一種氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)雙光子熒光探針的制備及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)，其制備方法及其作為雙光子熒光探針在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用。本發(fā)明的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)制備方法簡便；用于活細(xì)胞的雙光子熒光成像效果好，在較寬的pH值范圍內(nèi)具有非常強(qiáng)的雙光子熒光，雙光子吸收截面可達(dá)48,000GM；極易溶于水，無毒性，光穩(wěn)定性好；溶液具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性，可以在24個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種雙光子熒光探針的制備方法及其應(yīng)用，具體地說是一種氮摻雜石 墨烯量子點(diǎn)雙光子熒光探針的制備方法及其在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用。 一種氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)雙光子熒光探針的制備及其應(yīng)用

【背景技術(shù)】
[0002] 雙光子熒光顯微成像兼具諸如近紅外激發(fā)、激發(fā)光對(duì)生物組織的較深穿透能力、 光毒性低、生物體自發(fā)背景熒光弱等特點(diǎn)而顯著地優(yōu)于傳統(tǒng)的單光子熒光顯微成像，是生 命科學(xué)研究領(lǐng)域中最為重要而有力的工具之一。激光掃描共聚焦雙光子熒光顯微鏡的出現(xiàn) 促進(jìn)了雙光子熒光顯微成像技術(shù)的發(fā)展，在活體生物組織成像領(lǐng)域展示出了極好的應(yīng)用前 景，受到人們?cè)絹碓蕉嗟闹匾暋榱颂岣叱上裥Ч驮谏锝M織中的成像深度，使激光掃描 共聚焦雙光子顯微鏡得到最廣范圍的應(yīng)用，開發(fā)高效的雙光子熒光探針十分必要。
[0003] -直以來，研究較多的雙光子熒光材料包括半導(dǎo)體量子點(diǎn)如硒化鎘、有機(jī)分子等 等。但是半導(dǎo)體量子點(diǎn)中重金屬的潛在毒性和有機(jī)分子的光漂白性限制了它們作為雙光子 熒光探針在生物成像領(lǐng)域中的進(jìn)一步應(yīng)用，尤其是對(duì)深層生物組織的成像和生物體生命活 動(dòng)的長期實(shí)時(shí)監(jiān)測。
[0004] 近年來，熒光碳納米材料(包括碳點(diǎn)、剛剛興起的石墨烯量子點(diǎn)等）具有良好的生 物相溶性和光穩(wěn)定性，受到了研究者的廣泛關(guān)注。Sun等報(bào)道了經(jīng)聚乙二醇表面修飾的碳點(diǎn) 具有較大的雙光子吸收截面，可用于癌細(xì)胞的雙光子成像，但是所報(bào)導(dǎo)的碳點(diǎn)需要在極端 條件如激光消融剝離下制備并且產(chǎn)率比較低。
[0005] 石墨烯量子點(diǎn)（<10nm)由于其顯著的量子尺寸效應(yīng)和邊緣效應(yīng)，具有很強(qiáng)的熒光， 根據(jù)理論研究，預(yù)測石墨烯量子點(diǎn)的特殊結(jié)構(gòu)使其具有較強(qiáng)的雙光子吸收，可作為高效的 雙光子熒光探針用于生物成像。但是石墨烯量子點(diǎn)的雙光子熒光性質(zhì)和石墨烯量子點(diǎn)作為 雙光子熒光探針用于生物成像還未有研究報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 除非特別指出，本文所述的量子點(diǎn)是指準(zhǔn)零維（quasi-zero-dimensional)的納 米材料，尺寸小于或者接近激子波爾半徑(一般直徑不超過l〇nm)，由少量的原子所構(gòu)成，量 子局限效應(yīng)（quantum confinement effect)特別顯著。
[0007] 除非特別指出，本文所述的石墨烯量子點(diǎn)為尺寸小于10nm的單層石墨烯，具有石 墨烯（110)面上的晶格，并修飾有部分含氧官能團(tuán)。
[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)，其制備方法以及其在制備雙光 子熒光探針產(chǎn)品中的用途，以及提供其在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用。
[0009] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)，所述氮摻雜石墨烯量子 點(diǎn)是包含連接于碳原子的羥基，羧基和烷胺基的石墨烯納米片層；所述氮摻雜石墨烯量子 點(diǎn)的平均直徑為1. 5?5nm，平均厚度為0. 5?lnm，并且所述的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)包含 的C、0、N三種元素的摩爾百分比分別為75?85%、24?12%和1?3%。
[0010] 在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，所述的烷胺基為-NR2，且R為-CH3或-C 2H5。
[0011] 在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，所述的所述氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的平均直徑為3nm。
