一種共擔(dān)載阿霉素和trail的白蛋白納米粒靶向制劑及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種載藥制劑及制備方法，特別是涉及一種共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《全球癌癥報(bào)告2014》預(yù)測，全球癌癥病例將呈現(xiàn)迅猛增長態(tài)勢，由2012年的1400萬人，逐年遞增至2025年的1900萬人，至2035年人數(shù)將增加到2400萬人。新增病例有近一半出現(xiàn)在亞洲，其中大部分在中國，中國每年新增癌癥患者307萬，死亡220萬，分別占全球總量的21.9%和26.8%。因此，抗腫瘤藥物的市場近年增長迅速，全球2008年到2013年的復(fù)合增長率7.2%，在中國這一復(fù)合增長率達(dá)到20.4%，遠(yuǎn)高于全球增長水平。
[0003]當(dāng)前治療的缺陷，化療是癌癥治療的有效手段，一般的化療藥物有極高的生物毒性而缺乏生物選擇性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，亦殺傷正常組織細(xì)胞。由于非特異毒性、缺乏腫瘤選擇性以及腫瘤的多藥耐藥性，對腫瘤的治療不能達(dá)到令人滿意的效果，甚至可能造成病人無法耐受而被迫停藥。因此如何利用載體輸送手段提高藥物的腫瘤靶向特異性，提高腫瘤組織對化療藥物的敏感性以及降低系統(tǒng)毒性成為研究的熱點(diǎn)。
[0004]美國生命科學(xué)公司(American B1science)開發(fā)的革El向化療藥物-無溶劑型紫杉醇白蛋白納米粒Abraxane?的問世激發(fā)了人們對白蛋白納米粒作為抗腫瘤藥物載體的研究熱情。白蛋白具有安全無毒、無免疫原性、可生物降解、生物相容性好等特點(diǎn)，其獨(dú)特的靶向性和緩釋特性，使其在抗腫瘤藥物載體方面具有廣闊的應(yīng)用前景。然而這種靶向作用相對較弱，且其耐藥腫瘤細(xì)胞療效較差，限制了其應(yīng)用。為了進(jìn)一步提高藥物的靶向治療作用，研究者在白蛋白外層偶聯(lián)或吸附腫瘤特異性親和配體使其具有主動(dòng)靶向性。葉酸是葉酸受體的天然配體，而后者在多數(shù)惡性腫瘤中的表達(dá)明顯高于正常細(xì)胞。
[0005]因此，本發(fā)明以葉酸介導(dǎo)白蛋白納米粒的腫瘤主動(dòng)靶向，可以顯著提高制劑在腫瘤部位的富集。
[0006]近年來，納米載體共載化療藥物與基因藥物的研究屢見報(bào)道，特別是在多藥耐藥(multidurg-resistance, MDR)腫瘤研究領(lǐng)域。共載基因與化療藥物聯(lián)合治療癌癥，相對傳統(tǒng)化療，該方法可以減少化療藥物的使用劑量，增加藥物在靶器官的分布量，以達(dá)到減輕毒副作用及提高療效的目的。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)是腫瘤壞死因子(TNF)家族成員之一，能選擇性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡，而對正常組織無毒性，有望成為腫瘤治療的新方法，備受人們的關(guān)注。TRAIL單獨(dú)使用較易發(fā)生耐藥，其與化療藥物(如依托泊苷、順鉑、阿霉素和5-氟尿嘧啶)聯(lián)合均可見協(xié)同或累加效應(yīng)，能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
[0007]本發(fā)明涉及的白蛋白納米粒的另一個(gè)特點(diǎn)是具有腫瘤pH敏感釋藥特性，而且是逐級釋放所裝載的阿霉素和TRAIL，這主要是得益于層層自組裝(Layer-By-Layer SelfAssembly)制備技術(shù)的優(yōu)勢。首先制備載阿霉素的白蛋白納米粒，然后在白蛋白表面首先吸附一層聚乙烯亞胺PEI (帶正電荷)，接著加入?yún)f(xié)同抗癌劑TRAIL，最后在外層再吸附一層羧甲基殼聚糖-葉酸復(fù)合物CMCS-FA (帶負(fù)電荷)。該設(shè)計(jì)的優(yōu)勢是除了葉酸可以起到腫瘤靶向作用增加納米粒子在腫瘤富集外，外層的羧甲基殼聚糖還可以掩蔽PEI的正電荷，降低載體的毒性，而且在腫瘤細(xì)胞外的PH條件下羧甲基殼聚糖層恰好可以脫落，首先釋放出TRAIL被腫瘤細(xì)胞外層的受體識別后，引起腫瘤細(xì)胞凋亡，而暴露出的PEI使納米粒產(chǎn)生電荷翻轉(zhuǎn)，由負(fù)變正，提高了與細(xì)胞的親和力，促進(jìn)載體的細(xì)胞內(nèi)吞。此外，PEI在細(xì)胞內(nèi)溶酶體捕獲質(zhì)子，引起溶酶體破裂，釋放出阿霉素，進(jìn)一步殺傷腫瘤細(xì)胞，因此產(chǎn)生協(xié)同抗癌作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑及制備方法，該白蛋白納米粒制劑具有葉酸介導(dǎo)的主動(dòng)革巴向和腫瘤pH敏感釋藥的特點(diǎn)，該制備方法具有簡單易行，可層層組裝包載藥物，使活性藥物在腫瘤部位逐級釋放，產(chǎn)生協(xié)同抗癌作用的特點(diǎn)。
