溶液樣品中含長烷基鏈的離子液體的去除方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含長烷基鏈的離子液體的去除方法，去除方法包括以下步驟：a)將含有離子液體的溶液調(diào)至堿性（pH≥8）；b)采用陽離子交換材料作為吸附劑，去除含長烷基鏈的離子液體；c)收集去除離子液體后的溶液。該方法能很好地去除溶液中的含長烷基鏈的離子液體，具有簡單、高效、快速的優(yōu)點(diǎn)，并在蛋白質(zhì)組學(xué)、高分子化學(xué)及脂質(zhì)體代謝組學(xué)方面有著廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】溶液樣品中含長烷基鏈的離子液體的去除方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種含長烷基鏈的離子液體的去除方法及其應(yīng)用，可實(shí)現(xiàn)溶液中含長 烷基鏈的離子液體的有效去除，具有簡單、高效、快速的優(yōu)點(diǎn)，并且該方法可以廣泛應(yīng)用于 蛋白質(zhì)組學(xué)、高分子化學(xué)及脂質(zhì)體代謝組學(xué)的研究中。

【背景技術(shù)】
[0002] 膜蛋白質(zhì)對執(zhí)行細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換、細(xì)胞識別與免疫應(yīng)答、信號傳導(dǎo)和調(diào)控以及 能量傳遞等功能起著重要作用。真核生物中1/3的蛋白均整合在膜上。此外，膜蛋白質(zhì)在 藥物研究中也起著相當(dāng)重要的作用，在已知的和正在研究的藥物靶標(biāo)中大約有70%為膜蛋 白質(zhì)。然而，由于膜蛋白質(zhì)疏水性強(qiáng)，導(dǎo)致其溶解性和酶解效率較差，分析困難。因此，選擇 一種對膜蛋白質(zhì)具有高溶解能力的溶劑是膜蛋白質(zhì)研究的先決條件。
[0003] 近年來，離子液體作為一種極具應(yīng)用前景的綠色溶劑受到越來越多的關(guān)注。離 子液體是完全由陰陽離子組成，通常在室溫下表現(xiàn)為液體或是熔點(diǎn)小于l〇〇°C的鹽類。離 子液體具有良好的溶劑性、不揮發(fā)、熱穩(wěn)定、液程寬、陰陽離子可設(shè)計(jì)性等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被 廣泛應(yīng)用在化學(xué)合成、電化學(xué)、萃取分離、材料制備等諸多領(lǐng)域。由于其良好的溶解能 力，近來年離子液體成為膜蛋白質(zhì)溶解的新型溶劑（Sun，L.L. ;Tao，D.Y. ;Han，B. ;Ma，J. F. ; Zhuj G. J. ;Liang,Z. ; Shan, Y. C. ;Zhang,L.H. ; Zhang, Y. K. Anal. Bioanal. Chem. 2011，399, 3387-3397.)。
[0004] "Bottom-up"技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定中最常用的技術(shù)，該技術(shù)是先將蛋 白質(zhì)酶解成肽段，然后通過一維或者多維分離技術(shù)進(jìn)行分離及在線質(zhì)譜鑒定。在膜蛋白質(zhì) 分析中，為了膜蛋白質(zhì)的增溶，添加的離子液體等增溶劑會嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)分析的質(zhì)譜信 號。因此質(zhì)譜分析前，需要對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行離子液體等增溶劑的去除，以獲得理想的質(zhì)譜 信號。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于發(fā)展一種含長烷基鏈的離子液體的去除方 法，通過該方法能高效、快速、簡便地去除溶液中的離子液體，從而與后續(xù)的分析過程相兼 容，不對后續(xù)的分析造成不利的影響。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] 溶液樣品中含長烷基鏈的離子液體的去除方法，將含有長烷基鏈的離子液體的樣 品溶液用堿性溶液調(diào)至PH > 8的堿性環(huán)境；然后采用陽離子交換材料作為吸附劑，去除含 長烷基鏈的離子液體，最后將吸附劑和溶液分離，收集溶液。