[0012] 在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，所述的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)包含有C、0、N三種元素， 其摩爾百分比分別為81. 48%、16. 24%和2. 28%。
[0013] 在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，所述的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)具有如圖2所示的X射線 光電子能譜圖和/或圖3所示的紅外吸收光譜。
[0014] 在本發(fā)明另一個(gè)方面，提供了制備前文所述的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的方法，其特 征在于：該方法以石墨片為起始原料，以及該方法包括步驟：氧化、超聲剝離、溶劑熱氮摻 雜及純化。
[0015] 在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，所述的氧化步驟包括用濃硫酸、K2S20 8和P205處理石墨 片，反應(yīng)后產(chǎn)物用水稀釋，過濾，洗滌，然后干燥，得到氧化石墨烯。
[0016] 在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，所述的超聲剝離步驟包括將經(jīng)洗滌和干燥的氧化石墨 烯加入到酰胺類有機(jī)溶劑中并超聲處理20?50分鐘，氧化石墨烯的濃度為1?6mg/mL ; 優(yōu)選地，所述的酰胺類溶劑是N，N-二甲基甲酰胺或N，N-二乙基甲酰胺；和/或優(yōu)選地，超 聲處理30分鐘，以及氧化石墨烯的濃度為3. 33mg/mL。
[0017] 在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，所述的溶劑熱氮摻雜是以酰胺類溶劑作為氮源，將石 墨片經(jīng)氧化和超聲剝離得到的氧化石墨烯在155?220°C下進(jìn)行溶劑熱處理4-8小時(shí)；優(yōu) 選地，在160?200°C下進(jìn)行溶劑熱處理4-6小時(shí)，例如在200〇C下進(jìn)行溶劑熱反應(yīng)4. 5小 時(shí)；和/或優(yōu)選地，所述的酰胺類溶劑是N，N-二甲基甲酰胺或N，N-二乙基甲酰胺。
[0018] 在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，所述的純化步驟包括經(jīng)微孔濾膜過濾和干燥的步驟； 優(yōu)選地，所述微孔濾膜的孔徑為0. 2?0. 45微米；更優(yōu)選地，所述微孔濾膜的孔徑為0. 22 微米。
[0019] 在本發(fā)明另一個(gè)方面，提供了前文所述的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)在活細(xì)胞雙光子成 像中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述的活細(xì)胞為Hela細(xì)胞。
[0020] 在本發(fā)明另一個(gè)方面，提供了 一種活細(xì)胞熒光成像的方法，其包括步驟：1)將活細(xì) 胞與包含前文所述的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)2-12小時(shí)，且氮摻雜石墨烯 量子點(diǎn)的濃度為80-120 μ g氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)/lml培養(yǎng)基；2)在雙光子顯微鏡下對(duì)培 養(yǎng)得到的細(xì)胞進(jìn)行觀測；優(yōu)選地，在觀測中的激發(fā)波長為800nm ;和/或優(yōu)選地，所述的活細(xì) 胞為Hela細(xì)胞；和/或優(yōu)選地，氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的濃度為100 μ g氮摻雜石墨烯量子點(diǎn) /lml培養(yǎng)基。
[0021] 與此同時(shí)，本申請(qǐng)還提供了如下的技術(shù)方案：所述氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)是包含一 定數(shù)量的連接于碳原子的羥基、羧基和烷基氨基團(tuán)（_NR 2)的石墨烯納米片層，其中R基團(tuán) 為-CH3或-C2H5 ;并且所述氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)平均直徑為3nm，平均厚度為0· 5?lnm，包 含有C、0、N三種元素，其摩爾百分比分別為81. 48%，16. 24%，2. 28%。
[0022] 在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，所述的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)具有如圖2所示的X射線 光電子能譜圖和圖3所示的紅外吸收光譜。
[0023] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，以石墨片（購自alfa aser，325目）為原料，酰胺類溶劑 為氮源，提供了制備上述氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的方法，其包括步驟氧化、超聲剝離以及溶劑 熱處理摻雜氮，與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別是所述溶劑熱處理摻雜氮是指經(jīng)氧化、剝離得到的氧化 石墨烯以酰胺類溶劑作氮源及溶劑經(jīng)200°C加熱處理時(shí)，酰胺類溶劑在高于沸點(diǎn)溫度時(shí)分 解為烷基胺，而分解得到的烷基胺與氧化石墨烯量子點(diǎn)表面的環(huán)氧基團(tuán)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)生成 1，2-氨基醇，氮原子得以摻雜到石墨烯量子點(diǎn)中，得到氮摻雜的石墨烯量子點(diǎn)。
