產(chǎn)生線性pH梯度的緩沖液試劑盒和方法背景離子交換色譜法（IEC）是用于帶電分子的化學(xué)分析和分離的一種廣泛使用的分析技術(shù)。IEC涉及從存在于一種樣品中的其他基質(zhì)組分中分離一種或多種分析物物質(zhì)。這些分析物典型地是離子的以使得它們可以具有一種與固定相的離子相互作用。在IEC中，該固定相是使用將以不同親和力水平理想地結(jié)合這些分析物和基質(zhì)組分的離子部分進(jìn)行衍生化的。將一種洗脫液滲透穿過(guò)該固定相并且與這些分析物和基質(zhì)組分競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合離子部分。該洗脫液是用于描述被泵入到一個(gè)色譜柱入口中的一種液體溶液或緩沖溶液的一個(gè)術(shù)語(yǔ)。在此競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程中，這些分析物和基質(zhì)組分將隨著時(shí)間變化而從該固定相上洗脫出來(lái)并且隨后在一個(gè)檢測(cè)器上進(jìn)行檢測(cè)。一些典型檢測(cè)器的實(shí)例是一臺(tái)電導(dǎo)率檢測(cè)器、一臺(tái)UV-VIS分光光度計(jì)以及一臺(tái)質(zhì)譜儀。多年以來(lái)，IEC已經(jīng)發(fā)展成適用于為如水質(zhì)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品分析、藥學(xué)以及生物技術(shù)的各種行業(yè)建立一個(gè)更健康、更干凈以及更安全的環(huán)境的一種強(qiáng)大的分析工具，在該環(huán)境下可以分離和分析復(fù)雜樣品混合物。在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中，在開(kāi)發(fā)基于蛋白質(zhì)的治療藥物方面已存在眾多突破性發(fā)現(xiàn)。單克隆抗體（MAb）代表已成功治療多種疾病如克羅恩氏?。–rohn’sdisease）、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkinlymphoma）以及轉(zhuǎn)移性乳腺癌的一種特定類型的蛋白質(zhì)治療劑。考慮到過(guò)去在MAb技術(shù)方面的成功，在開(kāi)發(fā)MAb技術(shù)的新治療性應(yīng)用方面并且更具體地說(shuō)在加速發(fā)現(xiàn)、開(kāi)發(fā)和篩選工序方面存在持續(xù)的興趣，這迄今為止一直是昂貴且耗費(fèi)時(shí)間的。由于如C-端賴氨酸截?cái)?、N-端焦谷氨酸形成、脫酰胺基作用、唾液酸化作用、糖化作用、以及糖基化作用的修飾，所以重組MAb是高度異質(zhì)的。這些修飾中的一些可以引起MAb的電荷的一種變化。例如，脫酰胺基作用和唾液酸化作用將在MAb上引入帶負(fù)電荷的酸性部分。通過(guò)一個(gè)C-端賴氨酸截?cái)嗫梢孕纬梢唤M帶正電荷的MAb變體。傳統(tǒng)上，用于陽(yáng)離子交換色譜的一個(gè)洗脫液鹽梯度已經(jīng)用于表征MAb電荷變體。然而，每當(dāng)一個(gè)新MAb候選物需要表征時(shí)，方法開(kāi)發(fā)常常需 要配置鹽梯度和分離參數(shù)。例如，此類參數(shù)可包括緩沖鹽類型、緩沖鹽濃度、非緩沖鹽類型、非緩沖鹽濃度、流速、建立與多種洗脫溶液組分成比例的變化的時(shí)間特征曲線、以及每單位時(shí)間的pH變化率。申請(qǐng)人們相信，存在開(kāi)發(fā)一種緩沖液試劑盒和系統(tǒng)的需要，該緩沖液試劑盒和系統(tǒng)可以在一個(gè)廣泛pH范圍上提供一個(gè)線性pH梯度并且可以用于表征廣泛多種蛋白質(zhì)（例如，MAb）而幾乎沒(méi)有為每種新候選物修改這些分離參數(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
一種緩沖液試劑盒包含一種第一洗脫溶液和一種第二洗脫溶液。該第一洗脫溶液包含至少四種緩沖鹽，其中這四種緩沖鹽中的至少三種是一種單價(jià)緩沖鹽、在6至10的pH范圍上具有一個(gè)凈負(fù)電荷或一個(gè)凈中性兩性離子電荷、并且包含一個(gè)磺酸基和一個(gè)胺，其中該第一洗脫溶液具有6的一個(gè)第一pH和大于25毫摩爾的一個(gè)總緩沖鹽濃度。該第二洗脫溶液包含至少四種緩沖鹽，其中這四種緩沖鹽中的至少三種是一種單價(jià)緩沖鹽、在6至10的pH范圍上具有一個(gè)凈負(fù)電荷或一個(gè)凈中性兩性離子電荷、并且包含一個(gè)磺酸基和一個(gè)胺，其中該第二洗脫溶液具有10的一個(gè)第二pH和大于25毫摩爾的一個(gè)總緩沖鹽濃度。該緩沖液試劑盒基于時(shí)間和pH值的函數(shù)提供了一個(gè)線性pH梯度，該線性pH梯度針對(duì)至少pH6至pH10的pH范圍形成一條近似直線。關(guān)于上述緩沖液試劑盒，該第一洗脫溶液和該第二洗脫溶液可各自進(jìn)一步包含一種單價(jià)非緩沖離子鹽。該單價(jià)非緩沖離子鹽可以是氯化鈉、甲磺酸鈉、氯化鉀或其組合并且具有15毫摩爾或更大的一個(gè)濃度。關(guān)于上述緩沖液試劑盒的該第一洗脫溶液，該至少四種緩沖鹽中的最高緩沖液濃度不大于該至少四種緩沖鹽中的最低緩沖液濃度的60%以上。類似地，對(duì)于該第二洗脫溶液，該至少四種緩沖鹽中的最高緩沖液濃度不大于該至少四種緩沖鹽中的最低緩沖液濃度的60%以上。關(guān)于上述緩沖液試劑盒，該第一洗脫溶液或該第二洗脫溶液的該四種緩沖鹽可包含一種第一緩沖鹽、一種第二緩沖鹽、一種第三緩沖鹽、以及一種第四緩沖鹽。該第一、第二、第三以及第四緩沖鹽可分別為2-(N-嗎啉代)乙磺酸鹽（MES）、3-(N-嗎啉代)丙磺酸鹽（MOPS）、N-[三(羥甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸鹽 （TAPS）以及3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽（CAPSO）?？商娲?，該第一、第二、第三以及第四緩沖鹽可分別為2-(N-嗎啉代)乙磺酸鹽（MES）、2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙磺酸鹽（BES）、(三(羥甲基)甲基氨基)丙烷-1-磺酸鹽（TAPS）以及3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽（CAPSO）。關(guān)于上述緩沖液試劑盒，該至少四種緩沖鹽在6至10的pH范圍上各自具有一個(gè)凈負(fù)電荷或一個(gè)凈中性電荷。關(guān)于上述緩沖液試劑盒，該至少四種緩沖鹽中的一種是選自由TRIS和磷酸鹽組成的組。關(guān)于上述緩沖液試劑盒，該第一洗脫溶液和第二洗脫溶液的該至少四種緩沖鹽各自包含具有一個(gè)第一pKa的一種第一緩沖鹽、具有一個(gè)第二pKa的一種第二緩沖鹽、具有一個(gè)第三pKa的一種第三緩沖鹽、以及具有一個(gè)第四pKa的一種第四緩沖鹽。該第一pKa是這四個(gè)pKa值中最小的并且該第四pKa是這四個(gè)pKa值中最大的，其中該第一pKa與該第一pH值相同并且該第四pKa與該第二pH值相同。在該第二pKa與該第一pKa之間的第一差異小于1.5。在該第三pKa與該第二pKa之間的第二差異小于1.5。在該第三pKa與該第四pKa之間的第三差異小于1.5。關(guān)于上述緩沖液試劑盒，針對(duì)pH6至pH10的pH范圍的直線具有大于0.97的一個(gè)相關(guān)系數(shù)。使用一種不同的度量標(biāo)準(zhǔn)，針對(duì)pH6至pH10的pH范圍的直線可以具有小于1.4%的一個(gè)平均絕對(duì)百分比誤差。關(guān)于上述緩沖液試劑盒，該胺可處于質(zhì)子化銨形式。描述了一種采用一種色譜分離裝置使用具有隨著時(shí)間變化從一個(gè)第一pH值至一個(gè)第二pH值的線性pH梯度的一種梯度洗脫液流來(lái)從一種樣品的基質(zhì)組分中分離至少一種分析物的方法。該方法包括將樣品注入到一個(gè)進(jìn)樣閥中，其中該進(jìn)樣閥與該色譜分離裝置處于流體聯(lián)通?？梢詫⒕哂性摰谝籶H值的一種第一洗脫溶液泵入到該色譜分離裝置中。該第一洗脫溶液包含一種第一緩沖鹽、一種第二緩沖鹽、一種第三緩沖鹽、以及一種第四緩沖鹽?？梢詫⒕哂性摰诙H值的一種第二洗脫溶液泵入到該色譜分離裝置中。該第二洗脫溶液包含一種第一緩沖鹽、一種第二緩沖鹽、一種第三緩沖鹽以及一種第四緩沖鹽。對(duì)于該第一和第二洗脫溶液二者，該第一緩沖鹽具有一個(gè)第一pKa，該第二緩沖鹽具有一個(gè)第二pKa，該第三緩沖鹽具有一個(gè)第三pKa，并且該第四緩沖鹽具有一個(gè)第四pKa。該第一pKa是 這四個(gè)pKa值中最小的并且該第四pKa是這四個(gè)pKa值中最大的。該第一pKa與該第一pH值相同并且該第四pKa與該第二pH值相同?？梢赃x擇這些緩沖鹽以使得這些pKa值近似且均勻地跨越在該第一pH值與第二pH值之間。