[0008] 含長烷基鏈的離子液體可為：陽離子部分為烷基鏈部分，為含6個碳或7個以上碳 的咪唑類、吡啶類、季銨類、或季鱗類陽離子；陰離子部分為Cl'Br' Γ、NO3'ClO4'AlCl4' BF4' PF4' CF3COO' CF3SO3' (CF3SO2) 2仄或 SbF6'
[0009] 將含有長烷基鏈的離子液體的樣品溶液用堿性溶液調(diào)至pH為8-14的堿性環(huán)境。
[0010] 含有長烷基鏈的離子液體的樣品溶液可為：細(xì)胞提取液、胞漿提取液、血漿提取 液、蛋白質(zhì)溶液、多肽溶液、脂質(zhì)物溶液或呈電負(fù)性的聚合物溶液。
[0011] 調(diào)節(jié)pH至堿性環(huán)境所采用的堿性溶液為pH為9-14的碳酸氫銨緩沖鹽溶液、pH為 9-14的磷酸緩沖鹽溶液、pH為9-14的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液、氨水、碳酸鈉溶液、或 氫氧化鈉溶液。
[0012] 陽離子交換材料為含有磺酸基團(tuán)和/或磷酸基團(tuán)的硅膠或聚合物基質(zhì)材料(如： 聚丙烯酸酯類基質(zhì)、聚苯乙烯類基質(zhì)、聚丙烯酰胺類基質(zhì)）；材料可以是顆粒材料或者整體 材料。
[0013] 將吸附劑和樣品溶液接觸和分離的方式可以為：
[0014] 將吸附劑固載于固相載體上或填充于中空容器中，將含有離子液體的樣品溶液通 過固相載體或中空容器，并與吸附劑接觸后，直接收集；
[0015] 或?qū)⑽絼┖蜆悠啡芤夯旌辖佑|后，將吸附劑通過離心沉淀的方式，與含有離子 液體的溶液分離；
[0016] 或?qū)⑽絼┌诖判灶w粒上，將吸附劑和樣品溶液混合接觸后，通過磁力作用， 與含有離子液體的樣品溶液分離。
[0017] 固相載體為：表面積為Icm2-IOm2,形狀為長方體、正方體、圓錐體或圓柱體中一種 或二種以上，材質(zhì)為聚合物材料，具體為硅膠、纖維素膜、聚醚砜膜、樹脂、葡聚糖凝膠、瓊脂 糖凝膠和磁性復(fù)合材料。
[0018] 中空容器為：內(nèi)部空腔徑向橫截面直徑為50ym-5cm的不銹鋼管、20-1000μ 1移 液器槍頭、l_200ml固相萃?。⊿PE)管、l-200ml注射器針管、50-500 μ m內(nèi)徑毛細(xì)管或注射 器濾膜腔體。
[0019] 所述樣品溶液為蛋白質(zhì)樣品、脂質(zhì)體樣品及高分子樣品中一種或二種以上混合， 該方法可用于蛋白質(zhì)樣品、脂質(zhì)體樣品及高分子樣品的分析中。
[0020] 具體：
[0021] 1、將含有長烷基鏈的離子液體的樣品溶液，用pH為9-14碳酸氫銨緩沖鹽溶液、磷 酸緩沖鹽溶液、三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液，氨水、碳酸鈉溶液、或氫氧化鈉溶液堿性溶 液調(diào)至pH>8的堿性環(huán)境；
[0022] 2、采用含有磺酸基團(tuán)和/或磷酸基團(tuán)的硅膠或聚合物基質(zhì)的陽離子交換材料作 為吸附劑，吸附溶液中含長烷基鏈的離子液體。若吸附劑固載于固相載體上或填充于中 空容器中，則將含長烷基鏈離子液體的樣品溶液以10-1 〇〇〇 μ L的流速直接通過吸附劑即 可；若吸附劑為未被固定化的顆粒，則直接將吸附劑加入含長烷基鏈離子液體的溶液中，振 蕩 3-lOmin。
[0023] 3、若吸附劑固載于固相載體上或填充于中空容器中，則直接收集流出液，即為去 除離子液體后的溶液；若吸附劑為未被固定化的顆粒，則通過離心的方法（l〇〇_3〇〇〇〇g)分 離吸附劑和溶液，收集溶液部分，即為去除離子液體后的溶液。
[0024] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0025] 1.去除效率高。pH>8的堿性范圍內(nèi)，絕大部分蛋白質(zhì)或肽段成電負(fù)性，由于所帶 負(fù)電荷和離子液體中含有長烷基鏈的陽離子的正電荷相反，采用強(qiáng)陽離子交換材料，含有 長烷基鏈的離子液體被保留，而蛋白質(zhì)或肽段不保留，從而將離子液體和蛋白質(zhì)/肽段分 開。