[0024] 具體操作步驟如下：
[0025] 1)用濃硫酸、K2S208、P 205預(yù)處理石墨片，反應(yīng)后產(chǎn)物用水稀釋，過濾，洗漆，然后 放入真空烘箱干燥。將經(jīng)洗滌和干燥的氧化石墨烯加入到酰胺類有機(jī)溶劑中并超聲處理 20?50分鐘，氧化石墨烯的濃度為1?6mg/mL ;優(yōu)選地超聲處理30分鐘以及氧化石墨烯 的濃度為3. 33mg/mL ;2)將步驟1)中得到的分散液在155-220° C下進(jìn)行溶劑熱反應(yīng)4-8 小時(shí)；優(yōu)選地步驟1)中得到的分散液在200° C下進(jìn)行溶劑熱反應(yīng)4. 5小時(shí)；3)將步驟2) 中得到的反應(yīng)液使用微孔濾膜過濾，并旋蒸除去溶劑。
[0026] 在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，在步驟1)中所述的酰胺類溶劑為N，N_二甲基甲酰胺 或N，N-二乙基甲酰胺。
[0027] 在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，在步驟3)中的濾膜的孔徑為0. 2?0. 45微米；優(yōu)選 地，該孔徑為0.22微米。
[0028] 在本發(fā)明另一個(gè)方面，提供了上述氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)作為雙光子熒光探針進(jìn)行 活細(xì)胞雙光子成像的應(yīng)用。其包括步驟：1)將前文所述的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)按照10? 400 μ g/ml培養(yǎng)基的量加入到細(xì)胞的培養(yǎng)物中，優(yōu)選地所述的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)按照 50 μ g/ml培養(yǎng)基的量加入到細(xì)胞的培養(yǎng)物中；2)將上述細(xì)胞培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)1?24小時(shí)， 優(yōu)選地繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)；3)將所得到的細(xì)胞培養(yǎng)物在800nm的激發(fā)波長下進(jìn)行雙光子成像。
[0029] 其中所述活細(xì)胞為Hela細(xì)胞。
[0030] 試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，所述氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)雙光子熒光探針可用于活細(xì)胞成像，熒 光顯微圖像說明氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)主要分布在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上。所述氮摻雜石墨烯量 子點(diǎn)在較寬的pH值范圍內(nèi)具有非常強(qiáng)的雙光子熒光，雙光子吸收截面可達(dá)48, 000GM，且極 易溶于水，無毒性，光穩(wěn)定性好，預(yù)示著該氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)在雙光子生物成像領(lǐng)域有廣 泛的應(yīng)用。
[0031] 本發(fā)明的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)具有以下的優(yōu)點(diǎn)：
[0032] 1)制備方法簡便；
[0033] 2)本發(fā)明所述的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)由于邊緣存在羧基和羥基，極易溶于水，且 在水中可穩(wěn)定存在至少長達(dá)24個(gè)月，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的水溶液未出 現(xiàn)任何沉淀；
[0034] 3)本發(fā)明所述氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)具有非常大的雙光子吸收截面，可達(dá) 48, 000GM，且在較寬的pH值范圍內(nèi)均有較強(qiáng)的熒光，可應(yīng)用于不同酸堿性的生理環(huán)境的雙 光子突光探針
[0035] 4)本發(fā)明所述氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)CCK-8方法測試未發(fā)現(xiàn)有毒性，可進(jìn)入細(xì)胞， 對(duì)活細(xì)胞的進(jìn)行雙光子成像；

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：
[0037] 圖1.顯示了按照實(shí)施例2的方法所制備的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的原子力掃描電 鏡圖像（a)、透射電子顯微鏡圖像（b)及其尺寸分布圖像（c)。
