一種cd3抗原及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種CD3抗原及其制備方法和用途，其中，所述抗原包括：2個相同的連接肽，異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，CD3的ε亞基CD3E的胞外結(jié)構(gòu)域CD3E?ECD，以及CD3的δ亞基CD3D的胞外結(jié)構(gòu)域CD3D?ECD或者CD3的γ亞基CD3G的胞外結(jié)構(gòu)域CD3G?ECD；其中，所述2個相同的連接肽之間能夠形成二硫鍵，所述異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)由多肽鏈LZ1和多肽鏈LZ2形成；其中，所述抗原為由兩個融合蛋白通過異亮氨酸氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)所形成的異二聚體，在第一個融合蛋白中，CD3E?ECD的C端通過一個連接肽連接在多肽鏈LZ1的N端，構(gòu)成融合蛋白CD3E?ECD-LZ1，在第二個融合蛋白中，CD3D?ECD的C端通過另一個連接肽連接在多肽鏈LZ2的N端，構(gòu)成融合蛋白CD3D?ECD-LZ2或者CD3G?ECD的C端通過另一個連接肽連接在多肽鏈LZ2的N端，構(gòu)成融合蛋白CD3G?ECD-LZ2。
【專利說明】一種CD3抗原及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及一種⑶3抗原及其制備方法和在抗⑶3抗體的研究中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]⑶3是人免疫T細胞表面標記抗原,是由四種亞基(subunit)組成的六聚體,通過電荷吸附作用圍繞在T細胞受體(T cell rec印tor，TCR)周圍。⑶3的四種亞基分別為⑶3 ε (⑶3Ε)、⑶3δ (⑶3D)、⑶3gamma (⑶3G)和⑶3 ζ (⑶3Ζ)，均為跨膜蛋白；并且⑶3Ε與⑶3D形成的二聚體、⑶3Ε與⑶3G形成的二聚體，通?？梢宰鳛榭耿?抗體的識別靶位點。
[0003]CD3E ECD 為 CD3E 的胞外結(jié)構(gòu)域(extra-cellular domain), CD3D ECD 為 CD3D 的胞外結(jié)構(gòu)域，⑶3G E⑶為⑶3G的胞外結(jié)構(gòu)域。
[0004]0KT3為一個商業(yè)化的抗⑶3抗體，其靶點為⑶3E和⑶3G的二聚體的胞外區(qū)。0KT3不僅能夠結(jié)合⑶3，還具有激活T細胞的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，只有當⑶3E和⑶3G形成了二聚體時才具有免疫原性，從而能被0KT3結(jié)合，而單獨的CD3E或CD3G均無法被0KT3結(jié)合。
[0005]UCHTl是一個常用的抗⑶3抗體，既能夠識別⑶3E和⑶3D的二聚體的胞外結(jié)構(gòu)域，也能識別⑶3E和⑶3G的二聚體的胞外結(jié)構(gòu)域，而單獨的⑶3E、⑶3D和⑶3G胞外結(jié)構(gòu)域均無法被UCHTl識別。
[0006]目前CD3抗原的制備方法有將CD3E ECD與CD3G ECD融合(CD3E-G ECD fusion);將 CD3E ECD 與 CD3D ECD 融合(CD3E-D ECD fusion)、將 CD3E、CD3G 和 CE3D 三種亞基的 ECD與Fe片段融合(CD3E/G/D-Fc);或者在融合蛋白的C端添加Flag標簽(CD3E/G/D-Fc_Flag)或His標簽(CD3E/G/D-Fc-His)等。CD3E-G ECD融合蛋白和CD3E-D ECD融合蛋白都采用原核表達，存在于包涵體中，純化后需要進行復性，也有將⑶3E/G/D E⑶分別用原核表達，純化后將⑶3E和⑶3G或⑶3D等比例混合進行復性AD3E/G/D-FC重組融合蛋白在293細胞中表達，具有免疫原性，能夠被0KT3和UCHTl識別。
[0007]原核表達CD3抗原雖然產(chǎn)量高，但是需要進行復性步驟，最后能夠得到的具有免疫原性的CD3只有最初產(chǎn)量的10%甚至更低；真核表達CD3E/G/D-Fc重組融合蛋白，也存在有 CD3E-Fc、CD3D-Fc 和 CD3G_Fc 同源二聚體(homodimer)以及 CD3D-Fc-CD3G_Fc 異二聚體等雜質(zhì)蛋白。而采用在不同的Fe的C端帶不同的標簽，雖然在一定程度上提高了最后得到的異二聚體純度，但是純化過程中，需要進行至少三步親和層析，損失也比較多。另外，抗原的Fe標簽對于篩選同源的抗體存在很大的局限性，會產(chǎn)生很強的背景干擾。這種干擾同樣也會影響到ELISA的實驗結(jié)果。另外，使用帶FC標簽的抗原進行抗體篩選時，會出現(xiàn)特異針對標簽很高親和力的抗體，標簽越長，出現(xiàn)此類抗體的比例越大，這對篩選結(jié)合⑶3抗原的抗體產(chǎn)生一定的干擾。