在該第二pKa與該第一pKa之間的一個(gè)第一差異是小于1.5，在該第三pKa與該第二pKa之間的一個(gè)第二差異是小于1.5，并且在該第三pKa與該第四pKa之間的一個(gè)第三差異是小于1.5。泵入的第一洗脫溶液與泵入的第二洗脫溶液的比例可以隨著時(shí)間變化而變化。基于時(shí)間和pH值的函數(shù)可以產(chǎn)生一個(gè)線性pH梯度，該線性pH梯度形成從該第一pH值至該第二pH值的一條近似直線。通過(guò)該色譜分離裝置可以洗脫該樣品。該分析物可以從該樣品的多種基質(zhì)組分中分離。隨后可以在一個(gè)檢測(cè)器中檢測(cè)該分析物。關(guān)于上述方法，該線性pH梯度是具有大于0.97的一個(gè)相關(guān)系數(shù)的一條近似直線，其中該第一pH值是6并且該第二pH值是10。使用一種不同的度量標(biāo)準(zhǔn)，該線性pH梯度是具有小于1.4%的一個(gè)平均絕對(duì)百分比誤差的一條近似直線，其中該第一pH值是6并且該第二pH值10。關(guān)于上述方法，在產(chǎn)生該線性pH梯度的步驟的同時(shí)產(chǎn)生一個(gè)線性電導(dǎo)率梯度。產(chǎn)生的線性pH梯度具有隨著時(shí)間變化而增加的pH值并且產(chǎn)生的線性電導(dǎo)率梯度具有隨著時(shí)間變化而增加的電導(dǎo)率值。關(guān)于上述方法，該色譜分離裝置包含一種陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，其中用于該第一和第二洗脫溶液的這些緩沖鹽中的每一種都不結(jié)合該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。關(guān)于上述方法，該分析物包含一種抗體。關(guān)于上述方法，在該色譜分離裝置中形成所產(chǎn)生的線性pH梯度。關(guān)于上述方法，該第一緩沖鹽包括2-(N-嗎啉代)乙磺酸鹽。該第二緩沖鹽可以選自2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙磺酸鹽、MOPS、或磷酸鹽。該第三緩沖鹽可以選自N-[三(羥甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸鹽或TRIS。該第四緩沖鹽可以是3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽。關(guān)于上述方法，該第一洗脫溶液和第二洗脫溶液進(jìn)一步包含一種單價(jià)非緩沖離子鹽。該單價(jià)非緩沖離子鹽可以選自氯化鈉、氯化鉀、甲磺酸鈉、或其組合。關(guān)于上述方法，該第一pH值是6并且該第二pH值是10。該第一 和第二洗脫溶液可各自具有大于25毫摩爾的一個(gè)總緩沖鹽濃度。該單價(jià)非緩沖離子鹽可具有15毫摩爾或更大的一個(gè)濃度。關(guān)于上述方法，對(duì)于該第一洗脫溶液，該四種緩沖鹽的最高緩沖液濃度不大于該四種緩沖鹽的最低緩沖液濃度的60%以上。類似地，對(duì)于該第二洗脫溶液，該四種緩沖鹽的最高緩沖液濃度不大于該四種緩沖鹽的最低緩沖液濃度的60%以上。關(guān)于上述方法，在將該第一洗脫溶液和該第二洗脫溶液泵入到該色譜分離裝置中之前，可以將該第一洗脫溶液與該第二洗脫溶液混合在一起。關(guān)于上述方法，可以將兩種或更多種溶液源輸入到一個(gè)泵中。兩種或更多種溶液源一起的一個(gè)組合包含該第一洗脫溶液的該第一緩沖鹽、該第二緩沖鹽、該第三緩沖鹽、以及該第四緩沖鹽。另外，該第一洗脫溶液可以由兩種或更多種溶液源形成。類似地，該第二洗脫溶液可以由兩種或更多種溶液源形成。關(guān)于上述方法，這些緩沖鹽中的每一種都是一種單價(jià)緩沖鹽、在從第一pH值至第二pH值的pH范圍上具有一個(gè)凈負(fù)電荷或一個(gè)凈中性兩性離子電荷、并且包含一個(gè)磺酸基和一個(gè)胺。關(guān)于上述方法，該胺可處于質(zhì)子化銨形式。在一種緩沖液試劑盒的一個(gè)第二實(shí)施例中，它包含一種第一洗脫溶液和一種第二洗脫溶液。該第一洗脫溶液由一種第一緩沖鹽、一種第二緩沖鹽、一種第三緩沖鹽、一種第四緩沖鹽以及一種單價(jià)非緩沖離子鹽組成。該第一洗脫溶液具有6的一個(gè)第一pH和大于25毫摩爾的一個(gè)總緩沖鹽濃度。該第二洗脫溶液由一種第一緩沖鹽、一種第二緩沖鹽、一種第三緩沖鹽、一種第四緩沖鹽以及一種單價(jià)非緩沖離子鹽組成。該第二洗脫溶液具有10的一個(gè)第二pH和大于25毫摩爾的一個(gè)總緩沖鹽濃度。這些緩沖鹽中的每一種都是一種單價(jià)緩沖鹽、具有一個(gè)凈負(fù)電荷或一個(gè)凈中性兩性離子電荷、并且包含一個(gè)磺酸基和一個(gè)胺。關(guān)于該緩沖液試劑盒的第二實(shí)施例，該第一洗脫溶液和第二洗脫溶液的四種緩沖鹽各自包含具有一個(gè)第一pKa的一種第一緩沖鹽、具有一個(gè)第二pKa的一種第二緩沖鹽、具有一個(gè)第三pKa的一種第三緩沖鹽以及具有一個(gè)第四pKa的一種第四緩沖鹽。該第一pKa是這四個(gè)pKa值中最小的并且該第四pKa是這四個(gè)pKa值中最大的。該第一pKa與該第一pH值相同并且該第四pKa與該第二pH值相 同。該至少四種緩沖鹽在該第二pKa與該第一pKa之間具有小于1.5的一個(gè)第一差異、在該第三pKa與該第二pKa之間具有小于1.5的一個(gè)第二差異、并且在該第三pKa與該第四pKa之間具有小于1.5的一個(gè)第三差異。關(guān)于該緩沖液試劑盒的第二實(shí)施例，對(duì)于該第一洗脫溶液，該四種緩沖鹽的最高緩沖液濃度不大于該四種緩沖鹽的最低緩沖液濃度的60%以上。類似地，對(duì)于該第二洗脫溶液，該四種緩沖鹽的最高緩沖液濃度不大于該四種緩沖鹽的最低緩沖液濃度的60%以上。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明結(jié)合在此并構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)的一部分的附圖說(shuō)明了本發(fā)明目前優(yōu)選的實(shí)施例，并且與上文給出的一般說(shuō)明和下文給出的詳細(xì)說(shuō)明一起用于解釋本發(fā)明的特征（其中相似數(shù)字代表相似元件）。圖1是示出了使用包含MES、BES、TAPS以及CAPSO的緩沖鹽的一種緩沖液試劑盒的測(cè)量的pH值隨著時(shí)間變化的圖。圖2是使用圖1的緩沖液試劑盒并示出一種蛋白質(zhì)樣品中的多個(gè)峰的保留時(shí)間和相應(yīng)pH值的色譜圖。圖3是示出了使用包含MES、MOPS、TAPS以及CAPSO的緩沖鹽的一種緩沖液試劑盒的測(cè)量的pH值隨著時(shí)間變化的圖。圖4是示出了使用包含MES、BES、TRIS以及CAPSO的緩沖鹽的一種緩沖液試劑盒的測(cè)量的pH值隨著時(shí)間變化的圖。圖5是示出了使用包含MES、磷酸鹽、TAPS以及CAPSO的緩沖鹽的一種緩沖液試劑盒的測(cè)量的pH值隨著時(shí)間變化的圖。圖6是比較當(dāng)使用包含圖1的MES、BES、TAPS以及CAPSO的緩沖液試劑盒（箭頭602）和包含圖4的MES、BES、TRIS以及CAPSO的緩沖液試劑盒（箭頭604）時(shí)pH軌跡的線性度的圖。圖7是比較當(dāng)使用包含圖1的MES、BES、TAPS以及CAPSO的緩沖液試劑盒時(shí)六種蛋白質(zhì)組分峰的測(cè)量的pH值隨著相應(yīng)pI值變化的圖。圖8是示出使用包含圖1的MES、BES、TAPS以及CAPSO的緩沖液試劑盒（箭頭802）和包含圖4的MES、BES、TRIS以及CAPSO的緩沖液試劑盒（箭 頭804）的電導(dǎo)率值隨著時(shí)間變化的圖。圖9是在30分鐘時(shí)間段上使用范圍從約pH5.6至10.2的一個(gè)線性pH梯度來(lái)表征一種異質(zhì)MAb樣品的不同電荷變體的一個(gè)示例性色譜圖（902）。軌跡904示出了隨著時(shí)間變化的測(cè)量的pH。圖10是在30分鐘時(shí)間段上使用范圍從約pH6.7至7.9的一個(gè)線性pH梯度來(lái)表征該異質(zhì)MAb樣品的不同電荷變體的一個(gè)示例性色譜圖（1002），其中每單位時(shí)間的pH變化率小于圖9的變化率。軌跡1004示出了隨著時(shí)間變化的測(cè)量的pH。圖11是適用于與在此所述的緩沖液試劑盒一起使用的一個(gè)示例性離子色譜系統(tǒng)。實(shí)施方式的詳細(xì)說(shuō)明以下詳細(xì)說(shuō)明應(yīng)該參考附圖來(lái)閱讀，其中在不同附圖中的相似元件采用相同編號(hào)。不必依比例繪制的這些附圖描繪了選擇的實(shí)施例并且不旨在限制本發(fā)明的范圍。詳細(xì)說(shuō)明通過(guò)舉例的方式而不是限制的方式來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的原理。