酸（S393L)取代的突變， 或者， 374位的酪氨酸以后缺失的突變。
4. 如權(quán)利要求3所述的認(rèn)定方法，其特征在于： 所述突變是D169G、G298S或者R361S。
5. 如權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的認(rèn)定方法，其特征在于： 所述疾患是神經(jīng)系統(tǒng)疾患。
6. 如權(quán)利要求5所述的認(rèn)定方法，其特征在于： 所述疾患選自肌萎縮側(cè)索硬化癥、阿爾茨海默病、帕金森病以及額顳葉變性癥。
7. -種降低細(xì)胞內(nèi)天冬氨酸、谷氨酸、ATP或者活性氧的存在量的藥劑的制造方法，其 特征在于，包括： 導(dǎo)入工序，將藥劑候補(bǔ)物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)； 測(cè)定工序，測(cè)定含有所述藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的細(xì)胞和不含所述藥劑候補(bǔ)物質(zhì)的細(xì)胞中的所 述天冬氨酸、谷氨酸、ATP或者活性氧的存在量； 選擇工序，比較所述測(cè)定工序中獲得的兩種細(xì)胞的測(cè)定值，在含有所述藥劑候補(bǔ)物質(zhì) 的細(xì)胞的測(cè)定值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著低的情況下，選擇該藥劑候補(bǔ)物質(zhì)作為目的藥劑。
8. -種TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43結(jié)合抑制劑的制造方法，其特征在于，包括： 混合工序，將下述（a)和/或（b)和TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43與藥劑候補(bǔ)物質(zhì)一起混 合， (a) 選自 mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及 mt-tRNA Pr。的至少一種 mt-tRNA， (b) 選自Aralarl、Aralar2、GDH以及Musashi2的至少一種蛋白質(zhì)； 檢測(cè)工序，檢測(cè)所述mt-tRNA和/或所述蛋白質(zhì)與所述TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43的結(jié) 合量； 選擇工序，在所述結(jié)合未被檢測(cè)的情況下，或者被檢測(cè)的結(jié)合量與不存在所述藥劑候 補(bǔ)物質(zhì)時(shí)所對(duì)應(yīng)的mt-tRNA和/或蛋白質(zhì)與TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43的結(jié)合量相比較，兩 者的值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異的情況下，選擇該藥劑候補(bǔ)物質(zhì)作為T(mén)AR DNA結(jié)合蛋白 質(zhì)-43結(jié)合抑制劑。
9. 如權(quán)利要求8所述的制造方法，其特征在于： 所述藥劑候補(bǔ)物質(zhì)是在所述（a)所示的mt-tRNA或者所述（b)所示的蛋白質(zhì)之間，與 TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的物質(zhì)。
10. 如權(quán)利要求8所述的制造方法，其特征在于： 所述藥劑候補(bǔ)物質(zhì)是降低細(xì)胞內(nèi)的活性狀態(tài)的所述（a)所示的mt-tRNA或者所述（b) 所示的蛋白質(zhì)的存在量的物質(zhì)。
11. 如權(quán)利要求9或10所述的制造方法，其特征在于： 所述藥劑候補(bǔ)物質(zhì)是核酸分子、肽或者低分子化合物。
12. 如權(quán)利要求11所述的制造方法，其特征在于： 所述藥劑候補(bǔ)物質(zhì)是下述（a)、（b)、（c)或者（d): (a) 含有由序列號(hào)2、4或5所示的氨基酸序列組成的多肽的100個(gè)氨基酸以下的多肽、 (b) 含有在序列號(hào)2、4或5所示的氨基酸序列中包含1?3個(gè)氨基酸的添加、缺失或取 代的多肽的130個(gè)氨基酸以下的多肽、 (c) 由與序列號(hào)2、4或5所示的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列組成 的多肽、 (d) 由序列號(hào)2、4或5所示的氨基酸序列組成的多肽的一部分。
13. 如權(quán)利要求11所述的制造方法，其特征在于： 所述藥劑候補(bǔ)物質(zhì)是與含有由TGG或UGG以及/或者GTT或GUU組成的堿基序列的 5?50個(gè)堿基的核酸分子結(jié)合的、由下述（a)、（b)或（c)構(gòu)成的由9?20個(gè)氨基酸組成 的肽， (a) 由序列號(hào)2所示的氨基酸序列組成的肽的一部分、 (b) 由序列號(hào)2所示的氨基酸序列中含有1?3個(gè)氨基酸的添加、缺失或取代的肽的一 部分、 (c) 由與序列號(hào)2所示的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列組成的肽的 一部分。