[0008]由于目前⑶3抗原及其制備方法中存在的上述缺點，有必要開發(fā)一種能夠使⑶3E和⑶3D、⑶3E和⑶3G分別形成異二聚體的攜帶有非Fe片段蛋白標簽的通過真核表達系統(tǒng)制備的新的CD3抗原及其制備方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]為此，本發(fā)明提出了一種可以解決上述問題的或至少能部分解決上述問題的一種⑶3抗原，其中，所述抗原包括:2個相同的連接肽，異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，⑶3的ε亞基⑶3Ε的胞外結(jié)構(gòu)域⑶3Ε E⑶，以及⑶3的δ亞基⑶3D的胞外結(jié)構(gòu)域⑶3D E⑶或者⑶3的Y亞基⑶3G的胞外結(jié)構(gòu)域⑶3G E⑶；
[0010]其中，所述2個相同的連接肽之間能夠形成二硫鍵，所述異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)由多肽鏈LZl和多肽鏈LZ2形成；
[0011]其中，所述抗原為由兩個融合蛋白通過異亮氨酸氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)所形成的異二聚體，在第一個融合蛋白中，⑶3Ε E⑶的C端通過一個連接肽連接在多肽鏈LZl的N端，構(gòu)成融合蛋白⑶3Ε E⑶-LZ1，在第二個融合蛋白中，⑶3D E⑶的C端通過另一個連接肽連接在多肽鏈LZ2的N端，構(gòu)成融合蛋白⑶3D E⑶-LZ2或者⑶3G E⑶的C端通過另一個連接肽連接在多肽鏈LZ2的N端，構(gòu)成融合蛋白⑶3G E⑶-LZ2。
[0012]其中，在所述融合蛋白中，多肽鏈LZl和多肽鏈LZ2的C端分別連接有一個相同或不同的短肽標簽；所述短肽標簽選自由Flag、His、Myc和HA所組成的組中的一種或兩種。
[0013]本發(fā)明還提供了一種⑶3抗原的制備方法，所述方法包括:
[0014](I)分別構(gòu)建重組載體e和重組載體d，或者分別構(gòu)建重組載體e和重組載體g ；
[0015](2)在真核細胞中轉(zhuǎn)染重組載體e和d，或者轉(zhuǎn)染重組載體e和g ;
[0016](3)利用親和層析方法純化獲得⑶3抗原⑶3E/⑶3D-LZ或者⑶3E/⑶3G-LZ ；
[0017]其中，所述重組載體e含有融合蛋白⑶3E E⑶-LZI的編碼核苷酸序列；所述重組載體g含有融合蛋白⑶3G E⑶-LZ2的編碼核苷酸序列；所述重組載體d含有融合蛋白⑶3DE⑶-LZ2的編碼核苷酸序列。
[0018]本發(fā)明還提供了上述⑶3抗原在抗⑶3抗體的研究中的應用。
[0019]本發(fā)明還提供了上述CD3抗原在抗原抗體相互作用研究中的應用。
[0020]通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明的⑶3抗原具有如下優(yōu)點:
[0021](I)使用真核表達系統(tǒng)，不需要對蛋白進行復性；(2)使用短肽標簽構(gòu)建融合蛋白，簡化了純化步驟；(3)改造融合蛋白序列，使⑶3E和⑶3D、⑶3E和⑶3G能夠分別形成異二聚體；(4)避免使用Fe標簽，在進行抗體檢測，如ELISA實驗時減少背景干擾；(5)標簽長度不超過70個氨基酸，在進行抗CD3抗體篩選時減少標簽干擾；(6)與抗CD3的抗體0KT3，UCHT1，TRX4和L2K均能特異性結(jié)合；(7)所帶的標簽不同于各類IgG，可避免與各類二抗發(fā)生反應。
[0022]本發(fā)明所制備的CD3抗原可以用于抗CD3抗體的篩選、鑒定、檢測，以及親和力測定。
[0023]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]附圖是用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的【具體實施方式】一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制，在附圖中:
[0025]圖1為本發(fā)明所提供的⑶3抗原的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0026]圖2為重組載體pcDNA3.1 (+) Hygro-CD3E_LZl的質(zhì)粒圖譜。[0027]圖3為重組載體pcDNA3.1 (+) Hygro-CD3G_LZ2的質(zhì)粒圖譜。