本說(shuō)明將清楚地使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠制備并使用本發(fā)明，并且描述本發(fā)明的若干實(shí)施例、改編、變化、替代方案以及用途，包括目前被認(rèn)為是執(zhí)行本發(fā)明的最好模式。如在此使用的用于任何數(shù)值或范圍的術(shù)語(yǔ)“約”或“近似”是指出于其在此所述的預(yù)期目的允許組分的部分或集合起作用的一個(gè)適合的尺寸公差。MAb分子的凈電荷可以用作表征和分離一種MAb候選物的一個(gè)基礎(chǔ)。在開(kāi)發(fā)過(guò)程中，一種MAb樣品將典型地包含具有稍微不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)的多種MAb變體。由于可歸結(jié)于酸/堿基團(tuán)的不同凈電荷水平，所以這些MAb變體典型地被稱為電荷變體。在一種典型的樣品中，很多MAb變體將具有一個(gè)單獨(dú)不同的pI值。該pI值代表一個(gè)pH值，在該pH值下特定MAb變體將具有一個(gè)凈中性電荷。該pI值還可以被稱為一個(gè)等電點(diǎn)。與一種特定MAb樣品相關(guān)的一組pI值可提供適用于表征該樣品的一個(gè)指紋。例如，此類指紋圖譜可用于如鑒別、純化、批再現(xiàn)性以及研究特定電荷變體的效力的方法中。應(yīng)注意，在此所述的緩沖液試劑盒不應(yīng)該被限制為僅分析MAb樣品并且他們還可以用于分析各種各樣的蛋白質(zhì)和具有酸/堿部分的其他分子。在從pH6至10的pH值范圍上，多種MAb將針對(duì)此范圍的至少一個(gè)部分典型地具有一個(gè)凈正電荷。出于這個(gè)原因，陽(yáng)離子交換色譜非常適用于分離和表征多種MAb樣品。在一個(gè)實(shí)施例中，可以將一種MAb樣品注入到一個(gè)陽(yáng)離子交換柱中，在該柱中洗脫液最初處于一個(gè)相對(duì)低pH下。這確保大多數(shù)MAb變體是帶正電荷的，并且因此將結(jié)合該陽(yáng)離子交換固定相?？蓪⒁粋€(gè)線性pH梯度施加于該柱以引起pH隨著時(shí)間變化而線性地增加。增加的pH將滴定該MAb上的酸基團(tuán)并引起凈正電荷減少。例如，質(zhì)子化胺基將從正電荷轉(zhuǎn)變?yōu)橹行圆⑶音人峄鶊F(tuán)將從中性轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)電荷。在線性pH梯度中的某一pH下，該凈電荷最后將變?yōu)橹行裕吹入婞c(diǎn)）。當(dāng)該MAb變體具有一個(gè)凈中性電荷時(shí)，該MAb變體對(duì)該陽(yáng)離子交換柱的親和力將顯著減小，并因此將導(dǎo)致它從該柱中洗脫出來(lái)。以下將描述提供一個(gè)線性pH梯度的一種緩沖液試劑盒。該線性pH梯度代表基于時(shí)間變化而變化的pH值，其中在一個(gè)時(shí)間范圍上該pH值針對(duì)至少約pH6至約pH10的pH范圍形成一條近似直線。申請(qǐng)人相信，用于離子交換色譜的一個(gè)線性pH梯度將提供一種用于表征一種MAb樣品的平臺(tái)方法，其中在表征過(guò)程中將需要最少的變化至沒(méi)有變化。申請(qǐng)人還相信，線性pH梯度的直線度對(duì)于當(dāng)使用一個(gè)更窄的pH范圍和每單位時(shí)間減小的pH變化率時(shí)表征這些MAb樣品并且增大分離的分辨率是關(guān)鍵的。在一個(gè)實(shí)施例中，該緩沖液試劑盒可包含一種第一洗脫溶液和一種第二洗脫溶液。注意，一種洗脫溶液可以是用于將一種樣品從一個(gè)離子交換固定相中洗脫出來(lái)的一種溶液。這些洗脫溶液可以裝入到一個(gè)相應(yīng)的液體容器或小瓶中。為了減小運(yùn)輸重量，可按10x濃度來(lái)包裝這些洗脫溶液，其中使用者可在測(cè)試點(diǎn)將其稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛确秶缂s1x范圍。應(yīng)注意，在此描述的緩沖液試劑盒不應(yīng)被限制為僅兩種洗脫溶液并且緩沖液試劑盒可以使用兩種以上的洗脫溶液來(lái)實(shí)施。關(guān)于該第一洗脫溶液，它可以包含至少四種緩沖鹽，其中該四種緩沖鹽中的至少三種具有多種具體的特性，這些特性是a)這些緩沖鹽是單價(jià)緩沖鹽，b)在約6至約10的pH范圍上具有一個(gè)凈負(fù)電荷或一個(gè)凈中性兩性離子電荷，并且c)包含一個(gè)磺酸基和一個(gè)胺。以下將更詳細(xì)地描述具體的特性a)至c)。一種單價(jià)緩沖鹽是僅具有一個(gè)酸/堿部分的一種緩沖液。對(duì)于在此描述的這些緩沖液試劑盒，該酸/堿部分應(yīng)該具有在相關(guān)pH范圍之間內(nèi)的一個(gè)pKa 值，在此情況下該pH范圍是從約pH6至pH10。此外，該單價(jià)緩沖鹽可具有三種電荷狀態(tài)中的僅一種，該三種電荷狀態(tài)是單一正電荷、無(wú)凈電荷（即中性或兩性離子電荷）、或單一負(fù)電荷。申請(qǐng)人相信在四種緩沖鹽中的至少三種是多價(jià)的情況下，該緩沖液試劑盒將提供在不同pH值下變化的緩沖能力，并且反過(guò)來(lái)導(dǎo)致更少的線性pH梯度和一種更難實(shí)施的分離方法。該至少三種緩沖鹽在約6至約10的pH范圍上應(yīng)該各自都包含一個(gè)凈負(fù)電荷抑或凈中性兩性離子電荷以使得該緩沖鹽將不會(huì)與該陽(yáng)離子交換柱牢固締合或者牢固結(jié)合該陽(yáng)離子交換柱。陽(yáng)離子交換材料通常具有用于結(jié)合帶正電荷陽(yáng)離子的一個(gè)負(fù)電荷。因此，由于離子排斥，所以一種帶凈負(fù)電荷的緩沖鹽不會(huì)結(jié)合這些帶負(fù)電荷的陽(yáng)離子交換部分。由于缺乏中性物質(zhì)與帶負(fù)電荷物質(zhì)之間的凈離子吸引，所以一種凈中性帶兩性離子的緩沖鹽不會(huì)結(jié)合帶負(fù)電荷的陽(yáng)離子交換材料。與此相反，由于離子吸引，所以一種帶正電荷的緩沖鹽會(huì)結(jié)合該帶負(fù)電荷的陽(yáng)離子交換材料。一種帶正電荷的緩沖鹽與該陽(yáng)離子交換材料的離子結(jié)合可影響該緩沖鹽的緩沖能力并且妨礙該pH梯度的線性度。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)以允許這些緩沖鹽有效緩沖流動(dòng)相和固定相二者的方式不完全從該固定相中排除而未保留這些緩沖鹽。注意，如果一種緩沖鹽物質(zhì)從該固定相中排除，那么它不能以與未從固定相中排除的其他緩沖鹽相似的方式緩沖該固定相并且?guī)椭疵撛摲治鑫?。另外，由固定相保留的一種緩沖鹽可引起在流動(dòng)相pH與固定相pH之間的一個(gè)偏差，該偏差取決于該緩沖液在該固定相上的保留特征。該至少三種緩沖鹽應(yīng)各自進(jìn)一步包含一個(gè)磺酸基和一個(gè)胺。在一個(gè)實(shí)施例中，該胺基可以是伯胺、仲胺、或叔胺。該緩沖鹽可處于其中來(lái)自該磺酸基的氫使該胺基質(zhì)子化以形成一個(gè)帶正電荷部分和一個(gè)帶負(fù)電荷磺酸基（兩者一起形成一個(gè)兩性離子）的形式。該緩沖鹽還可以處于其中質(zhì)子化胺基具有一個(gè)負(fù)反離子如氯并且該磺酸基具有正反離子如鈉的形式。應(yīng)注意包含一個(gè)磺酸基和一個(gè)胺基的很多緩沖鹽可被稱為“古德緩沖液（Good’sbuffer）”。盡管沒(méi)有以一個(gè)具體緩沖鹽的名稱明確地進(jìn)行描述，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，作為該緩沖鹽名稱的一部分的術(shù)語(yǔ)“磺酸鹽”的指定不應(yīng)將該緩沖鹽限制為僅帶負(fù)電荷的磺酸鹽狀態(tài)并且它在低pH條件下還可以處于磺酸形式。此外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，作為一種緩沖鹽名稱的一部分的術(shù)語(yǔ)“胺 基”的指定不應(yīng)將該緩沖鹽限制為僅中性電荷的游離胺狀態(tài)并且當(dāng)該緩沖液是輕微酸性時(shí)它還可以處于具有一個(gè)反離子的質(zhì)子化銨形式。在一個(gè)實(shí)施例中，該第一洗脫溶液可具有約6的一個(gè)第一pH和大于約25毫摩爾的總緩沖鹽濃度。當(dāng)分離MAb帶電變體時(shí)選擇該第一pH6，因?yàn)樵谠摌悠分械拇蟛糠諱Ab變體具有引起結(jié)合該陽(yáng)離子交換柱的一個(gè)凈正電荷?？梢赃x擇該第一洗脫溶液的緩沖鹽濃度以使得緩沖能力大于MAb樣品和該陽(yáng)離子交換材料二者。該緩沖液試劑盒包含可與該第一洗脫溶液混合以形成一個(gè)線性增加的pH梯度的一種第二洗脫溶液。該第二洗脫溶液可具有大于該第一洗脫溶液的第一pH的一個(gè)第二pH。