[0026] 2.操作方便、快捷。強(qiáng)陽離子交換材料只需和含長烷基鏈的離子液體充分接觸，即 可將兩者分離。隨后，采用離心或磁性分離等手段，即可回收去除離子液體后的溶液。若強(qiáng) 陽離子交換材料被填裝于柱管內(nèi)或被固定化，將含離子液體的溶液通過陽離子交換材料， 收集流出液即為去除離子液體后的溶液。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為BSA酶解產(chǎn)物的MALDI-T0F質(zhì)譜圖。圖1.用強(qiáng)陽離子交換材料為吸附劑 (A)將其填充于捕集柱內(nèi)（B)直接放入溶液中，去除離子液體后的BSA酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜圖； (C)不含離子液體的BSA酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜圖；（D)含離子液體的BSA酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 1.牛血清白蛋白（BSA)樣品預(yù)處理：將Img BSA溶解于lmL4% (4g/100mL)的氯 化1-十二烷基-3-甲基咪唑（C12Im-Cl)的50mM碳酸氫銨溶液（ABC)中，90°C下熱變性 IOmin后，加入IOmM二硫蘇糖醇（DTT)溶液，56 °C下反應(yīng)60min進(jìn)行蛋白質(zhì)的還原處理后， 通入30mM碘乙酰胺（IAA)溶液，室溫下避光反應(yīng)30min后進(jìn)行蛋白質(zhì)的燒基化處理。最后， 按蛋白質(zhì)/胰蛋白酶：25/1，加入40yg的胰蛋白酶(溶于50mM碳酸氫銨溶液，pH8.0)，37°C 酶解12小時。最后，加入10 μ 1甲酸酸化，終止酶解。
[0030] 2.含長烷基鏈的離子液體的去除：將強(qiáng)陽離子交換材料（日本東曹達(dá)，TSK-GEL SP-5PW，10 μ m，1000 Α)填裝于拋光不銹鋼捕集柱柱管內(nèi)（內(nèi)徑4. 6cm，長lcm)。向摩爾濃 度為lmg/mL BSA的酶解產(chǎn)物（100 μ L，溶于4%C12Im-Cl的50mM ABC)加入400 μ LlmM三羥 甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖鹽溶液（Tris-HCl，pH9. 5)。隨后，將上述0. 2mg/mL BSA的酶解產(chǎn) 物用ImM Tris-HCl，pH9. 5作為載流液，以lmL/min的流速，用泵推動，通過強(qiáng)陽離子交換捕 集柱，收集流出液，即為去除離子液體后的溶液。
[0031] 3. MALDI-T0F分析：將收集的去除離子液體后的BSA酶解產(chǎn)物溶液凍干后，重溶 于500 μ L0. 1% (體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸水溶液，即0. 2mg/mL BSA酶解產(chǎn)物。以2-氰基-4-羥 基肉桂酸（7mg/mL，溶于含0. 1% (體積分?jǐn)?shù)）三氟乙酸的60%乙腈水溶液）為基質(zhì)，按體積 比1:1混合，點(diǎn)樣2 μ L，自然風(fēng)干后，MALDI-T0F檢測。質(zhì)譜圖見圖1(A)，鑒定結(jié)果見表1。
[0032] 實(shí)施例2
[0033] 1.牛血清白蛋白（BSA)樣品預(yù)處理：將摩爾濃度為Img BSA溶解于lmL4% (4g/100mL)的氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑（C12Im-Cl)的50mM碳酸氫銨溶液（ABC)中， 90°C下熱變性IOmin后，加入IOmM二硫蘇糖醇（DTT)溶液，56 °C下反應(yīng)60min進(jìn)行蛋白質(zhì) 的還原處理后，通入30mM碘乙酰胺（IAA)溶液，室溫下避光反應(yīng)30min后進(jìn)行蛋白質(zhì)的烷 基化處理。最后，按蛋白質(zhì)/胰蛋白酶：25/1加入，40μ g的胰蛋白酶(溶于50mM碳酸氫銨 溶液，pH8. 0)，37°C酶解12小時。最后，加入10μ 1甲酸酸化，終止酶解。