[0028]圖4為重組載體pcDNA3.1 (+) Hygro-CD3D_LZ3的質(zhì)粒圖譜。
[0029]圖5為用Western Blot方法對本發(fā)明所提供的抗原進行檢測的結(jié)果圖。
[0030]圖6為用12%SDS_PAGE檢測本發(fā)明⑶3抗原的純化效果的結(jié)果圖。
[0031]圖7為原核表達復性純化后的⑶3E/CD3D 二聚體SDS-PAGE考染圖。
[0032]圖8為用Dot blot分析檢測抗原I和2與抗體的結(jié)合活性的結(jié)果圖。
[0033]圖9為用ELISA方法檢測本發(fā)明所提供的抗原與0KT3和UCHTl抗體的結(jié)合活性的結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0034]以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0035]本發(fā)明提供了一種⑶3抗原，其特征在于所述抗原包括:2個相同的連接肽，異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，⑶3的ε亞基⑶ 3Ε的胞外結(jié)構(gòu)域⑶3Ε E⑶，以及⑶3的δ亞基⑶3D的胞外結(jié)構(gòu)域⑶3D E⑶或者⑶3的Y亞基⑶3G的胞外結(jié)構(gòu)域⑶3G E⑶；
[0036]其中，所述2個相同的連接肽之間能夠形成二硫鍵，所述異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)由多肽鏈LZl和多肽鏈LZ2形成；
[0037]其中，所述抗原為由兩個融合蛋白通過異亮氨酸氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)所形成的異二聚體，在第一個融合蛋白中，⑶3Ε E⑶的C端通過一個連接肽連接在多肽鏈LZl的N端，構(gòu)成融合蛋白⑶3Ε E⑶-LZ1，在第二個融合蛋白中，⑶3D E⑶的C端通過另一個連接肽連接在多肽鏈LZ2的N端，構(gòu)成融合蛋白⑶3D E⑶-LZ2或者⑶3G E⑶的C端通過另一個連接肽連接在多肽鏈LZ2的N端，構(gòu)成融合蛋白⑶3G E⑶-LZ2。
[0038]在本發(fā)明所提供的⑶3抗原中，所述⑶3 ε亞基⑶3Ε的胞外結(jié)構(gòu)域⑶3Ε E⑶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述⑶3的δ亞基⑶3D的胞外結(jié)構(gòu)域⑶3D E⑶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述⑶3的Y亞基⑶3G的胞外結(jié)構(gòu)域⑶3G E⑶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0039]本發(fā)明所提供的⑶3抗原的結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0040]其中，在本發(fā)明所提供的CD3抗原中，所述多肽鏈LZI與多肽鏈LZ2為一對不同的多肽鏈，均富含異亮氨酸。蛋白多肽之間通過間插在異亮氨酸中間的不同電荷的氨基酸進行正負電荷兩兩相互配對形成二聚體。
[0041]本發(fā)明中，所述多肽鏈LZl與多肽鏈LZ2之間形成異亮氨酸拉鏈LZ ;所述異亮氨酸拉鏈LZ使得融合蛋白⑶3Ε E⑶-LZl與融合蛋白⑶3D E⑶-LZ2形成異二聚體或者使得融合蛋白⑶3Ε E⑶-LZl與融合蛋白⑶3G E⑶-LZ2形成異二聚體。
[0042]本發(fā)明中，所述多肽鏈LZl和多肽鏈LZ2的長度相同為40_70個氨基酸。
[0043]其中，所述異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)選自按照以下組合方式形成的異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)中的一種:
[0044]組合A:SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈與SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈所組成的異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)；