14. 如權(quán)利要求7?11中任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于： 所述TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43是在序列號(hào)1所示氨基酸序列中，以起始蛋氨酸為1位 時(shí)，具有 A90V、D169G、N267S、G287S、G290A、S292N、G294A、G294V、G295R、G295S、G298S、 M311V、A315T、A315E、Q331K、S332N、G335D、M337V、Q343R、N345K、G348C、N352S、N352T、 G357S、R361S、P363A、N378D、S379C、S379P、A382P、A382T、I383V、G384R、N390D、N390S 或 S393L的突變，或者具有374位的酪氨酸以后缺失的突變。
15. 如權(quán)利要求13所述的制造方法，其特征在于： 所述突變是D169G、G298S或者R361S。
16. 如權(quán)利要求7?15中任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于： 權(quán)利要求7所述的降低氨基酸、ATP或者活性氧的細(xì)胞內(nèi)存在量的藥劑或者權(quán)利要求 8?15中任一項(xiàng)所述的TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43結(jié)合抑制劑是與TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43 的細(xì)胞內(nèi)存在量相關(guān)聯(lián)的疾患治療劑的有效成分。
17. 如權(quán)利要求16所述的制造方法，其特征在于： 所述與TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43的細(xì)胞內(nèi)存在量相關(guān)聯(lián)的疾患是，將來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的 細(xì)胞內(nèi)的TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)43的存在量與來(lái)自健康個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)的該存在量相比較，在 統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著增加的疾患。
18. 如權(quán)利要求16或17所述的制造方法，其特征在于： 所述疾患是神經(jīng)系統(tǒng)疾患。
19. 如權(quán)利要求18所述的制造方法，其特征在于： 所述疾患選自肌萎縮側(cè)索硬化癥、阿爾茨海默病、帕金森病以及額顳葉變性癥。
20. -種TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43結(jié)合抑制劑，其特征在于： 其含有兩個(gè)以上由TG或UG和/或GT或⑶組成的堿基序列，抑制mt-tRNAAsn、 mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu或者mt-tRNA PM與TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43的結(jié)合，由5?50個(gè)堿 基的核酸分子組成。
21. 如權(quán)利要求20所述的TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43結(jié)合抑制劑，其特征在于： 其含有兩個(gè)以上由TGG或UGG以及/或者GTT或GUU組成的堿基序列，由6?50個(gè)堿 基的核酸分子組成。
22. 如權(quán)利要求20或21所述的TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43結(jié)合抑制劑，其特征在于： 所述堿基序列含有連續(xù)的重復(fù)序列。
23. 如權(quán)利要求22所述的TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43結(jié)合抑制劑，其特征在于： 所述重復(fù)次數(shù)為3?20次。
24. 如權(quán)利要求23所述的TAR DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-43結(jié)合抑制劑，其特征在于： 含有序列號(hào)43、45或者46所示的堿基序列。
【文檔編號(hào)】G01N33/15GK104520439SQ201380022540
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月28日
【發(fā)明者】高橋信弘, 泉川桂一, 石川英明, 吉川治孝, 礒邊俊明, 田岡萬(wàn)悟, 中山洋 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人東京農(nóng)工大學(xué), 公立大學(xué)法人首都大學(xué)東京, Lsip基金運(yùn)營(yíng)聯(lián)合公司