[0034] 2.含長烷基鏈的離子液體的去除：向lmg/mL BSA的酶解產(chǎn)物（lOOyL，溶于 4%C12Im-Cl的50mM ABC)加入400yLlmM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖鹽溶液（Tris-HCl， pH9. 5)。隨后，向上述溶液中加入2mg強(qiáng)陽離子交換材料（日本東曹達(dá)，TSK-GEL SP-5PW， 10 μ m，1000 A )，震蕩3min后，HOOOg離心5min。取上清，即為去除離子液體后的溶液。
[0035] 3. MALDI-T0F分析：將收集的去除離子液體后的BSA酶解產(chǎn)物溶液凍干后，重溶于 500 μ L0. 1% (體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸水溶液，即0. 2mg/mL BSA酶解產(chǎn)物。以2-氰基-4-羥基 肉桂酸（7mg/mL，溶于含0. 1% (體積分?jǐn)?shù)）三氟乙酸的60%乙腈水溶液）為基質(zhì)，按體積比 1:1混合，點(diǎn)樣2 μ L，自然風(fēng)干后，MALDI-T0F檢測。質(zhì)譜圖見圖I (B)，鑒定結(jié)果見表1。
[0036] 對照組1
[0037] 用不含長烷基鏈的離子液體的溶劑溶解BSA，進(jìn)行樣品預(yù)處理：將Img BSA溶解于 lmL50mM碳酸氫銨溶液（ABC)中，90°C下熱變性IOmin后，加入IOmM二硫蘇糖醇（DTT)溶液， 56°C下反應(yīng)60min進(jìn)行蛋白質(zhì)的還原處理后，通入30mM碘乙酰胺（IAA)溶液，室溫下避光反 應(yīng)30min后進(jìn)行蛋白質(zhì)的燒基化處理。最后，按蛋白質(zhì)/膜蛋白酶：25/1，加入40 μ g的膜 蛋白酶(溶于50mM碳酸氫銨溶液，pH8.0)，37°C酶解12小時。最后，加入10μ 1甲酸酸化， 終止酶解。將BSA酶解產(chǎn)物稀釋至0. 2mg/mL，以2-氰基-4-羥基肉桂酸（7mg/mL，溶于含 0. 1% (體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸的60%乙腈水溶液）為基質(zhì)，按體積比1:1混合，點(diǎn)樣2 μ L，自然 風(fēng)干后，MALDI-T0F檢測。質(zhì)譜圖見圖I (C)，鑒定結(jié)果見表1。
[0038] 對照組2
[0039] 用含長烷基鏈離子液體的BSA酶解產(chǎn)物溶液為對照組：將Img BSA溶解于lmL4% (4g/100mL)的氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑（C12Im-Cl)的50mM碳酸氫銨溶液（ABC)中， 90°C下熱變性IOmin后，加入IOmM二硫蘇糖醇（DTT)溶液，56°C下反應(yīng)60min進(jìn)行蛋白質(zhì)的 還原處理后，通入30mM碘乙酰胺（IAA)溶液，室溫下避光反應(yīng)30min后進(jìn)行蛋白質(zhì)的烷基 化處理。最后，按蛋白質(zhì)/胰蛋白酶：25/1，加入40μ g的胰蛋白酶(溶于50mM碳酸氫銨溶 液，pH8.0)，37°C酶解12小時。最后，加入10 μ 1甲酸酸化，終止酶解。將BSA酶解產(chǎn)物稀 釋至0. 2mg/mL，以2-氰基-4-輕基肉桂酸（7mg/mL,溶于含0. 1% (體積分?jǐn)?shù)）三氟乙酸的 60%乙腈水溶液）為基質(zhì)，按體積比1:1混合，點(diǎn)樣2 μ L，自然風(fēng)干后，MALDI-T0F檢測。質(zhì) 譜圖見圖I (D)，鑒定結(jié)果見表1。
[0040] 表I. BSA酶解產(chǎn)物的鑒定結(jié)果
[0041]

【權(quán)利要求】