[0045]組合B:SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈與SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈所組成的異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)；
[0046]組合C:SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈與SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈所組成的異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)；
[0047]組合D:SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈與SEQ ID N0:11所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈所組成的異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)；
[0048]組合E:SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈與SEQ ID N0:13所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈所組成的異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)；
[0049]組合F:SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈與SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈所組成的異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。
[0050]最為優(yōu)選的，所述異亮氨酸拉鏈為組合A、C或E所形成的異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。
[0051]其中，在本發(fā)明中，對異亮氨酸拉鏈中的兩條多肽鏈中的哪一條與CD3E ECD連接并沒有特別的要求，可以為兩條多肽鏈中的任意一條，本發(fā)明中將與CD3E ECD連接的多肽鏈命名為LZl，將與⑶3D E⑶或⑶3G E⑶連接的多肽鏈命名為LZ2。
[0052]在本發(fā)明所述的連接肽的氨基酸序列選自SEQ ID NO:16_SEQ ID NO:19所示的序列中的一種。優(yōu)選的，所述連接肽的氨基酸序列為SEQ ID N0:16或SEQ ID N0:18所示的氨基酸序列。
[0053]其中，本發(fā)明所述的抗原還包括短肽標簽，具體的，在所述融合蛋白中，多肽鏈LZl和多肽鏈LZ2的C端分別連接有短肽標簽；其作用為在蛋白的純化過程中獲得融合蛋白，LZl與LZ的C末端連接的短肽標簽的種類可以相同或不同，為了獲得更好的純化結(jié)果，所述短肽標簽優(yōu)選為不同種類的短肽標簽，本發(fā)明中對不同短肽標簽的組合方式?jīng)]有特別的限制。
[0054]其中，本發(fā)明中，所述短肽標簽可以選自由Flag、His、Myc和HA所組成的組中的一種或兩種，最為優(yōu)選的，所述短肽標簽為His和HA。
[0055]本發(fā)明所提供的CD3抗原能夠與抗CD3抗體特異性結(jié)合。其中，當所述抗原為CD3EECD-LZl與CD3D ECD-LZ2形成的異二聚體時，所述抗原能夠與抗體UCHT1，TRX4，OKT3和L2K特異性結(jié)合，優(yōu)選的，能與UCHTl或0KT3特異性結(jié)合。當所述抗原為⑶3E E⑶-LZl與⑶3G E⑶-LZ2形成的異二聚體時，所述抗原能夠與抗體UCHTl，TRX4，0KT3和L2K特異性結(jié)合，優(yōu)選的，能與UCHTl或0KT3特異性結(jié)合。
[0056]本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的CD3抗原的制備方法，所述方法包括:
[0057](I)分別構(gòu)建重組載體e和重組載體d，或者分別構(gòu)建重組載體e和重組載體g ；
[0058](2)在真核細胞中轉(zhuǎn)染重組載體e和d，或者轉(zhuǎn)染重組載體e和g ;
[0059](3)利用親和層析方法純化獲得⑶3抗原⑶3E/⑶3D-LZ或者⑶3E/⑶3G-LZ ；