與該第一洗脫溶液類似，該第二洗脫溶液可包含至少四種緩沖鹽，其中該四種緩沖鹽中的至少三種具有多種具體的特性，這些特性是a)這些緩沖鹽是單價(jià)緩沖鹽，b)在約6至約10的pH范圍上具有一個(gè)凈負(fù)電荷或一個(gè)凈中性兩性離子電荷，并且c)包含一個(gè)磺酸基和一個(gè)胺。該第二洗脫溶液可具有約10的一個(gè)第二pH和大于約25毫摩爾的總緩沖鹽濃度。當(dāng)分離MAb的帶電變體時(shí)選擇該第二pH10，因?yàn)榇蠖鄶?shù)MAb變體將不具有大于10的pI。因此，在從pH6至pH10的一個(gè)線性梯度過(guò)程中，基本上全部的MAb帶電變體將轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)凈中性值，以引起它們從該陽(yáng)離子交換柱中洗脫出來(lái)。與該第一洗脫液相似，可以選擇該第二洗脫溶液的緩沖鹽濃度以使得緩沖能力大于MAb樣品和該陽(yáng)離子交換材料二者。在一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)于該第一洗脫溶液和該第二洗脫溶液二者，該至少四種緩沖鹽可以是相同的化學(xué)物質(zhì)。例如，該第一洗脫溶液和該第二洗脫溶液二者都包含以下四種緩沖鹽，它們是：2-(N-嗎啉代)乙磺酸鹽（MES）、2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙磺酸鹽（BES）、N-[三(羥甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸鹽（TAPS）、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽（CAPSO）。該第一洗脫溶液和第二洗脫溶液的該至少四種緩沖鹽可各自包含具有一個(gè)第一pKa的一種第一緩沖鹽、具有一個(gè)第二pKa的一種第二緩沖鹽、具有一個(gè)第三pKa的一種第三緩沖鹽、以及具有一個(gè)第四pKa的一種第四緩沖鹽。該第一pKa可以是這四個(gè)pKa值中最小的并且該第四pKa可以是這四個(gè)pKa值中最大的?？梢赃x擇這些緩沖鹽以使得該第一pKa與該第一pH值大致相同并且該第四pKa與 該第二pH值大致相同。更具體地說(shuō)，可以選擇這些緩沖鹽以使得該第一pKa處于該第一pH值的0.5pH單位內(nèi)并且該第四pKa處于該第二pH值的0.5pH單位內(nèi)。還可以選擇這些緩沖鹽以使得這些pKa值近似且均勻地跨越在該第一pH值與第二pH值之間。在一個(gè)實(shí)施例中，在該第二pKa與該第一pKa之間存在小于約1.5的一個(gè)第一差異，在該第三pKa與該第二pKa之間存在小于約1.5的一個(gè)第二差異，并且在該第三pKa與該第四pKa之間存在小于約1.5的一個(gè)第三差異?？梢栽趶募s0.5至約1.5pH單位的范圍內(nèi)選擇這四種pKa值的差異以使得存在從該第一pH至該第二pH的一個(gè)相對(duì)一致的緩沖能力。申請(qǐng)人相信，通過(guò)選擇具有提供大致相等的第一、第二、第三差異值的pKa的緩沖鹽將獲得提供線性pH梯度的緩沖液試劑盒。在一個(gè)實(shí)施例中，該第一、第二、第三以及第四pKa值在25℃下可以是約6.1、7.1、8.4以及9.6。應(yīng)注意，在此所說(shuō)明的所有pKa值是相對(duì)于25℃下來(lái)說(shuō)明的，除非特別說(shuō)明在一個(gè)不同的溫度下。在一個(gè)可替代的實(shí)施例中，該第一洗脫溶液的緩沖鹽中的一種或多種可以是一種與該第二洗脫溶液的緩沖鹽不同的化學(xué)物質(zhì)。例如，該第一洗脫溶液可包含MES、BES、TAPS以及CAPSO并且該第二洗脫溶液可包含MES、MOPS、TAPS以及CAPSO。即使該第二洗脫溶液的第二緩沖鹽是一種不同的化學(xué)物質(zhì)，這種緩沖液試劑盒仍將提供一個(gè)線性pH梯度。在一個(gè)實(shí)施例中，可選擇具有邊界條件的該第一洗脫溶液和第二洗脫溶液的緩沖鹽濃度值。例如，這些洗脫溶液可各自具有該至少四種緩沖鹽中的最低緩沖液濃度和最高緩沖液濃度。可以選擇這些緩沖鹽濃度值以使得最高緩沖液濃度不大于最低緩沖液濃度的約60%以上。為該第一洗脫溶液選擇的緩沖鹽濃度值的一個(gè)實(shí)例可包括16mMMES、10mMBES、12mMTAPS以及10mMCAPSO。此時(shí)，最低緩沖鹽濃度是10mM的BES和10mM的CAPSO，并且最高緩沖鹽濃度是16mM的MES。因此，16mMMES不大于10mMBES或CAPSO的60%以上。為該第二洗脫溶液選擇的緩沖鹽濃度值的一個(gè)實(shí)例可包括10mMMES、12mMBES、14mMTAPS、以及16mMCAPSO。此時(shí)，最低緩沖鹽濃度是10mM的MES，并且最高緩沖鹽濃度是16mM的CAPSO。因此，16mMCAPSO不大于10mMMES的60%以上。應(yīng)注意，申請(qǐng)人憑經(jīng)驗(yàn)確定了提供一個(gè)線性pH梯度的緩沖液濃度組并且在此所述的多個(gè)緩沖液試劑盒實(shí)施例不應(yīng)限于緩沖液濃度的這些特定組。可替代地，使用弱酸和弱堿解離常數(shù)以及標(biāo)準(zhǔn)分析方程來(lái)計(jì)算提供一個(gè)線性pH梯度的一組緩沖液濃度也是可能的。然而，此類分析是計(jì)算密集型的，并且因此一種軟件程序可適用于模擬該pH特征曲線或一組特定的緩沖液濃度，例如像在美國(guó)授權(quán)前公開(kāi)號(hào)2012/0239360中描述的軟件程序，該公開(kāi)號(hào)通過(guò)引用結(jié)合在此。在一個(gè)實(shí)施例中，該第一洗脫溶液和該第二洗脫溶液可各自進(jìn)一步包含一種單價(jià)非緩沖離子鹽，例如像氯化鈉、氯化鉀或甲磺酸鈉。該單價(jià)非緩沖離子鹽僅包含具有一種單一電荷的陰離子和陽(yáng)離子，該電荷是正的或負(fù)的。另外，該單價(jià)非緩沖離子鹽不具有提供任何可感知的緩沖能力的弱酸或弱堿功能。例如，該第一洗脫溶液和該第二洗脫溶液可各自包含約15毫摩爾或更大的一個(gè)氯化鈉濃度。申請(qǐng)人相信，單價(jià)非緩沖離子鹽的存在促進(jìn)了離子交換柱上的分離并且還允許使用更低濃度的這些緩沖鹽。作為結(jié)果，可以減小這些緩沖液試劑盒中的緩沖液濃度，這提供了關(guān)于試劑成本的一個(gè)更低成本的系統(tǒng)并且同時(shí)提供了適用于分離蛋白質(zhì)樣品的線性pH梯度。此外，申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)，單價(jià)非緩沖離子鹽的使用傾向于增加分離柱的操作壽命，從而提供進(jìn)一步的成本節(jié)約。該第一和第二洗脫溶液可各自包含至少四種緩沖鹽，其中四種緩沖鹽中的至少三種是選自一種第一緩沖鹽、一種第二緩沖鹽、一種第三緩沖鹽以及一種第四緩沖鹽。該第一緩沖鹽可包括2-(N-嗎啉代)乙磺酸鹽（MES）。該第二緩沖鹽可包括N,N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸鹽（BES）或者3-(N-嗎啉代)丙磺酸鹽（MOPS）。該第三緩沖鹽可包括N-[三(羥甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸鹽（TAPS）或者N-(2-羥乙基)哌嗪-N-(4-丁烷磺酸鹽)（HEPBS）。該第四緩沖鹽可包括3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽（CAPSO）或2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽（CHES）。應(yīng)注意，使用上文所述的第一、第二、第三或第四緩沖鹽的至少三種的任何組合可提供適用于產(chǎn)生從約pH6至約pH10的一個(gè)線性pH梯度的一種緩沖液試劑盒。此外，可以修飾上述緩沖鹽，其中磺酸部分可具有各種烷基鏈長(zhǎng)度，例如像乙基磺酸鹽、丙基磺酸鹽、丁基磺酸鹽以及羥丙基磺酸鹽。應(yīng)注意，上述緩沖鹽是示例性的并且在此所述的用于產(chǎn)生線性pH梯度的這些緩沖液試劑盒不應(yīng)被限制為以上示例性緩沖鹽。在一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)于該第一洗脫溶液和該第二洗脫溶液二者，可以選擇該至少四種緩沖鹽以使得這些緩沖鹽中的一種或多種不具有上文所述的全部具體特性a)至c)。例如，每種緩沖鹽在約6至約10的pH范圍上可具有一個(gè)凈負(fù)電荷或一個(gè)凈中性電荷（特征b)，但是不需要具有特征a)和c)）。這些緩沖鹽中的一種或多種可包括一種或多種以下特征，它們是：是一種多價(jià)緩沖液并且不包含一個(gè)磺酸基和一個(gè)胺二者。例如，這些緩沖鹽之一可以是磷酸鹽。磷酸鹽在約6至約10的pH范圍上僅帶負(fù)電荷、是一種多價(jià)緩沖液、并且不具有一個(gè)胺基或一個(gè)磺酸基。與在此所述的這些緩沖液試劑盒一起使用的磷酸鹽可處于一元堿、二元堿和/或三元堿的形式，其中反離子是鈉和/或鉀。