1. 溶液樣品中含長烷基鏈的離子液體的去除方法，其特征在于：將含有長烷基鏈的離 子液體的樣品溶液用堿性溶液調(diào)至pH > 8的堿性環(huán)境；然后采用陽離子交換材料作為吸附 齊U，去除含長烷基鏈的離子液體，最后將吸附劑和溶液分離，收集溶液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的去除方法，其特征在于：含長烷基鏈的離子液體可為：陽離 子部分為烷基鏈部分，為含6個碳或7個以上碳的咪唑類、吡啶類、季銨類、或季鱗類陽離 子；陰離子部分為 C1'Γ、N03'C104'AlClp BF4'PF4'CF3COO'CF3S0 3' (CF3S02) 2仄或 SbF6'
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的去除方法，其特征在于：將含有長烷基鏈的離子液體的樣品 溶液用堿性溶液調(diào)至pH為8-14的堿性環(huán)境。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的去除方法，其特征在于：含有長烷基鏈的離子液體的樣品溶 液可為：細(xì)胞提取液、胞漿提取液、血漿提取液、蛋白質(zhì)溶液、多肽溶液、脂質(zhì)物溶液或呈電 負(fù)性的聚合物溶液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的去除方法，其特征在于：調(diào)節(jié)pH至堿性環(huán)境所采用的堿性溶 液為pH為9-14的碳酸氫銨緩沖鹽溶液、pH為9-14的磷酸緩沖鹽溶液、pH為9-14的三羥 甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液、氨水、碳酸鈉溶液、或氫氧化鈉溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的去除方法，其特征在于：陽離子交換材料為含有磺酸基團(tuán)和/ 或磷酸基團(tuán)的硅膠或聚合物基質(zhì)材料(聚丙烯酸酯類基質(zhì)、聚苯乙烯類基質(zhì)、聚丙烯酰胺類 基質(zhì)）；材料可以是顆粒材料或者整體材料。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的去除方法，其特征在于：將吸附劑和樣品溶液接觸和分離的 方式可以為： 將吸附劑固載于固相載體上或填充于中空容器中，將含有離子液體的樣品溶液通過固 相載體或中空容器，并與吸附劑接觸后，直接收集； 或?qū)⑽絼┖蜆悠啡芤夯旌辖佑|后，將吸附劑通過離心沉淀的方式，與含有離子液體 的溶液分離； 或?qū)⑽絼┌诖判灶w粒上，將吸附劑和樣品溶液混合接觸后，通過磁力作用，與含 有離子液體的樣品溶液分離。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的去除方法，其特征在于： 固相載體為：表面積為lcm2-10m2,形狀為長方體、正方體、圓錐體或圓柱體中一種或二 種以上，材質(zhì)為聚合物材料，具體為硅膠、纖維素膜、聚醚砜膜、樹脂、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝 膠和磁性復(fù)合材料。 中空容器為：內(nèi)部空腔徑向橫截面直徑為50 μ m-5cm的不銹鋼管、20-1000 μ 1移液器 槍頭、l-200ml固相萃?。⊿PE)管、l-200ml注射器針管、50-500 μ m內(nèi)徑毛細(xì)管或注射器濾 膜腔體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的去除方法，其特征在于：所述樣品溶液為蛋白質(zhì)樣品、脂質(zhì)體 樣品及高分子樣品中一種或二種以上混合，該方法可用于蛋白質(zhì)樣品、脂質(zhì)體樣品及高分 子樣品的分析中。
【文檔編號】G01N1/34GK104236983SQ201310237458
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月14日
【發(fā)明者】張麗華, 趙群, 楊開廣, 方菲, 張玉奎 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所