[0038] 圖2.是按照實(shí)施例2的方法所制備的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的X射線光電子能譜 圖，表明了其元素組成。
[0039] 圖3.顯示了按照實(shí)施例4的方法所制備的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的雙光子激發(fā)熒 光圖譜和其在不同pH中的熒光強(qiáng)度變化。
[0040] 圖4. a)是按照實(shí)施例2的方法所制備的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)作為雙光子熒光探 針對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行雙光子成像的熒光照片（實(shí)施例5) ;b)是氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)對(duì)Hela 細(xì)胞的毒性測試結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0041] 實(shí)施例1
[0042] 氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的制備
[0043] 本發(fā)明所使用的粉末狀石墨片購自al fa aser，325目。
[0044] 將15ml濃硫酸加熱到90°C，加入2. 5g K2S208、2. 5g P205，和3g粉末狀石墨片反 應(yīng)4. 5小時(shí)。反應(yīng)后產(chǎn)物加入500ml去離子水稀釋，過濾、洗滌，然后放入真空干燥箱。將 120ml濃硫酸加入到干燥后的預(yù)處理氧化石墨中，攪拌均勻，于0°C冰浴中，緩慢加入15g 高錳酸鉀，待體系穩(wěn)定之后撤掉冰浴，改為水浴，于35°C攪拌2h。然后改為冰浴，緩慢加入 1000ml水進(jìn)行稀釋，溶液變?yōu)樽虾谏?，常溫?cái)嚢?h后，用玻璃滴管滴入20ml30%的H 202，所 得產(chǎn)物離心去掉上清液后用10%HC1洗滌至完全除去硫酸根，再用去離子水洗至中性，最后 得到的固體放入真空烘箱中進(jìn)行干燥。
[0045] 取100mg干燥后的氧化石墨烯加入30ml N，N-二甲基甲酰胺，經(jīng)20min超聲剝離 后，轉(zhuǎn)入到聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，于160°C下反應(yīng)4. 5小時(shí)后，自然冷卻至室溫。將上述過程 中所得到的反應(yīng)產(chǎn)物用〇. 22微米濾膜過濾除去黑色沉淀，得到淡黃棕色氮摻雜石墨烯量 子點(diǎn)溶液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑和游離的N，N-二甲基甲酰胺分解產(chǎn)物(二甲胺）后，得到氮 摻雜石墨烯量子點(diǎn)固體。氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)通過原子力掃描電鏡、X射線光電子能譜、雙 光子激發(fā)突光和透射電子顯微鏡表征確認(rèn)。
[0046] 經(jīng)表征，所述氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的平均直徑為2. 5nm，平均厚度為0. 9nm，C、0、N 三種元素的摩爾百分比分別為85%、13%和2%。
[0047] 實(shí)施例2
[0048] 氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的制備
[0049] 將15ml濃硫酸加熱到90°C，加入2. 5g K2S208、2. 5g P205，和3g粉末狀石墨片反 應(yīng)4. 5小時(shí)。反應(yīng)后產(chǎn)物加入500ml去離子水稀釋，過濾、洗滌，然后放入真空干燥箱。將 120ml濃硫酸加入到干燥后的預(yù)處理氧化石墨中，攪拌均勻，于0°C冰浴中，緩慢加入15g 高錳酸鉀，待體系穩(wěn)定之后撤掉冰浴，改為水浴，于35°C攪拌2h。然后改為冰浴，緩慢加入 1000ml水進(jìn)行稀釋，溶液變?yōu)樽虾谏?，常溫?cái)嚢?h后，用玻璃滴管滴入20ml30%的H 202，所 得產(chǎn)物離心去掉上清液后用10%HC1洗滌至完全除去硫酸根，再用去離子水洗至中性，最后 得到的固體放入真空烘箱中進(jìn)行干燥。
[0050] 取lOOmg干燥后的氧化石墨烯加入30ml N，N-二甲基甲酰胺，經(jīng)30min超聲剝離 后，轉(zhuǎn)入到聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，于180°C下反應(yīng)4. 5小時(shí)后，自然冷卻至室溫。將上述過程 中所得到的反應(yīng)產(chǎn)物用0. 22微米濾膜過濾除去黑色沉淀，得到淡黃棕色氮摻雜石墨烯量 子點(diǎn)溶液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑和游離的N，N-二甲基甲酰胺分解產(chǎn)物(二甲胺）后，得到氮 摻雜石墨烯量子點(diǎn)固體。氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)通過原子力掃描電鏡、X射線光電子能譜、雙 光子激發(fā)突光和透射電子顯微鏡表征確認(rèn)。
[0051] 經(jīng)表征，所述氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的平均直徑為3nm，平均厚度為0. 7nm，C、0、N三 種元素的摩爾百分比分別為81. 48%、16. 24%和2. 28%。
[0052] 實(shí)施例3