適用于在此所述的緩沖液試劑盒中使用的含有磷酸鹽官能團(tuán)的其他緩沖鹽是焦磷酸鹽和三聚磷酸鹽。在另一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)于該第一洗脫溶液和該第二洗脫溶液二者，這些緩沖鹽中的一種或多種可包括一種或多種以下特征，它們是：在約6至約10的pH范圍上具有一個(gè)凈正電荷或一個(gè)凈中性電荷并且不包含磺酸基。例如，這些緩沖鹽之一可以是三(羥甲基)氨基甲烷（TRIS）。TRIS在約6至約10的pH范圍上可帶中性電荷抑或正電荷并且不具有一個(gè)磺酸基。出人意料的是，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，包含具有一種或多種以下特征（例如是一種多價(jià)緩沖鹽、在約6至10的pH范圍上帶正電荷、不具有一個(gè)磺酸基或者不具有一個(gè)胺）的緩沖鹽不會(huì)顯著干擾該緩沖液試劑盒在該pH范圍上的pH線性度，只要包含各自具有以下特性的至少三種緩沖鹽即可，這些特性是：a)這些緩沖鹽是單價(jià)緩沖鹽，b)在約6至約10的pH范圍上具有一個(gè)凈負(fù)電荷或一個(gè)凈中性兩性離子電荷，以及c)包含一個(gè)磺酸基和一個(gè)胺。因此，將TRIS或磷酸鹽用作在此所述的緩沖液試劑盒中的緩沖鹽之一仍可提供一個(gè)足夠線性的pH梯度。以下將描述一個(gè)與上文所述的實(shí)施例稍微不同的緩沖液試劑盒實(shí)施例。這個(gè)實(shí)施例的不同之處在于，它由四種緩沖鹽和一種單價(jià)非緩沖離子鹽組成并且基本上不具有任何其他添加的緩沖鹽或單價(jià)非緩沖離子鹽。這個(gè)緩沖液試劑盒包含一種第一洗脫溶液和一種第二洗脫溶液。該第一洗脫溶液由一種第一緩沖鹽、一種第二緩沖鹽、一種第三緩沖鹽、一種第四緩沖鹽以及氯化鈉組成，其中該第一洗脫溶液具有約6的一個(gè)第一pH和大于約25毫摩爾的總緩沖鹽濃度。該第二洗脫溶液由一種第一緩沖鹽、一種第二緩沖鹽、一種第三緩沖鹽、一種第四緩沖鹽以及 氯化鈉組成，其中該第二洗脫溶液具有約10的一個(gè)第二pH和大于約25毫摩爾的總緩沖鹽濃度。對(duì)于該第一和第二洗脫溶液二者，這些緩沖鹽中的每一種都是一種單價(jià)緩沖鹽、具有一個(gè)凈負(fù)電荷或一個(gè)凈中性兩性離子電荷、并且包含一個(gè)磺酸基和一個(gè)胺。在一種緩沖液試劑盒的另一個(gè)實(shí)施例中，可以使用三種而不是四種緩沖鹽，其中線性pH范圍跨越三個(gè)而不是四個(gè)pH單位。例如，該第一和第二洗脫溶液可各自包含BES、TAPS以及CAPSO，其中該線性pH梯度從約pH7跨越至約pH10。在一種緩沖液試劑盒的又一個(gè)實(shí)施例中，可以使用至少五種而不是四種緩沖鹽，其中線性pH范圍跨越五個(gè)而不是四個(gè)pH單位。例如，該第一和第二洗脫溶液可各自包含一種第五緩沖鹽，其中該線性pH梯度從約pH6跨越至約pH11。該第五緩沖鹽可以是具有10.4的一個(gè)pKa的3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸鹽（CAPS）或者具有10.7的一個(gè)pKa的4-(環(huán)己基氨基)-1-丁烷磺酸鹽（CABS）。現(xiàn)在已經(jīng)描述了該緩沖液試劑盒，以下將描述用于與產(chǎn)生一個(gè)線性pH梯度的緩沖液試劑盒一起使用的一個(gè)色譜系統(tǒng)。圖11示出了被配置以產(chǎn)生包含兩種或更多種洗脫溶液的一個(gè)梯度緩沖液的一個(gè)色譜系統(tǒng)100的一個(gè)實(shí)施例。色譜系統(tǒng)100可包括一個(gè)泵102、一個(gè)進(jìn)樣閥112、一個(gè)色譜分離裝置114、一個(gè)檢測(cè)器116以及一個(gè)微處理器118。泵102可被配置以將一種液體從一個(gè)液體源泵出并且流體連接至進(jìn)樣閥112。該液體可以是具有多種緩沖鹽的一種洗脫溶液。該液體源可以處于含有該液體的一個(gè)容器的形式并且可以流體附接至泵102的一個(gè)輸入端。泵102可被配置以在從約20PSI至約15,000PSI的壓力范圍下運(yùn)輸該液體。應(yīng)注意，在此表示的壓力是相對(duì)于周圍壓力（13.7PSI至15.2PSI）而列出的。泵102可處于高壓液相色譜（HPLC）泵的形式。此外，還可以配置泵102以使得液體僅接觸泵102的一個(gè)惰性部分，以防止濾去顯著量的雜質(zhì)。在此背景下，顯著意指會(huì)干擾預(yù)期測(cè)量的雜質(zhì)的量。例如，該惰性部分可由聚醚醚酮（PEEK）制成或者至少涂覆有一個(gè)PEEK襯里，該P(yáng)EEK在暴露于一種液體時(shí)不會(huì)濾去顯著量的離子。此外，泵102可被配置以攝入多于一種類型的洗脫溶液。如圖11所示，字母A和字母B表明兩種不同類型的洗脫溶液可輸入到泵102之中。泵102 可包括控制輸出的A（例如，第一洗脫溶液）與B（例如，第二洗脫溶液）的比例的一個(gè)比例閥。在一個(gè)實(shí)施例中，泵入的A與B的比例可都獨(dú)立地隨著時(shí)間變化而變化。應(yīng)注意，可以使用兩種以上的溶液源來(lái)形成在此描述的線性緩沖液梯度。例如，泵102可以是具有四個(gè)攝入口的一個(gè)四元泵，該四個(gè)攝入口附接至四個(gè)分開(kāi)的溶液源容器A、B、C以及D。通過(guò)將洗脫溶液的這些組分（多種緩沖鹽和多種單價(jià)非緩沖離子鹽）分配到兩種或更多種攝入源容器中可在泵102內(nèi)原位形成該第一洗脫溶液。例如，容器A可具有在pH5.6下的32mMMES、20mMBES以及30mMNaCl并且容器B可具有在pH5.6下的24mMTAPS、20mMCAPSO以及30mMNaCl。像這樣，泵102可等比例混合容器A和B二者以使得該組合基本上形成具有與先前實(shí)施例一致的緩沖鹽濃度的一種第一洗脫溶液。以一種相似的方式，該第二洗脫溶液也可以具有分配到兩個(gè)或更多個(gè)容器中的多種緩沖鹽和單價(jià)非緩沖離子鹽。以下將描述將第一和第二洗脫溶液的多個(gè)部分分配到四個(gè)容器中的另一個(gè)實(shí)施例，這四個(gè)容器各自輸入該四元泵的一個(gè)攝入部分中。這個(gè)實(shí)施例提供了一個(gè)平臺(tái)以使得可以快速且容易地調(diào)整這些參數(shù)以便產(chǎn)生所希望的線性pH梯度。例如，容器A可具有在pH5.6下的四種緩沖鹽：32mMMES、20mMMOPS、24mMTAPS以及20mMCAPSO。容器B可具有在pH10.2下的20mMMES、24mMMOPS、28mMTAPS、32mMCAPSO。容器C可具有60mMNaCl。容器D可具有去離子水。在此實(shí)施例中，如果需要，那么通過(guò)容器C的比例閥可輕易地調(diào)整單價(jià)非緩沖離子鹽的濃度。類似地，如果需要，那么通過(guò)容器A、B以及C的比例閥也可輕易地調(diào)整這些緩沖鹽的濃度?？墒褂眠M(jìn)樣閥112來(lái)將一團(tuán)液體樣品注入到一個(gè)洗脫液流中。該液體樣品可包含多種化學(xué)成分（即，多種基質(zhì)組分）和一種或多種目的分析物。樣品進(jìn)樣閥112將典型地具有兩個(gè)位置。在第一個(gè)位置中，洗脫液將簡(jiǎn)單通過(guò)進(jìn)樣閥112流動(dòng)到色譜分離裝置114中。使用者可將一種液體樣品裝入到在進(jìn)樣閥112中具有一個(gè)預(yù)定體積的一個(gè)樣品環(huán)中。一旦將進(jìn)樣閥112切換到第二位置中，洗脫液便將流動(dòng)穿過(guò)該樣品環(huán)并隨后將該液體樣品引入到色譜分離裝置114中。在一個(gè)實(shí)施例中，進(jìn)樣閥112可處于一個(gè)六通閥的形式。色譜分離裝置114可用于從存在于液體樣品中的各種基質(zhì)組分中分離一種或多種感興趣的分析物。典型地，色譜分離裝置114可處于含有一種包裝的固定相的一個(gè)空心圓柱體形式。在液體樣品流動(dòng)穿過(guò)色譜分離裝置114時(shí)，這些基質(zhì)組分和目標(biāo)分析物可具有用于洗脫出色譜分離裝置114的一個(gè)保留時(shí)間范圍。根據(jù)多種目標(biāo)分析物和基質(zhì)組分的特征，它們對(duì)色譜分離裝置114中的固定相可具有不同的親和力。色譜分離裝置114的輸出端可流體連接至檢測(cè)器116，以測(cè)量液體樣品的分離的化學(xué)成分的存在。適合與在此所述的這些緩沖液試劑盒一起使用的色譜分離裝置114的多個(gè)實(shí)例可以是處于一種陽(yáng)離子交換分離裝置并且優(yōu)選一種強(qiáng)陽(yáng)離子交換分離裝置的形式。在某些情形下，一種弱陽(yáng)離子交換分離裝置可與在此所述的這些緩沖液試劑盒一起使用。適合與在此所述的這些緩沖液試劑盒一起使用的可商購(gòu)的強(qiáng)陽(yáng)離子交換分離裝置是MAbPacSCX-10（賽爾飛世爾科技公司（ThermoScientificDionex），美國(guó)加利福尼亞州桑尼維爾市（Sunnyvale,California,U.S.A.））