[0060]其中，所述重組載體e含有融合蛋白⑶3E E⑶-LZI的編碼核苷酸序列；所述重組載體g含有融合蛋白⑶3G E⑶-LZ2的編碼核苷酸序列；所述重組載體d含有融合蛋白⑶3DECD-LZ2的編碼核苷酸序列。在本發(fā)明所提供的CD3抗原的制備方法中，重組載體的構(gòu)建方法沒有特別的限定，可以采用本領(lǐng)域常用的重組載體的制備方法獲得，例如可以按照《分子克隆實驗指南第三版》中所介紹的方法構(gòu)建重組載體。
[0061]在本發(fā)明所提供的方法中，所述重組載體e可以通過將融合蛋白⑶3E E⑶-LZl的編碼核苷酸序列導入表達載體獲得；所述重組載體d可以通過將融合蛋白CD3D ECD-LZ2的編碼核苷酸序列導入表達載體獲得；所述重組載體g可以通過將融合蛋白CD3G ECD-LZ2的編碼核苷酸序列導入表達載體獲得。
[0062]本發(fā)明中，對于表達載體的種類沒有特別的限制，可以為本領(lǐng)域常用的真核表達載體，例如，所述表達載體可以為pcDNA3.1 (+) Hygro、PSV2、CMV4或pCMVp-ΝΕΟ-ΒΑΝ等；優(yōu)選的，所述表達載體為pcDNA3.1 (+) Hygro真核表達載體。
[0063]具體的，所述重組載體的構(gòu)建方法可以為，分別構(gòu)建重組載體e、g和d。根據(jù)⑶3EE⑶，⑶3G E⑶，⑶3D E⑶和LZ基因序列及載體中的多克隆位點設(shè)計引物。其中⑶3G E⑶和帶短肽標簽的LZl，⑶3G E⑶和帶短肽標簽的LZ2，⑶3D E⑶和連接肽和待短肽標簽的LZ2間采用兩次重疊延伸PCR法進行連接。純化回收重疊延伸PCR的產(chǎn)物，利用雙酶切方法將重疊PCR的產(chǎn)物分別插入表達載體中的多克隆位點，獲得重組載體e，g和d。
[0064]在本發(fā)明中，PCR反應所應用的試劑可以為本領(lǐng)域常規(guī)使用的PCR反應試劑。
[0065]在本發(fā)明所提供的方法中，重疊延伸PCR法連接各片段的編碼核苷酸序列的條件和試劑可以利用本領(lǐng)域常規(guī)的重疊延伸PCR方法的條件和試劑進行。
[0066]在本發(fā)明中，可以利用本領(lǐng)域常用的方法例如DNA片段回收試劑盒對PCR反應產(chǎn)物進行純化回收。
[0067]本發(fā)明中，重組載體的轉(zhuǎn)染和表達可以按照本領(lǐng)域常規(guī)的方法進行，用于表達所述重組載體的細胞優(yōu)選為哺乳動物細胞，例如可以為HEK293、293E、293F、C0S7或CHO-S細胞；最為優(yōu)選的，為293F細胞。
[0068]在本發(fā)明的一種實施方式中，將重組載體e和g轉(zhuǎn)染真核細胞后，重組載體e和g在宿主細胞中分別表達融合蛋白CD3E ECD-LZl和CD3G ECD-LZ2，CD3E ECD-LZl和CD3GE⑶-LZ2在宿主細胞內(nèi)發(fā)生異二聚化，形成⑶3抗原⑶3E/⑶3G-LZ。
[0069]在本發(fā)明的一種實施方式中，將重組載體e和d轉(zhuǎn)染真核細胞后，重組載體e和d在宿主細胞中分別表達融合蛋白CD3E ECD-LZl和CD3D ECD-LZ2，CD3E ECD-LZl和CD3DE⑶-LZ2在宿主細胞內(nèi)發(fā)生異二聚化，形成⑶3抗原⑶3E/⑶3D-LZ。
[0070]在本發(fā)明所提供的方法中，對于抗原純化的方法可以按照以下步驟進行:通過離心細胞培養(yǎng)液收集細胞培養(yǎng)液上清并用濾膜過濾去除細胞碎片，用結(jié)合緩沖液稀釋上清液后將稀釋后的上清液過親和層析柱并用洗脫緩沖液洗脫獲得CD3抗原。本發(fā)明中，可以利用SDS-PAGE對獲得的抗原的純度進行檢測。
[0071]本發(fā)明還提供了 CD3抗原在抗CD3抗體的篩選中的應用。例如，所述應用可以為:利用人體B細胞的抗體輕重鏈可變區(qū)的mRNA構(gòu)建噬菌體展示文庫，利用CD3抗原對該文庫進行篩選，得到抗CD3的噬菌體，通過測序得到輕重鏈可變區(qū)序列。
[0072]本發(fā)明提供了⑶3抗原在抗體親和力測定的應用，可以利用ELISA法、Fortibio或Biacore方法對抗原和抗體的親和力進行測定。
[0073]本發(fā)明還提供了上述CD3抗原在抗CD3抗體的鑒定和檢測方面的應用。研究抗體與抗原作用位點，例如對抗體和抗原結(jié)合形成晶體結(jié)構(gòu)進行分析。
[0074]以下將通過實施例對本發(fā)明進行詳細描述。以下實施例中，⑶3E E⑶，⑶3G E⑶和CD3D ECD基因的DNA片段均從Jurkat細胞(購自購自中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)中提取mRNA，然后逆轉(zhuǎn)錄PCR得到；LZ基因為合成引物DNA片段(購自Invitrogen);