[0009]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑，該制劑由鹽酸阿霉素DOX.Η(:1、人腫瘤壞死因子細(xì)胞凋亡配體TRAIL、牛血清白蛋白BSA、聚乙烯亞胺ΡΕΙ、羧甲基殼聚糖-葉酸偶聯(lián)物CMCS-FA以及注射用水、交聯(lián)劑等制成的包載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向給藥系統(tǒng)；其中，所述白蛋白溶液濃度為1.0-5.0% (克/毫升)，阿霉素濃度
0.001%-0.1% (克/毫升)，白蛋白溶液pH值4.0-9.0 ,TRAIL和DOX的質(zhì)量比為10:1-1:10，PEI和CMCS的質(zhì)量比為1:2-1:6。
[0010]所述的共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑，其使用的聚乙烯亞胺為線性或分枝狀結(jié)構(gòu)，分子量在2 -25 kDa。
[0011]所述的共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑，其使用的羧甲基殼聚糖的粘均分子量在20~100 kDa，脫乙酰度在80%~90%，羧甲基取代度在60%~80%。
[0012]所述的共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑，其使用的交聯(lián)劑為戊二醛。
[0013]一種共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑的制備方法，所述方法包括以下制備步驟:
(O制備載阿霉素的白蛋白納米粒
采用去溶劑交聯(lián)法制備阿霉素白蛋白納米粒，取BSA適量配制水溶液，用I摩爾每升的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至8.0。取BSA溶液I毫升，攪拌下向其滴加鹽酸阿霉素乙醇溶液4毫升，加入速度10毫升/分。然后，在攪拌下向上述溶液滴加4%的戊二醛乙醇溶液，繼續(xù)攪拌2小時(shí)后，轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)，在40°C真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20分鐘以除去乙醇；得到的產(chǎn)物經(jīng)10 0C,14000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心10分鐘，除去離心上清液，再用蒸餾水重復(fù)洗滌離心兩次，棄去上清液得到納米粒；然后向納米粒中添加適量蒸餾水，渦旋分散，得到載阿霉素的白蛋白納米粒；
(2)羧甲基殼聚糖-葉酸偶聯(lián)物(CMCS-FA)的合成:
取0.2克葉酸(FA)溶于10毫升二甲基亞砜中，向其中加入0.1克的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS )和0.2 g的N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(FA/NHS/DCC摩爾比為1:2:2 )，室溫活化反應(yīng)12小時(shí)，直到葉酸全部溶解；向上述溶液中加入1%的羧甲基殼聚糖(CMCS)的磷酸鹽緩沖液和1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽EDC (CMCS/FA/EDC摩爾比為1:1:1)，繼續(xù)室溫避光攪拌16小時(shí)；然后向溶液中滴加氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至9.0，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液透析24小時(shí)，然后用水透析24小時(shí)后，凍干處理；
(3)制備共包載阿霉素和TRAIL的葉酸靶向白蛋白納米粒:
利用層層自組裝技術(shù)制備共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的納米粒；取載阿霉素的白蛋白納米粒溶液I毫升，向其中加入0.25% PEI水溶液0.1毫升使納米粒表面電荷由負(fù)變正，攪拌混勻后加入10微克/毫升的TRAIL溶液，攪拌均勻后再加入1.5毫克/毫升的CMCS-FA溶液(pH8.0磷酸鹽緩沖液配制)使納米粒電荷由正變負(fù)，室溫?cái)嚢?0分鐘，即得。
[0014]所述的一種共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑的制備方法，步驟(I)中所述BSA溶液濃度為1.0-5.0% (克/毫升)，優(yōu)選為1.0-2.0%。
[0015]所述的一種共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑的制備方法，步驟(I)中所述阿霉素濃度0.001%-0.1% (克/毫升)，優(yōu)選為0.01-0.05%。
[0016]所述的一種共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑的制備方法，