、BioMab（安捷倫科技公司（AgilentTechnologies））、Protein–PakHiResCM（沃特世公司（WatersCorp.），馬薩諸塞州米爾德福（Milford,Massachusetts））、TSKgelCM-STAT（東曹生物科技有限公司（TosohBioscience））。檢測(cè)器116可處于以下形式：紫外可見(jiàn)光光譜儀、熒光光譜儀、電化學(xué)檢測(cè)器、測(cè)量導(dǎo)熱率檢測(cè)器、電荷檢測(cè)器、質(zhì)譜儀、帶電氣溶膠檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、pH計(jì)、或其一個(gè)組合。一個(gè)組合檢測(cè)器的一個(gè)實(shí)例可以是可從賽爾飛世爾科技公司商購(gòu)的（PCM-3000，美國(guó)加利福尼亞州桑尼維爾市）具有一個(gè)下游pH計(jì)的一個(gè)紫外可見(jiàn)光光譜儀。關(guān)于基于一個(gè)帶電障壁和兩個(gè)電極的電荷檢測(cè)器的詳情可在美國(guó)授權(quán)前公開(kāi)號(hào)20090218238中找到，該公開(kāi)通過(guò)引用全部結(jié)合在此。帶電氣溶膠檢測(cè)器使流出液流成霧狀并形成可作為與分析物濃度成比例的電流而測(cè)量的帶電粒子。關(guān)于帶電氣溶膠檢測(cè)器的詳情可在美國(guó)專利號(hào)6,544,484；和6,568,245中找到，這些專利通過(guò)引用全部結(jié)合在此。關(guān)于蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的詳情可在美國(guó)專利號(hào)7,847,936；和7,911,609；8,089,627；以及國(guó)際專利公開(kāi)號(hào)WO2010068272A1中找到，這些專利通過(guò)引用全部結(jié)合在此。一個(gè)電子線路可包括微處理器118、一個(gè)計(jì)時(shí)器、以及一個(gè)存儲(chǔ)器部分。微處理器118可用于控制色譜系統(tǒng)100的運(yùn)行。微處理器118可以被整合到 色譜系統(tǒng)100中或者可以是與色譜系統(tǒng)100相聯(lián)通的一臺(tái)個(gè)人計(jì)算機(jī)的一部分。微處理器118可被配置以與色譜系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)組件如泵102、進(jìn)樣閥112以及檢測(cè)器116相聯(lián)通并控制它們。在一個(gè)實(shí)施例中，微處理器118可控制泵入的洗脫溶液的比例并隨著時(shí)間變化來(lái)改變?cè)摫壤?yīng)注意，使用在此所述的緩沖液試劑盒，不需要pH檢測(cè)器與比例閥之間的一個(gè)反饋機(jī)構(gòu)來(lái)確保在色譜圖的測(cè)試時(shí)間上pH梯度是線性的。這是一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，其在于在不使用基于測(cè)量的pH值調(diào)整比例閥的定制軟件的情況下簡(jiǎn)單地實(shí)現(xiàn)線性pH梯度。為了產(chǎn)生一個(gè)線性pH梯度，隨著時(shí)間變化而改變第一洗脫液相對(duì)于第二洗脫液的比例。在一個(gè)實(shí)施例中，這種隨著時(shí)間的比例變化是線性的并且僅具有一個(gè)斜率，這提供了一種使用簡(jiǎn)單的緩沖液試劑盒。還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在于隨著時(shí)間的比例變化是線性的并且不會(huì)根據(jù)一個(gè)高階方程例如像一個(gè)多項(xiàng)式方程來(lái)變化。在其他情況下，當(dāng)在pH檢測(cè)器與比例閥之間實(shí)施一個(gè)反饋機(jī)構(gòu)時(shí)，在具體時(shí)間間隔下可使用多個(gè)斜率以提供一個(gè)線性pH斜率，但是這使得緩沖液試劑盒系統(tǒng)變得更復(fù)雜?，F(xiàn)在已經(jīng)描述了色譜系統(tǒng)，以下將描述采用一種色譜分離裝置使用具有一個(gè)線性pH梯度的一種梯度洗脫液流從一種樣品的多種基質(zhì)組分中分離至少一種分析物的方法。該pH梯度隨著時(shí)間變化的范圍是從一個(gè)第一pH值至一個(gè)第二pH值。在一個(gè)實(shí)施例中，該第一pH可以是約6并且該第二pH可以是約10，其中在一個(gè)預(yù)定時(shí)間段上pH線性地變化。此預(yù)定時(shí)間段的范圍可以是從約10分鐘至約180分鐘，范圍優(yōu)選是從約10分鐘至約60分鐘，并且范圍更優(yōu)選是從約10分鐘至約30分鐘。因此，由在此所述的緩沖液試劑盒提供的線性梯度的斜率的范圍可以是從約0.04pH單位/分鐘至約0.5pH單位/分鐘。該方法包括將樣品注入到進(jìn)樣閥112中，其中該進(jìn)樣閥與該色譜分離裝置114處于流體聯(lián)通。將具有該第一pH值的該第一洗脫溶液泵入到該色譜分離裝置中。該第一洗脫溶液包含一種第一緩沖鹽、一種第二緩沖鹽、一種第三緩沖鹽以及一種第四緩沖鹽。將具有該第二pH值的該第二洗脫溶液泵入到該色譜分離裝置中。該第二洗脫溶液包含一種第一緩沖鹽、一種第二緩沖鹽、一種第三緩沖鹽以及一種第四緩沖鹽。對(duì)于該第一和第二洗脫溶液，該第一緩沖鹽、該第二緩沖鹽、該第三緩沖鹽以及該第四緩沖鹽可分別是MES、BES、TAPS以及CAPSO。在使用具 有10微米粒徑的一種柱的一個(gè)實(shí)施例中，在從約0.5mL/min至約1mL/min的流速范圍下并在從約1000至約3000磅/平方英寸的壓力范圍下可以泵入該第一和第二洗脫溶液。對(duì)于該第一和第二洗脫溶液，該第一緩沖鹽、該第二緩沖鹽、該第三緩沖鹽以及該第四緩沖鹽可分別是MES（pKa6.1）、BES（pKa7.1）、TAPS（pKa8.4）以及CAPSO（pKa9.6）。在多個(gè)替代實(shí)施例中，該第二緩沖鹽BES可以用MOPS（pKa7.2）、磷酸鹽（pKa2.15、7.2、12.38）、焦磷酸鹽（pKa0.91、2.10、6.70、9.32）或者三聚磷酸鹽（pKa約1、約2、2.8、6.5以及9.2）替代，并且該第三緩沖鹽TAPS可以用TRIS（pKa8.1）替代。該方法還包括隨著時(shí)間變化改變所泵入的第一洗脫溶液與泵入的第二洗脫溶液的比例。在比例閥中時(shí)或者之后但是在輸入到色譜分離裝置中之前該泵可以將兩種洗脫液混合在一起。例如，最初1分鐘該比例可以是100%的該第一洗脫溶液和0%的該第二洗脫溶液。隨后，接下來(lái)的30分鐘該比例可以按其中該第一洗脫溶液從100%變?yōu)?%并且該第二洗脫溶液從0%變?yōu)?00%的一種線性方式發(fā)生改變?？梢砸鹨粋€(gè)線性pH梯度產(chǎn)生的一種線性的方式改變泵入的洗脫溶液的比例。隨著時(shí)間變化測(cè)量并記錄洗脫液的pH值，其中此數(shù)據(jù)集形成從約該第一pH值至該第二pH值的一條近似直線。在線性斜升之后，接下來(lái)的3分鐘該第一洗脫溶液可維持在0%并且第二洗脫溶液可維持在100%。作為循環(huán)的最后部分，接下來(lái)的6分鐘可將該第一洗脫溶液切換至100%并且可將第二洗脫溶液切換至0%以完成該循環(huán)。在此方法的過(guò)程中，通過(guò)該色譜分離裝置可以洗脫該樣品。將分析物從樣品中的多種基質(zhì)組分中分離，并且隨后在檢測(cè)器處進(jìn)行檢測(cè)。在此所述的這些緩沖液試劑盒被配置以提供隨著時(shí)間變化的一個(gè)線性pH梯度。該線的直線度允許一種平臺(tái)方法表征多種分析物并且對(duì)IEC過(guò)程幾乎沒(méi)有修改。在一個(gè)實(shí)施例中，在其中該第一pH值是約6并且該第二pH值是約10的一個(gè)范圍上該近似直線具有大于0.97、優(yōu)選大于0.98并且更優(yōu)選大于0.99的一個(gè)相關(guān)系數(shù)。更接近整數(shù)的一個(gè)相關(guān)系數(shù)值代表具有一個(gè)整數(shù)值的一條完美直線的線的直線度。除了相關(guān)系數(shù)（例如，皮爾森（Pearson）相關(guān)系數(shù)并且被表示為R2）之外，還可以使用平均絕對(duì)百分比誤差（MAPE）來(lái)評(píng)定該線的直線度或線 性度，如方程式1所示。（方程式1）在線性梯度過(guò)程中，可以使用所有測(cè)量的pH值（pHmeas）和時(shí)間值（t）來(lái)產(chǎn)生一個(gè)線性方程式。注意，n代表在線性梯度斜升過(guò)程中進(jìn)行的pH測(cè)量的次數(shù)。通過(guò)將一個(gè)時(shí)間值t輸入到計(jì)算的線性方程式中可以確定計(jì)算的pH值pHcalc(t)。pHmeas與pHcalc之間的差異代表一個(gè)線性度偏差，其中這個(gè)差異可轉(zhuǎn)換為一個(gè)百分比誤差、一個(gè)絕對(duì)值并且隨后計(jì)算為一個(gè)平均值。