[0075]大腸桿菌T0P10,真核表達載體pcDNA3.1 (+) Hygro和LB培養(yǎng)基購自Invitrogen公司。
[0076]Ni柱層析柱填料Histrap Fast Flow購自GE公司；
[0077]T4DNA連接酶，Pyrobest DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶購自Takara公司；
[0078]氨節(jié)青霉素購自Amersco公司；
[0079]質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段回收試劑盒購自TianGen公司；
[0080]哺乳動物細胞株293F，培養(yǎng)基293freesytle和轉(zhuǎn)染試劑293fectin購自Invitrogen 公司；
[0081]5kD超濾濃縮管購自mi I Iipore公司；
[0082]鼠IgG抗His購自武漢三鷹公司；
[0083]辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG和羊抗人IgG 二抗均購自Sigma公司；
[0084]磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，氯化鈉和咪唑均購自國藥。
[0085]本發(fā)明中⑶3抗原與抗體的結(jié)合活性利用Dot blot分析方法進行測量。
[0086]本發(fā)明中⑶3抗原與0KT3和UCHTl抗體的結(jié)合活性利用ELISA分析方法進行測量。
[0087]以下實施例中⑶3抗原的收率的計算方法為利用rproteinA —步純化得到的樣品，根據(jù)分子量的差異，進行SDS-PAGEJt SDS-PAGE考染圖的拍照圖片進行泳道選取、條帶選取和灰度分析，得到每一條帶在該泳道的比例，從而計算出CD3抗原的收率。
[0088]在以下實施例中，親和力是指抗體分子上一個抗原結(jié)合點與相應的抗原決定簇之間相適應而結(jié)合的強度，測試方法依照文獻(細胞與分子免疫學雜志，2005，抗PH2SA單克隆抗體相對親和力的測定)中記載的抗PH2SA單克隆抗體相對親和力的測定方法進行。
[0089]實施例1
[0090]本實施例用于說明本發(fā)明所提供的CD3抗原的制備方法。
[0091]1、重組載體的構(gòu)建
[0092]以pcDNA3.1 (+) Hygro作為表達載體，構(gòu)建CD3E EDC-LZl表達載體和CD3GEDC-LZ2表達載體。根據(jù)CD3E ECD、CD3G ECD、連接肽和LZ基因序列及pcDNA3.1 (+) Hygro載體中的多克隆位點設(shè)計擴增引物。分別用表1所示的引物序列通過PCR擴增CD3E ECD基因、⑶3G E⑶基因、連接肽、LZ基因的DNA片段具體如下:
[0093](I)、引物:
[0094]表1
[0095]
【權(quán)利要求】
1.一種⑶3抗原，其特征在于所述抗原包括'2個相同的連接肽，異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，⑶3的ε亞基⑶3Ε的胞外結(jié)構(gòu)域⑶3Ε E⑶，以及⑶3的δ亞基⑶3D的胞外結(jié)構(gòu)域⑶3DE⑶或者⑶3的Y亞基⑶3G的胞外結(jié)構(gòu)域⑶3G E⑶； 其中，所述2個相同的連接肽之間能夠形成二硫鍵，所述異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)由多肽鏈LZl和多肽鏈LZ2形成； 其中，所述抗原為由兩個融合蛋白通過異亮氨酸氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)所形成的異二聚體，在第一個融合蛋白中，⑶3Ε E⑶的C端通過一個連接肽連接在多肽鏈LZl的N端，構(gòu)成融合蛋白⑶3Ε E⑶-LZ1，在第二個融合蛋白中，⑶3D E⑶的C端通過另一個連接肽連接在多肽鏈LZ2的N端，構(gòu)成融合蛋白⑶3D E⑶-LZ2或者⑶3G E⑶的C端通過另一個連接肽連接在多肽鏈LZ2的N端，構(gòu)成融合蛋白⑶3G E⑶-LZ2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CD3抗原，其中，所述多肽鏈LZl和多肽鏈LZ2的長度相同為40-70個氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的CD3抗原，其中，所述異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)選自按照以下組合方式形成的異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)中的一種: 