[0053] 氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的制備
[0054] 將15ml濃硫酸加熱到90°C，加入2. 5g K2S208、2. 5g P205，和3g粉末狀石墨片反 應(yīng)4. 5小時(shí)。反應(yīng)后產(chǎn)物加入500ml去離子水稀釋，過濾、洗滌，然后放入真空干燥箱。將 120ml濃硫酸加入到干燥后的預(yù)處理氧化石墨中，攪拌均勻，于0°C冰浴中，緩慢加入15g 高錳酸鉀，待體系穩(wěn)定之后撤掉冰浴，改為水浴，于35°C攪拌2h。然后改為冰浴，緩慢加入 1000ml水進(jìn)行稀釋，溶液變?yōu)樽虾谏?，常溫?cái)嚢?h后，用玻璃滴管滴入20ml30%的H 202，所 得產(chǎn)物離心去掉上清液后用10%HC1洗滌至完全除去硫酸根，再用去離子水洗至中性，最后 得到的固體放入真空烘箱中進(jìn)行干燥。
[0055] 取100mg干燥后的氧化石墨烯加入30ml N，N-二乙基甲酰胺，經(jīng)50min超聲剝離 后，轉(zhuǎn)入到聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，于200°C下反應(yīng)6小時(shí)后，自然冷卻至室溫。將上述過程中 所得到的反應(yīng)產(chǎn)物用〇. 22微米濾膜過濾除去黑色沉淀，得到淡黃棕色氮摻雜石墨烯量子 點(diǎn)溶液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑和游離的N，N-二乙基甲酰胺分解產(chǎn)物后，得到氮摻雜石墨烯 量子點(diǎn)固體。氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)通過原子力掃描電鏡、X射線光電子能譜、雙光子激發(fā)熒 光和透射電子顯微鏡表征確認(rèn)。
[0056] 經(jīng)表征，所述氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的平均直徑為3. 5nm，平均厚度為1. Onm，C、0、N 三種元素的摩爾百分比分別為87%、10. 5%和2. 5%。
[0057] 實(shí)施例4
[0058] 氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)在不同pH下的熒光強(qiáng)度分析
[0059] 加入不同量的氨水或鹽酸調(diào)節(jié)氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)水溶液的pH值至1?13,然后 分別取不同pH值的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)水溶液3ml在熒光光譜儀（LS55-熒光/磷光/發(fā) 光分光光度計(jì)）上測試熒光強(qiáng)度。
[0060] 實(shí)施例5
[0061] Hela細(xì)胞的雙光子細(xì)胞成像
[0062] 在本申請(qǐng)的實(shí)施例中，除非另外地說明，Hela細(xì)胞由國家納米科學(xué)中心生物效應(yīng) 安全實(shí)驗(yàn)室提供。
[0063] 本實(shí)施例中所使用的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)是按照實(shí)施例2的方法所制備的氮摻 雜石墨烯量子點(diǎn)。
[0064] Hela細(xì)胞接種密度為5X105個(gè)/皿，所選細(xì)胞培養(yǎng)液為HDMEM (購自Hyclone)， 在37°C、C02培養(yǎng)箱孵育12小時(shí)后，培養(yǎng)液更換為含有氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的HDMEM培養(yǎng) 液（50 μ g氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)/lml培養(yǎng)基)在同樣的條件下再培育2小時(shí)后，將細(xì)胞置于 激光掃描共聚焦雙光子顯微鏡(尼康，AIR Multiphoton Microscope)進(jìn)行雙光子成像，激 發(fā)波長為800nm時(shí)，所得Hela細(xì)胞的熒光圖像如圖4所示，氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)主要分布 在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，表明氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)作為雙光子熒光探針成功應(yīng)用于活體生物 成像。
[0065] 實(shí)施例6
[0066] Hela細(xì)胞的雙光子細(xì)胞成像
[0067] 本實(shí)施例中所使用的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)是按照實(shí)施例…的方法所制備的氮摻 雜石墨烯量子點(diǎn)。
[0068] Hela細(xì)胞接種密度為5X105個(gè)/皿，所選細(xì)胞培養(yǎng)液為HDMEM (購自Hyclone)， 在37°C、C02培養(yǎng)箱孵育12小時(shí)后，培養(yǎng)液更換為含有氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的HDMEM培養(yǎng) 液（100 μ g氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)/lml培養(yǎng)基)在同樣的條件下再培育12小時(shí)后，將細(xì)胞置 于激光掃描共聚焦雙光子顯微鏡(尼康，AIR Multiphoton Microscope)進(jìn)行雙光子成像， 激發(fā)波長為800nm時(shí)，可以清楚觀察到細(xì)胞的熒光圖像，表明氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)作為雙 光子熒光探針成功應(yīng)用于活體生物成像。具體圖像未給出。