更接近于零的一個(gè)更低的MAPE值代表近似一條完美直線的直線度。在一個(gè)實(shí)施例中，平均絕對(duì)百分比誤差可以是小于約1.5%、優(yōu)選小于約1.0%并且更優(yōu)選小于約0.5%，其中該第一pH值是約6并且該第二pH值是約10。除MAPE之外，還可以計(jì)算一個(gè)平均絕對(duì)誤差以評(píng)定一個(gè)線性度，如方程式2所示。（方程式2）與MAPE類似，更接近于零的一個(gè)更低的MAE值代表近似一條完美直線的直線度。還可以計(jì)算一個(gè)最大pH誤差（MaxpHError）以評(píng)定一個(gè)線性度，如方程式3所示。MaxpHError＝Max|pHmeas(t)pHcalc(t)|（方程式3）通過(guò)確定pHmeas與pHcalc之間的最大差異可以計(jì)算該最大pH誤差。更接近于零的一個(gè)更低的MaxpHError值代表與一條完美直線相對(duì)應(yīng)的一個(gè)直線度。實(shí)例1以下將描述圖11中所示出的色譜系統(tǒng)100（UltiMate3000HPLC系統(tǒng)，賽爾飛世爾科技公司，美國(guó)加利福尼亞州桑尼維爾市）的裝配。泵102是流速設(shè)為1mL/min并且壓力設(shè)為2600PSI的一個(gè)HPLC泵（UltiMate3000生物兼容的雙梯度微型泵（BiocompatibleDual-GradientMicroPump）DGP-3600BM，賽爾飛世爾科技公司，美國(guó)加利福尼亞州桑尼維爾市）。進(jìn)樣閥112（UltiMate3000 自動(dòng)進(jìn)樣器（Autosampler）WPS-3000TBFC，賽爾飛世爾科技公司，美國(guó)加利福尼亞州桑尼維爾市）被配置以具有一個(gè)10微升樣品環(huán)。色譜分離裝置114（MAbPacSCX-10，10μm，4x250mm，來(lái)自美國(guó)加利福尼亞州桑尼維爾市賽爾飛世爾科技公司）是適用于分離多種蛋白質(zhì)并且更具體地說(shuō)MAb的一種強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱。該強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂具有10微米的一個(gè)粒子直徑，并且該柱具有4mm的一個(gè)內(nèi)徑和250mm的一個(gè)長(zhǎng)度。色譜系統(tǒng)100被配置以將色譜分離裝置114加熱至30℃。檢測(cè)器116（UltiMate3000VWD-3400RS，賽爾飛世爾科技公司，美國(guó)加利福尼亞州桑尼維爾市）是處于一種UV-VIS分光光度計(jì)的形式并且設(shè)置為280納米波長(zhǎng)。在檢測(cè)器116之后，安置一個(gè)pH和電導(dǎo)率傳感器（UltiMate3000PCM-3000，賽爾飛世爾科技公司，美國(guó)加利福尼亞州桑尼維爾市）以監(jiān)測(cè)洗脫液的pH。制備該第一洗脫溶液（A）以具有在pH5.6下的以下濃度：16mMMES、10mMBES、12mMTAPS、10mMCAPSO以及30mMNaCl。制備該第二洗脫溶液（B）以具有在pH10.2下的以下濃度：10mMMES、12mMBES、14mMTAPS、16mMCAPSO以及30mMNaCl。泵102被配置以使用一個(gè)比例的該第一洗脫溶液（A）與該第二洗脫溶液（B）來(lái)提供一個(gè)梯度流動(dòng)相。該梯度被配置以提供顯示在表1中的以下參數(shù)。表1.時(shí)間（分鐘）%A%B0–110001–31100–00–10031–34010034–401000圖1是示出隨時(shí)間變化所測(cè)量的pH值的圖，其中該第一和第二洗脫液包含MES、BES、TAPS、CAPSO以及NaCl。在30分鐘的時(shí)間段上該pH梯度從約pH6至約pH10基本上是線性的。相關(guān)系數(shù)值R2是0.9996。將具有pI值范圍是從約6至約10的若干種成分的一種蛋白質(zhì)樣品注入到色譜系統(tǒng)100中。這些成分包括多種凝集素（包括三種亞型，即凝集素-1、凝集素-2以及凝集素-3）、胰蛋白酶原、核糖核酸酶A以及細(xì)胞色素C。圖2是使 用此實(shí)例的緩沖液試劑盒的蛋白質(zhì)樣品的色譜圖。對(duì)于該色譜圖中的每個(gè)主峰，它們標(biāo)記有成分名稱、保留時(shí)間以及隨著相對(duì)于UV-VIS峰的測(cè)量稍微延遲的時(shí)間測(cè)量的pH。這些峰具有一個(gè)高分辨率和高效率，顯示了使用由此實(shí)例的緩沖液試劑盒產(chǎn)生的線性pH梯度可以有效分離具有從6至10的pI值范圍的一種蛋白質(zhì)樣品。實(shí)例2以下將描述一種緩沖液試劑盒的另一個(gè)實(shí)施例的使用，其中來(lái)自實(shí)例1的緩沖液試劑盒的該第二緩沖鹽BES用另一種古德緩沖液MOPS替換。此實(shí)例使用色譜系統(tǒng)100和與實(shí)例1所述相似的條件。制備該第一洗脫溶液（A）以具有在pH5.6下的以下濃度：16mMMES、10mMMOPS、12mMTAPS、10mMCAPSO以及30mMNaCl。制備該第二洗脫溶液（B）以具有在pH10.2下的以下濃度：10mMMES、12mMMOPS、14mMTAPS、16mMCAPSO以及30mMNaCl。泵102被配置以根據(jù)表1中的這些參數(shù)提供一個(gè)流動(dòng)相梯度。圖3是示出隨時(shí)間變化所測(cè)量的pH值的圖，其中該第一和第二洗脫液包含MES、MOPS、TAPS、CAPSO以及NaCl。在30分鐘的時(shí)間段上該pH梯度從約pH6至約pH10基本上是線性的。該相關(guān)系數(shù)值R2是0.9996，這與實(shí)例1的緩沖液試劑盒相同。使用此實(shí)例的緩沖液試劑盒為實(shí)例1的蛋白質(zhì)樣品跑色譜圖。所得色譜圖與圖2中的色譜圖相似，顯示了使用由此實(shí)例的緩沖液試劑盒產(chǎn)生的線性pH梯度可以有效分離具有從6至10的pI值范圍的一種蛋白質(zhì)樣品（數(shù)據(jù)未顯示）。實(shí)例3以下將描述一種緩沖液試劑盒的另一個(gè)實(shí)施例的使用，其中來(lái)自實(shí)例1的緩沖液試劑盒的該第三緩沖鹽TAPS用另一種緩沖液TRIS替換。與TAPS不同，TRIS在約6至約10的pH范圍上可帶中性電荷抑或正電荷并且不具有一個(gè)磺酸基。此實(shí)例使用色譜系統(tǒng)100和與實(shí)例1所述相似的條件。制備該第一洗脫溶液（A）以具有在pH5.6下的以下濃度：16mMMES、10mMBES、12mMTRIS、10mMCAPSO以及30mMNaCl。制備該第二洗脫溶液（B）以具有在pH10.2下的以下濃度：10mMMES、12mMBES、14mMTRIS、16mMCAPSO以及30mMNaCl。泵102被配置以根據(jù)表1中的這些參數(shù)提供一個(gè)流動(dòng)相梯度。圖4是示出隨時(shí)間變化所測(cè)量的pH值的圖，其中該第一和第二洗脫液包含MES、BES、TRIS、CAPSO以及NaCl。在30分鐘的時(shí)間段上該pH梯度從約pH6至約pH10是近似線性的。在此實(shí)例中， 該pH梯度具有一個(gè)比實(shí)例1和2的pH梯度更明顯的S形狀。出于比較的目的，產(chǎn)生如圖6中所示的一張圖，用來(lái)比較當(dāng)使用具有實(shí)例1的MES、BES、TAPS以及CAPSO的緩沖液試劑盒（箭頭602）和具有此實(shí)例的MES、BES、TRIS以及CAPSO的緩沖液試劑盒（箭頭604）時(shí)pH軌跡的線性度。使用TRIS的緩沖液試劑盒的相關(guān)系數(shù)值R2是0.9868，這比實(shí)例1和2的緩沖液試劑盒小。使用此實(shí)例的緩沖液試劑盒為實(shí)例1的蛋白質(zhì)樣品跑色譜圖。盡管此實(shí)例的緩沖液試劑盒提供了一個(gè)稍微較小線性的pH梯度，但是所得色譜圖與圖2中的色譜圖相似，這顯示了使用由此實(shí)例的緩沖液試劑盒產(chǎn)生的線性pH梯度可以有效分離具有從6至10的pI值范圍的一種蛋白質(zhì)樣品（數(shù)據(jù)未顯示）。實(shí)例4以下將描述一種緩沖液試劑盒的又一個(gè)實(shí)施例的使用，其中來(lái)自實(shí)例1的緩沖液試劑盒的該第二緩沖鹽BES用另一種緩沖鹽磷酸鹽替換。與BES不同，磷酸鹽在約6至約10的pH范圍上僅帶負(fù)電荷、是一種多價(jià)緩沖液并且不具有一個(gè)胺基或一個(gè)磺酸基。此實(shí)例使用色譜系統(tǒng)100和與實(shí)例1所述相似的條件。制備該第一洗脫溶液（A）以具有在pH5.6下的以下濃度：16mMMES、10mM磷酸鹽、12mMTAPS、10mMCAPSO以及30mMNaCl。制備該第二洗脫溶液（B）以具有在pH10.2下的以下濃度：10mMMES、12mM磷酸鹽、14mMTAPS、16mMCAPSO以及30mMNaCl。