組合A:SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈與SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈所組成的異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)； 組合B:SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈與SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈所組成的異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)； 組合C:SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈與SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈所組成的異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)；` 組合D:SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈與SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈所組成的異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)； 組合E:SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈與SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈所組成的異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)； 組合F:SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈與SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列所編碼的多肽鏈所組成的異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的CD3抗原，其中，所述連接肽的氨基酸序列選自SEQIDNO:16-SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的CD3抗原，其中，在所述融合蛋白中，多肽鏈LZl和多肽鏈LZ2的C端分別連接有一個相同或不同的短肽標簽；所述短肽標簽選自由Flag、His、Myc和HA所組成的組中的一種或兩種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的CD3抗原，其中，所述CD3抗原能與抗CD3的抗體OKT3、UCHT1、TRX4和L2K特異性結(jié)合。
7.權(quán)利要求1-6所述的CD3抗原的制備方法，所述方法包括: (1)分別構(gòu)建重組載體e和重組載體d，或者分別構(gòu)建重組載體e和重組載體g； (2)在真核細胞中轉(zhuǎn)染重組載體e和d，或者轉(zhuǎn)染重組載體e和g; (3)利用親和層析方法純化獲得⑶3抗原⑶3E/⑶3D-LZ或者⑶3E/⑶3G-LZ； 其中，所述重組載體e含有融合蛋白CD3E ECD-LZl的編碼核苷酸序列；所述重組載體g含有融合蛋白⑶3G E⑶-LZ2的編碼核苷酸序列；所述重組載體d含有融合蛋白⑶3DE⑶-LZ2的編碼核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的CD3抗原的制備方法，其中，所述真核細胞為HEK293、293E、293F、C0S7 或 CHO-S 細胞。
9.權(quán)利要求1-7所述的CD3抗原在抗CD3抗體的研究中的應用。
10.權(quán)利要求1-7所 述的CD3抗原在抗原抗體相互作用研究中的應用。
【文檔編號】G01N33/68GK103509122SQ201310440453
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】張敬, 王瑞, 鐘慧, 李剛, 周鵬飛 申請人:武漢友芝友生物制藥有限公司