【權(quán)利要求】
1. 一種氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)，其特征在于： 所述氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)是包含連接于碳原子的羥基，羧基和烷胺基的石墨烯納米片 層；所述氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的平均直徑為1. 5?5nm，平均厚度為0. 5?lnm，并且所述的 氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)包含的C、0、N三種元素的摩爾百分比分別為75?85%、24?12%和 1 ?3% ; 優(yōu)選地，所述的烷胺基為_NR2，且R為-CH3或-C2H5 ; 優(yōu)選地，所述的所述氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的平均直徑為3nm。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)，其特征在于，所述的氮摻雜石墨烯量 子點(diǎn)包含有C、0、N三種元素，其摩爾百分比分別為81. 48%、16. 24%和2. 28%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)，其特征在于，所述的氮摻雜石墨烯 量子點(diǎn)具有如圖2所示的X射線光電子能譜圖和/或圖3所示的紅外吸收光譜。
4. 一種制備權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的方法，其特征在于： 該方法以石墨片為起始原料，以及該方法包括步驟：氧化、超聲剝離、溶劑熱氮摻雜及純化。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的氧化步驟包括用濃硫酸、K2S208和 P2〇5處理石墨片，反應(yīng)后產(chǎn)物用水稀釋，過濾，洗滌，然后干燥，得到氧化石墨烯。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的超聲剝離步驟包括將經(jīng)洗滌和干 燥的氧化石墨烯加入到酰胺類有機(jī)溶劑中并超聲處理20?50分鐘，氧化石墨烯的濃度為 1 ?6mg/mL ; 優(yōu)選地，所述的酰胺類溶劑是N，N-二甲基甲酰胺或N，N-二乙基甲酰胺；和/或優(yōu)選 地，超聲處理30分鐘，以及氧化石墨烯的濃度為3. 33mg/mL。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的溶劑熱氮摻雜是以酰胺類溶劑作 為氮源，將石墨片經(jīng)氧化和超聲剝離得到的氧化石墨烯在155?220°C下進(jìn)行溶劑熱處理 4-8小時(shí)； 優(yōu)選地，在160?200°C下進(jìn)行溶劑熱處理4-6小時(shí)，例如在200〇C下進(jìn)行溶劑熱反應(yīng) 4. 5小時(shí)； 優(yōu)選地，所述的酰胺類溶劑是N，N-二甲基甲酰胺或N，N-二乙基甲酰胺。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的純化步驟包括經(jīng)微孔濾膜過濾和 干燥的步驟； 優(yōu)選地，所述微孔濾膜的孔徑為0. 2?0. 45微米； 更優(yōu)選地，所述微孔濾膜的孔徑為0. 22微米。
9. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)在活細(xì)胞雙光子成像中的應(yīng)用； 優(yōu)選地，所述的活細(xì)胞為Hela細(xì)胞。
10. -種活細(xì)胞的熒光成像方法，其包括步驟： 1) 將活細(xì)胞與包含權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的培養(yǎng)基共同培 養(yǎng)2-12小時(shí)，且氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的濃度為80-120 μ g氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)/lml培養(yǎng) 基； 2) 在雙光子顯微鏡下對(duì)培養(yǎng)得到的細(xì)胞進(jìn)行觀測； 優(yōu)選地，在觀測中的激發(fā)波長為800nm ;和/或 優(yōu)選地，所述的活細(xì)胞為Hela細(xì)胞；和/或 優(yōu)選地，氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的濃度為100 μ g氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)/lml培養(yǎng)基。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104109534SQ201310136213
【公開日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2013年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月18日
【發(fā)明者】宮建茹, 劉倩 申請(qǐng)人:國家納米科學(xué)中心