泵102被配置以根據(jù)表1中的這些參數(shù)提供一個(gè)流動(dòng)相梯度。圖5是示出隨時(shí)間變化所測(cè)量的pH值的圖，其中該第一和第二洗脫液包含MES、磷酸鹽、TAPS、CAPSO以及NaCl。在30分鐘的時(shí)間段上該pH梯度從約pH6至約pH10基本上是線性的。在此實(shí)例中，該pH梯度具有一個(gè)比實(shí)例1和2的pH梯度更明顯但是比實(shí)例3更小的S形狀。該相關(guān)系數(shù)值R2是0.998，這與實(shí)例1和2的緩沖液試劑盒大致相同。使用此實(shí)例的緩沖液試劑盒為實(shí)例1的蛋白質(zhì)樣品跑色譜圖。盡管此實(shí)例的緩沖液試劑盒提供了一個(gè)稍微較小線性的pH梯度，但是所得色譜圖與圖2中的色譜圖相似，這顯示了使用由此實(shí)例的緩沖液試劑盒產(chǎn)生的線性pH梯度可以有效分離具有從6至10的pI值范圍的一種蛋白質(zhì)樣品（數(shù)據(jù)未顯示）。實(shí)例5評(píng)定評(píng)估pH梯度的相對(duì)直線度的其他方法。相關(guān)系數(shù)R2不總是用于計(jì)算線性度的最可靠方法，特別是當(dāng)這些數(shù)據(jù)點(diǎn)是平均線性時(shí)。例如，具有一個(gè) 比例近似相等的正偏壓和負(fù)偏壓的一條S型曲線將提供接近統(tǒng)一的一個(gè)相關(guān)系數(shù)R2。通過(guò)使用方程式2至4計(jì)算MAE、最大pH誤差、MAPE以及R2來(lái)評(píng)定實(shí)例1至4的pH梯度的相對(duì)直線度，這顯示在表2中（注意：R2是使用MicrosoftExcel來(lái)計(jì)算的）。表2.實(shí)例1和2的緩沖液試劑盒顯示最低的MAPE值并且因此是最線性的。實(shí)例3顯示比實(shí)例1和2大幾乎5倍的一個(gè)MAPE值。實(shí)例4顯示比實(shí)例1和2大約2倍的一個(gè)MAPE值。還應(yīng)注意，MAE和最大pH誤差的趨勢(shì)近似用MAPE值進(jìn)行追蹤。實(shí)例6進(jìn)行一項(xiàng)分析以顯示多個(gè)峰的洗脫pH與這些蛋白質(zhì)組分的相應(yīng)pI值之間存在一個(gè)相關(guān)性。返回來(lái)參考圖2，記錄六個(gè)色譜峰中的的pH值以與在通過(guò)UV檢測(cè)器檢測(cè)該峰之時(shí)的流出液的近似pH值相對(duì)應(yīng)。以相繼次序列出的這六個(gè)色譜峰是凝集素-1、凝集素-2、凝集素-3、胰蛋白酶原、核糖核酸酶A以及細(xì)胞色 素C的峰，它們分別具有約7.8、8.0、8.2、8.7、9.3以及10.2的基于文獻(xiàn)的pI值。圖7是比較當(dāng)使用包含圖1的MES、BES、TAPS以及CAPSO的緩沖液試劑盒時(shí)隨著相應(yīng)pI值變化測(cè)量的六種蛋白質(zhì)組分峰的pH值的圖。測(cè)量的六種蛋白質(zhì)組分峰的pH值顯示與基于文獻(xiàn)的pI值的一個(gè)強(qiáng)線性相關(guān)性。因此，在一個(gè)校準(zhǔn)程序之后，此實(shí)例支持與在此所述的這些緩沖液試劑盒相聯(lián)系的線性回歸可用于基于峰保留時(shí)間和測(cè)量的pH來(lái)評(píng)估一種蛋白質(zhì)組分的pI的事實(shí)。應(yīng)注意，進(jìn)行實(shí)例2至4的緩沖液試劑盒的多個(gè)相似實(shí)驗(yàn)，并且這些實(shí)驗(yàn)還顯示這些保留時(shí)間可用于評(píng)估這些蛋白質(zhì)組分的pI（數(shù)據(jù)未顯示）。實(shí)例7研究實(shí)例1和3的緩沖液試劑盒隨著時(shí)間變化的電導(dǎo)率特征曲線。此實(shí)例使用色譜系統(tǒng)100和與實(shí)例1所述相似的條件。在此實(shí)例中，還分析來(lái)自電導(dǎo)率檢測(cè)器的數(shù)據(jù)。該電導(dǎo)率檢測(cè)器與色譜分離裝置的一個(gè)輸出端處于流體接觸。泵102被配置以根據(jù)表1中的這些參數(shù)提供一個(gè)流動(dòng)相梯度。圖8是示出使用具有實(shí)例1的MES、BES、TAPS以及CAPSO的緩沖液試劑盒（箭頭802）和具有實(shí)例3的MES、BES、TRIS以及CAPSO的緩沖液試劑盒（箭頭804）的隨著時(shí)間變化的電導(dǎo)率值的圖。對(duì)于實(shí)例1的緩沖液試劑盒，它顯示測(cè)量的電導(dǎo)率值的一個(gè)近似線性的增加。與此相反，對(duì)于實(shí)例3的緩沖液試劑盒，它顯示與近似不變的測(cè)量的電導(dǎo)率值基本上平直的一條近似線性的線。因此，用TRIS替換古德緩沖液TAPS引起了不再線性地增加的電導(dǎo)率特征曲線。申請(qǐng)人相信，除一個(gè)線性增加的pH梯度之外，一個(gè)線性增加的鹽濃度梯度幫助集中并削尖色譜峰形狀。申請(qǐng)人相信，一個(gè)近似平直的鹽濃度特征曲線可允許可接受的色譜圖，但是有稍微不太理想的性能。然而，申請(qǐng)人相信，減小的鹽濃度特征曲線將通過(guò)使色譜峰形狀散焦來(lái)降低性能。實(shí)例8以下將描述使用實(shí)例2的緩沖液試劑盒來(lái)分離包含各種電荷變體的一種異質(zhì)MAb樣品。此實(shí)例使用色譜系統(tǒng)100和與實(shí)例2所述相似的條件。泵102被配置以根據(jù)表1中的這些參數(shù)提供一個(gè)流動(dòng)相梯度。圖9是示出與多種電荷變體相對(duì)應(yīng)的多個(gè)峰的色譜圖，其中該色譜圖軌跡由導(dǎo)向線902表示。此外，圖9示出了由導(dǎo)向線904表示的隨時(shí)間變化的線性pH特征曲線?？傊瑢?shí)例2的緩沖 液試劑盒提供了足以提供一種異質(zhì)MAb樣品的優(yōu)異分離和表征的一個(gè)線性pH梯度。實(shí)例9以下將說(shuō)明具有高直線度的一個(gè)線性pH梯度的多個(gè)優(yōu)點(diǎn)之一，這允許產(chǎn)生高分辨率色譜圖。返回來(lái)參考圖9，洗脫出色譜分離裝置的最大峰群是在約pH6.7至7.9下，而相對(duì)小的峰數(shù)目是在小于pH6.7和大于7.9下。使用實(shí)例1的緩沖液試劑盒可以實(shí)現(xiàn)具有一個(gè)更窄pH范圍的一個(gè)隨后更高分辨率色譜圖。通過(guò)如表3所示地簡(jiǎn)單地減小每單位時(shí)間的pH變化率可以增加色譜圖的分辨率。表3.時(shí)間（分鐘）%A%B0–175251–3175–5025–5031–34505034–407525不是在30分鐘時(shí)間間隔上將pH改變4個(gè)單位，而是在相同時(shí)間間隔上將pH單位改變約1.2個(gè)單位。因?yàn)閷?shí)例1的緩沖液試劑盒具有一個(gè)高線性度，所以隨著時(shí)間變化的更低pH變化率也將具有一個(gè)高線性度以允許緩沖液試劑盒成為一種成比例且可擴(kuò)展的平臺(tái)方法。圖10是示出了與圖9中的多個(gè)帶電變體的一部分相對(duì)應(yīng)的多個(gè)峰但具有更高分辨率（即增加多個(gè)峰之間的間距）的色譜圖。該色譜軌跡由一條導(dǎo)向線1002表示，并且該線性pH軌跡由一條導(dǎo)向線1004表示。因此，不僅實(shí)例2的緩沖液試劑盒提供了足以提供一種異質(zhì)MAb樣品的優(yōu)異分離的一個(gè)線性pH梯度，而且它能夠通過(guò)僅僅減小隨著時(shí)間變化的pH變化率來(lái)提供一個(gè)更高的分辨率分離。雖然在此已經(jīng)顯示并描述了本發(fā)明的多個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚這些實(shí)施例是僅通過(guò)實(shí)例的方式來(lái)提供的。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員目前將發(fā)生很多變化、改變和替代而不背離本發(fā)明。雖然已經(jīng)根據(jù)多個(gè)具體變化和說(shuō)明性附圖來(lái)描述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明并不限于這些變化或所述附圖。此外，在上文描述的多種方法和步驟表明以特定順序發(fā)生某些事件時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可以修改某些步驟的順序并且這些修改是根據(jù)本發(fā)明的變化來(lái)進(jìn)行的。另外，可能時(shí)可以在一個(gè)平行過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行以及如上文所述地依 次進(jìn)行這些步驟中的某些。因此，在本發(fā)明存在處于本披露的精神內(nèi)或者等同于權(quán)利要求書(shū)中找到的這些發(fā)明的多種變化的程度上，意圖是此專利也將覆蓋那些變化。